CN101565461B

CN101565461B - 与水稻株型和穗粒数相关的锌指蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101565461B
Application number: CN2008101047438A
Authority: CN
Inventors: 孙传清; 谭禄宾; 李显然; 刘凤霞; 谢道昕; 朱作峰; 付永彩; 才宏伟
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2008-04-23
Filing date: 2008-04-23
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2028-04-23
Also published as: CN101565461A

Abstract

本发明公开了一种与水稻株型和穗粒数相关的锌指蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与水稻株型和穗粒数相关的由a)衍生的蛋白质。其编码基因具体可是1)其核苷酸序列是序列表中序列1或3所示的DNA分子；2)其编码序列是自序列3的5′末端第2169-2651位的DNA分子；3)在严格条件下可与序列表中序列1或3限定的DNA序列杂交且编码上述与水稻株型和穗粒数相关蛋白的DNA分子。在实际应用中，可将野生稻中PROG1沉默以培育新的栽培稻品种。

Description

与水稻株型和穗粒数相关的锌指蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及与水稻株型和穗粒数相关的锌指蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是最早驯化的作物之一，也是世界上最重要的粮食作物之一。在野生稻驯化为栽培稻的过程中，无论是形态上还是基因组上，均已发生了深刻的变化(WangX K，Sun C Q，Cai H W，Zhang J Z.The origin of the Chinese cultivated rice(Oryza sativa L.)Chinese Sci Bull，1999，44：295-304；Sun C Q，Wang X K，Li Z C，Yoshimura A.Iwata N.Comparison of the genetic diversity of commonwild rice(Oryza rufipogon Griff.)and cultivated rice(O.sativa L.)usingRFLP markers.Theor Appl Genet，2001，102：157-162)。野生稻与栽培稻在形态方面的分化主要表现在由匍匐生长变成直立生长，极易落粒变成不易落粒，散穗变成紧穗，穗粒数大幅度增加等等，其中生长习性的转变及穗粒数增加是最重要，典型的原始型普通野生稻均表现为匍匐生长、穗粒数少。由匍匐生长转变成直立生长、穗粒数大幅度增加，是栽培稻进化过程中的关键一步。直立有利于增加栽培稻的种植密度，提高光能利用率，从而获得更高产量。

发明内容

本发明的目的是提供与水稻株型和穗粒数相关的锌指蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的与水稻株型和穗粒数相关的锌指蛋白，命名为ProstrateGrowth1，简称PROG1，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与水稻株型和穗粒数相关的由a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由161个氨基酸残基组成，自氨基端第45-74位氨基酸残基为Cys₂-His₂锌指蛋白结构域，第155-161位氨基酸残基为EAR-like结构域。

为了使a)中的PROG1便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK

Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b)中的PROG1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的PROG1的编码基因可通过将序列表中序列3的5′末端第2169-2651位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述PROG1的基因也属于本发明的保护范围。

PROG1基因具体可如1)或2)或3)或4)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1或3所示的DNA分子；

2)其编码序列是自序列3的5′末端第2169-2651位的DNA分子；

3)在严格条件下可与序列表中序列1或3限定的DNA序列杂交且编码上述与水稻株型和穗粒数相关蛋白的DNA分子；

4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与水稻株型和穗粒数相关蛋白的DNA分子。

所述步骤3)中的基因，与1)的基因最好有95％以上的同源性。

序列表中的序列1由3685个碱基组成，自5′末端第2169-2651位为编码区，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5′末端第1-2168位为启动子。

序列表中的序列3由833个碱基组成，其编码基因仅有一个外显子，编码序列为自5’端第147-630位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。自5’端第280-369位碱基编码Cys₂-His₂锌指蛋白结构域，自5’端第610-630位碱基编码EAR-like结构域。

本发明所述的PROG1基因启动子也属于本发明的保护范围。

PROG1基因启动子，是如下①或②的DNA分子：

①其核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端第1-2168位所示的DNA分子；

②在严格条件下可与序列表中序列1自5′末端第1-2168位所示的DNA分子杂交且具有的启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

扩增上述PROG1基因及PROG1基因启动子全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与水稻株型和穗粒数相关蛋白编码基因及其启动子的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有PROG1基因及其启动子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的与水稻株型和穗粒数相关蛋白编码基因PROG1及其启动子的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是水稻。

使用PROG1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

本发明的另一个目的是提供一种利用PROG1基因改变水稻株型和穗粒数的方法。

本发明所提供的改变水稻株型和穗粒数的方法有两种，一种是将PROG1基因导入目的水稻组织或细胞中，得到株型和穗粒数改变的转基因水稻。另一种是沉默目的水稻中所含有的PROG1基因，得到株型和穗粒数改变的转基因水稻。

本发明转PROG1基因实验结果表明，转PROG1基因植株表现为匍匐生长，株高及穗粒数显著降低，并且PROG1-GFP蛋白定位于细胞核内，上述实验结果综合表明PROG1蛋白及其编码基因能调控水稻株型和穗粒数，PROG1蛋白可能是是一个转录因子。水稻PROG1蛋白及其编码基因对水稻株型和穗粒数的调控具有重要的实际意义，在实际应用中，可将野生稻中所含有的PROG1沉默以培育新的栽培稻品种。PROG1蛋白及其编码基因在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1为元江野生稻渗入系YIL18与轮回亲本特青的对比图。

a：匍匐生长与直立生长比较；b：分蘖基部比较；c：主茎穗大小比较；d：叶片角度大小比较；e：一次枝梗数，二次枝梗数，穗粒数和单株产量比较

图2为PROG1基因的精细定位示意图。

a：PROG1的初步定位；b：PROG1精细定位；c：粳稻品种日本晴基因组上的LOC_Os07g05900位置；d：覆盖精细定位区间的元江野生稻基因组BAC克隆(YJ0710308)；e：构建了二个基因组互补载体，pTCK仅包含基因启动子区，为对照载体，pPROG1包含了完整的基因编码区和启动子区。

图3为转基因植株PCