CN101280311B - 甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列 - Google Patents

甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列 Download PDF

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本发明公开了一种甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列，是以近源物种蔗糖转运蛋白基因的CDS序列的保守区设计简并引物，从甘蔗成熟茎节提取总RNA，用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘蔗蔗糖转运蛋白(ShSUT4)基因的全表达序列。本发明不仅为研究甘蔗蔗糖转运蛋白在蔗糖运输中的作用，进一步探讨蔗糖的积累机理奠定基础，而且通过氨基酸序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究蔗糖转运蛋白的结构与功能提供基础。

Description

甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列
技术领域
本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列。
背景技术
甘蔗是一种重要的糖料作物，同时也是一种高光效的C4植物，其成熟茎节中积累高浓度蔗糖的机制已经成为了研究的热点。蔗糖是甘蔗从源到库转运过程中的主要形式，蔗糖的转运一是通过共质体途径，即通过胞间连丝在细胞间进行转运；二是通过质外体途径，即穿过细胞壁和组织间的细胞间隙进行转运。转运方式的不同主要取决于组织类型和发育时期。蔗糖在质外体和共质体间的转运需要质膜上的蔗糖转运蛋白介导。因此，分离克隆甘蔗中蔗糖转运蛋白基因ShSUT4，进一步鉴定转运蛋白的功能，可为阐明甘蔗蔗糖的运输和积累机制提供理论依据，另外还可为培育高蔗糖含量的甘蔗新品种提供理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因序列，是通过以近源物种蔗糖转运蛋白基因的CDS序列的保守区设计简并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因的全表达序列。其核苷酸如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
本发明的目的是通过以下技术措施实现：
1、总RNA的提取
取新鲜的粤糖93-159甘蔗成熟茎杆的7-9茎节，使用Trizol试剂，按照使用说明提取甘蔗总RNA。
2、cDNA第一链的合成
甘蔗总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录。
3、引物设计依据，引物合成的方法
从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻、大麦等)蔗糖转运蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计引物，扩增片段大小约为560bp。引物设计后交给上海生物工程生物公司合成。
引物序列为：
ShSUT4F：5’-TCAGGAAGCTTTCCTCT-3’
ShSUT4R：5’-CGCTGTGGTATGACAATAG-3’
4、ShSUT4基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用保守区序列设计引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经酶切检测后，将具有插入片段的质粒DNA交给上海生物工程生物公司进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3’和5’末端进行PCR扩增。
在3’RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。
基因外侧引物：5’-CTACAGAGAACGACCCAAGGAG-3’
基因内侧引物：5’-ATGGCCCTGGAAACATACTTG-3’
接头引物：5’-GGCCACGCGACTAGTAC-3’
在5’RACE中，利用末端转移酶和dATP在cDNA末端加上poly(A)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodT进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和OligodT进行第二次PCR扩增。
基因外侧引物：5’-CAACAGAGGTGAATCCAAGGACGAC-3’
基因内侧引物：5’-GCTCTTGCACGGATGCTACAG-3’
Oligo-dG：5’-GGGGGGGGGGGGGGGH-3’
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，交给上海生物工程生物公司进行双向测序，测序所得序列再与保守区序列设计引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。
5、对甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因的测定
将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，以确定为甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4同源序列。比对结果：
Sequences producing significant alignments：
(Click headers to sort columns)
Figure S200810099821XD00041
本发明的优点：甘蔗(Saccharum officinarum L.)生长于热带和亚热带地区，是人类最早利用的C4光合途径的高光效植物。蔗糖是甘蔗光合作用的主要产物之一，也是甘蔗体内光合产物运输、分配及其储存主要形式。植株源器官中合成的蔗糖，除了少量被用于满足自身生长发育的需求外，大部分装载到韧皮部的筛管伴胞复合体(sieveelement companion cell complex，SECCC)中，经长距离运输而转运和分配到根、茎、嫩叶、花、种子等库器官。蔗糖在植株体中定向运输和分配的方式不仅调控植物的整个生长和发育进程(包括相关的生理过程、生化代谢途径和基因表达等)，同时，也决定了作物经济器官的产量和品质。在蔗糖从“源”到“库”的转运过程中，蔗糖载体蛋白(Sucrose Transporter，SUT)起至关重要的调节作用。因此该基因的获得，不仅有利于揭示甘蔗中蔗糖积累的机制，还可以为作物产量和品质的遗传改良提供参考。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
1、总RNA的提取
取0.1克新鲜甘蔗7-9节茎(从生长点向下数)，削成片状，于液氮中研磨成粉末；加入1mL Trizol(Gibco，Japan)，按照试剂盒使用说明提取总RNA。
2、cDNA第一链的合成
取甘蔗总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃ 60min，70℃ 15min，最后放入-80℃保存备用。
3、引物设计依据，引物合成的方法
从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻、大麦等)蔗糖转运蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计引物，扩增片段大小约为560bp。引物设计后交给上海生物工程生物公司合成。
引物序列为：
ShSUT4F：5’-TCAGGAAGCTTTCCTCT-3’
ShSUT4R：5’-CGCTGTGGTATGACAATAG-3’
4、甘蔗SUT4基因全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用保守引物进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物ShSUT4 F和ShSUT4 R各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为：1个循环，94℃变性3min；30个循环，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经酶切检测后，将具有插入片段的质粒DNA交上海生物工程生物公司进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3’和5’末端进行PCR扩增。
在3’RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物稀释50倍后，取1μL作为模板，利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。
反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L正反向引物各2μL，Taq酶1.2U，用PCR水将反应体系补充至50μL。
反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸7min；4℃保温。
基因外侧引物：5’-CTACAGAGAACGACCCAAGGAG-3’
基因内侧引物：5’-ATGGCCCTGGAAACATACTTG-3’
接头引物：5’-GGCCACGCGACTAGTAC-3’
在5’RACE中，利用末端转移酶和dATP在cDNA末端加上poly(A)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodT进行第一次PCR扩增，所得PCR产物取1μL作为模板，再利用内侧引物和OligodT进行第二次PCR扩增。反应体系及反应条件同3’RACE。
基因外侧引物：5’-CAACAGAGGTGAATCCAAGGACGAC-3’
基因内侧引物：5’-GCTCTTGCACGGATGCTACAG-3’
Oligo-dG：5’-GGGGGGGGGGGGGGGH-3’
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，交上海生物工程生物公司进行双向测序，测序所得序列再与保守区引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。
5、对甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因的测定
将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，以确定为甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4同源序列。比对结果：
Sequences producing significant alignments：
(Click headers to sort columns)
Figure S200810099821XD00081
                    序列表
Figure S200810099821XD00082
Figure S200810099821XD00111
Figure S200810099821XD00121
Figure S200810099821XD00131
Figure S200810099821XD00141

Claims (2)

1.一种甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列。
2.一种甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因，其特征在于：其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。
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