CN102775480A

CN102775480A - 一种来源于植物的蔗糖转运蛋白SbSUT5基因与应用

Info

Publication number: CN102775480A
Application number: CN2011101212418A
Authority: CN
Inventors: 李晓峰; 苏蔓; 刘公社; 陈双燕; 程丽琴; 齐冬梅
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2012-11-14

Abstract

本发明公开了一种来源于植物的蔗糖转运蛋白SbSUT5基因与应用。本发明提供的蛋白来源于甜高粱Sorghum bicolor(L.)Moench，是如下由序列1所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；SbSUT5及其编码基因对于培育糖分积累提高的甜高粱及其他植物新品种具有重要实用价值，特别是甜高粱有两个库，即籽粒库和茎杆库，区别于其它单子叶作物的单一库(如水稻的籽粒库，甘蔗的茎杆库)，在蔗糖转运方面更具代表性，可以作为蔗糖转运的模式植物来研究，将为我们认识和理解SUT的功能提供新的理论知识，从而人为地控制蔗糖在甜高粱不同库组织中的分配比例，为我们调控甜高粱碳水化合物代谢，最终提高甜高粱乙醇生产指数与经济效益提供新的途径。

Description

一种来源于植物的蔗糖转运蛋白SbSUT5基因与应用

技术领域

本发明涉及植物的蔗糖转运蛋白编码蛋白及应用，尤其是涉及一种源于甜高粱并与蔗糖转运相关的蔗糖转运蛋白家族的关键蛋白及其编码基因，及该基因在植物生长发育中的应用。

背景技术

甜高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)，又称芦粟或糖高粱，每公顷可产60吨富含糖分的茎杆。研究发现，蔗糖是甜高粱茎杆的主要成分，占55.0％。用于生物能源时，甜高粱每亩可产374升乙醇，与玉米籽粒每亩只能生产148升乙醇相比具有明显的优势。甜高粱的生物产量和蔗糖含量直接制约着甜高粱种植的经济效益，就生产乙醇来说，培育高产、高糖的甜高粱品种，成为当前育种工作的主要目标。

植物蔗糖转运蛋白(缩写为SUT或SUC，sucrose transporters)，是一类12次跨膜膜结合蛋白，广泛存在于高等植物的各种组织和器官中，在蔗糖的转运与分配上起关键作用。了解植物蔗糖转运蛋白调控的作用机理，揭示蔗糖转运蛋白与糖分积累的关系将为转基因研究中提高转基因植物外源基因的表达提供有益参考，并且揭示蔗糖转运机制对植物生长发育及糖分积累的调节功能，为提高作物产量与改良品质的基因工程研究提供有效的遗传学依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物蔗糖转运相关的蛋白。

本发明提供的蛋白是甜高粱的与生长和糖分积累相关的蔗糖转运蛋白，命名为SbSUT5，来源于甜高粱Sorghum bicolor(L.)Moench，是如下1)或2)：

1)由序列1所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物蔗糖转运相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表中序列1由534个氨基酸残基组成，自氨基末端第46位-第534位氨基酸残基为GPH_Sucrose super family的保守结构域，自氨基末端第37位-第534位氨基酸残基为MelB domain序列。

为了便于SbSUT5的纯化，可在由序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基端或羧基端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的SbSUT5可人工合成，亦可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的SbSUT5的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失编码一个或几个氨基酸残基的密码子，进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在该序列5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列获得。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述蛋白的编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第1-1605位所示的基因；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2的基因；

3)在严格条件下可与1)或2)限定的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列2由1618个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5’末端第1-1605位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列1的SbSUT5蛋白。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

含上述编码基因的转基因细胞系、重组载体以及重组菌株也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体或酵母表达载体构建含有SbSUT5基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体及可用于植物基因枪法转化的载体等，如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。所述酵母表达载体包括PDR196、pYES2等。

带有本发明的SbSUT5的植物表达载体可通过Ri质粒、Ti质粒、植物病毒载体、电导、直接DNA转化、显微注射、农杆菌介导等生物学方法转化到细胞或组织中。

使用SbSUT5基因构建重组表达载体时，可在其转录起始位点前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或和其它的植物启动子结合使用；另外，使用本发明所述的基因构建表达载体时，也可使用增强子，包括翻译增强子和转录增强子，这些增强子所增强区域可以是ATG起始阅读框或邻接区域起始阅读框等，但必须与编码序列的阅读框相同，以确保整个序列的正确翻译。所述翻译调控信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可来自转录起始区域或结构基因。

为了便于鉴定及筛选转基因细胞或组织，可以对所用表达载体进行加工，例如加入能表达可产生颜色变化的酶或者发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因)、抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物)或者抗化学试剂标记基因(抗除莠剂基因)等。

具体地讲，上述重组载体可以为在载体PDR196的多克隆位点间插入上述基因得到的重组表达载体。

扩增上述基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。

上述蛋白或上述基因在培育蔗糖转运蛋白功能缺失的酵母突变体株系的互补系中的应用也属于本发明的保护范围之内。

实验证明，在蔗糖为唯一碳源的MD培养基中，转入SbSUT5的转基因酵母菌株系的生长状态和阳性对照相同，转入空载体的对照则不能正常生长；说明SbSUT5能够编码有功能的SbSUT5蛋白，可互补蔗糖转运蛋白功能缺失的酵母突变体株系，使其正常生长。

SbSUT5及其编码基因在茎秆的髓部高度表达，可能对于培育糖分积累提高的甜高粱及其他植物新品种具有重要实用价值，特别是甜高粱有两个库，即籽粒库和茎杆库，区别于其它单子叶作物的单一库(如水稻的籽粒库，甘蔗的茎杆库)，在蔗糖转运方面更具代表性，可以作为蔗糖转运的模式植物来研究，将为我们认识和理解SUT的功能提供新的理论知识，从而人为地控制蔗糖在甜高粱不同库组织中的分配比例，为我们调控甜高粱碳水化合物代谢，最终提高甜高粱乙醇生产指数与经济效益提供新的途径。

附图说明

图1为甜高粱幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2为PCR扩增SbSUT5全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图3为SbSUT5的结构域示意图；

图4为SbSUT5的亲疏水预测；

图5为SbSUT5的二级结构预测；

图6为SbSUT5基因在各种组织的表达模式(半定量RT-PCR)；

图7为PDR196-SbSUT5的酶切图；

图8为蔗糖为唯一碳源的培养基中转基因和对照酵母株系的生长情况；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、甜高粱蔗糖转运蛋白基因SbSUT5全长cDNA序列的获得

一、甜高粱蔗糖转运蛋白基因SbSUT5序列的克隆

1、植物材料处理及总RNA的提取

以甜高粱雷伊(记载过的文献是：MaeKinnon C，Gunderson G，Nabors MW(1986).Plant regeneration by somatic embryogenesis from callus cultures of sweetsorghum.Plant Cell Rep.5：349-351，公众可从中国科学院植物研究所获得)幼苗为材料，提取总RNA，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2、甜高粱蔗糖转运蛋白序列的克隆

根据已公开的单子叶植物蔗糖转运蛋白SUT5的序列，搜索高粱基因组数据库，设计巢式(nest)引物，具体的引物序列如下：

S1 5’-ATGGACGGTGGTGACGGC-3’

S2 5’-GATCCACTCTCGGCTGGGCA-3’

S3 5’-GGCGATAGATAGATCAGTGGCC-3’

以上述步骤1提取甜高粱幼苗的总RNA为模板，用PrimeScript^TM 1st Strand cDNASynthesizedKit试剂盒(Takara公司)并参照试剂盒说明书，反转合成第一链eDNA。反应体系及反应条件如下：Oligo-dT(10pmol/μl)1.0μl，dNTP Mixture(10mmol/leach)1.0μl，Total RNA(≤1μg)1.0μl，RNase-free water7.0μl，65℃5min，然后加5×Buffer 4.0μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScript RTase(200U/μl)0.5μl，42℃45min，70℃15min，将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。

以获得的第一链cDNA为模板，引物S1：与引物S2配对进行第一轮PCR扩增；PCR反应体系为：cDNA模板、S1引物与S2各1μl，10×Buffer 2.5μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)2μl，Taq酶0.25μl，ddH₂O 12.25μl；反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃30s，52℃30s，72℃120s，共35个循环；最后72℃延伸10min。反应后PCR产物取1μl，加99μl ddH₂O稀释到100倍，以其为模板进行第二轮PCR，引物S1：与引物S3配对进行PCR扩增；PCR反应体系为：上述模板、S1引物与S3各1μl，10×Buffer 2.5μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)2μl，Taq酶0.25μl，ddH₂O 12.25μl；反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃30s，52℃30s，72℃120s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为1600bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，将其连接到PMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，对测序结果进行BLAST分析。测序结果如序列2所示，经分析表明，该片段长1618bp，将该基因命名为SbSUT5，其编码534个氨基酸的蛋白，将其编码的蛋白(氨基酸序列如序列表中序列1所示)命名为SbSUT5。

实施例2、SbSUT5及其编码蛋白的生物信息学分析

一、SbSUT5基因的序列分析及其编码蛋白的结构功能预测

利用DNAMAN和OMIGA软件对实施例1获得的SbSUT5的全长cDNA序列进行生物信息学分析，该序列全长1618bp，其中自5’末端第1位至1605位为一个完整的ORF，编码由534个氨基酸残基组成的蛋白质SbSUT5，SbSUT5的结构示意图如图3所示。推测其分子量为56.3202kDa，等电点pI值8.47。用在线Blast工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析SbSUT5的结构域，结果表明，该蛋白属于GPH sucrose superfamily，表明该蛋白是SUT家族中的一员。用膜蛋白在线预测工具TopPred2预测该蛋白的疏水性(图4)和是一个12次跨膜的蛋白(图5)，符合蔗糖转运蛋白家族结构，说明属于蔗糖转运蛋白家族。

实施例3、SbSUT5在多种组织、器官表达模式分析

取乳熟期的上述的甜高粱幼苗进行不同组织。分别为：旗叶、叶脉、叶、叶鞘、韧皮部、髓部、花序、根分别提取上述甜高粱组织的总RNA，分别通过RT-PCR(引物为：SbSUT5：1：5′-GGACGGCAACAACAAGCAGC′；2：5′-CCAAGAAGAGCCGGACGATG-3′；内参Actin：1：5′-ACTCTGGTGATGGTGTGAGCC-3′；2：5′-GCAGTGGTGGTGAAGGAGTAAC-3′，反应条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，25个循环)结果(如图6)表明，茎秆髓部SbSUT5转录水平明显高于其他组织，证明SbSUT5在茎秆髓部的糖分积累中起重要作用。

实施例3、SbSUT5的功能验证

将实施例1扩增得到的SbSUT5基因通过含有EcorI和KpnI酶切位点的引物扩增(引物序列1：5′-CCGGAATTCATGGACGGTGGTGAC -3′，2：5’-GGGGTACCTCAGTGGCCGCCGCC-3′)，将扩增得到的目的片段回收并纯化，将其连接到pMD-19T simple(TaKaRa Code：D104A)载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，扩增出的片段具有序列2中的编码区的核苷酸序列。提取测序结果正确的克隆中的质粒，用EcorI和KpnI酶切后插入到通过同样酶切的酵母表达载体PDR196的EcorI和KpnI酶切位点间，将获得的重组载体命名为PDR196-SbSUT5。酶切结果见附图7。将重组载体PDR196-SbSUT5导入到SUT基因功能缺失的酵母突变体SUSY7株系中，同时以转入PDR196-StSUT1(含有已经验证功能的马铃薯的StSUT1基因的重组PDR196载体)作为正对照，用转入PDR196空载体的转基因酵母和作为负对照。

其中，酵母表达载体PDR196和PDR196-StSUT1，记载的文献是：Kühn C，Quick WP，Schulz A，Riesmeler TW，Sonnewald U，Frommer WB(1996).Companion cel1-specificinhibition of the potato sucrose transporter SUT1.Plant Cell Environ.19：1115-1123，公众可从中国科学院植物研究所获得；

酵母突变体SUSY7/ura3株系：记载的参考文献：Rlesmeier JW，Willmitzer L，Frommer WB(1992).Isolation and characterization of a sucrose carrier cDNAfrom spinach by functional expression in yeast.EMBO J.11：4705-4713，公众可从中国科学院植物研究所获得。

将转PDR196-SbSUT5、PDR196-StSUT1的转基因酵母、转PDR196空载体的转基因酵母分别分别涂在蔗糖为唯一碳源的MD培养基(1.7g/L无氨基酸酵母氮源，2％蔗糖，5g/L硫酸铵，20mg/L色氨酸和1.5％琼脂，调整PH＝5.0)平板上进行30℃连续培养5天。观察酵母菌落生长情况。

图8为蔗糖为唯一碳源的MD培养基中a、b、c生长情况。a表示转入SbSUT5的转基因酵母菌株系的生长，b为转入已经验证功能的马铃薯的StSUT1的转基因酵母菌株(作为正对照)的生长情况，c为转入空载体PDR196的酵母菌株(作为负对照)的生长情况。结果表明，在蔗糖为唯一碳源的MD培养基中，a的生长状态和b相同，c则不能正常生长。结果说明SbSUT5能够编码有功能的SbSUT5蛋白，可互补蔗糖转运蛋白功能缺失的酵母突变体株系，使其正常生长。

Claims

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)-4)中任一所述的基因：

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2的基因；

3)在严格条件下可与1)或2)限定的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；

4)与1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在载体PDR196的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或任一片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述基因在培育蔗糖转运蛋白功能缺失的酵母突变体株系的互补系中的应用。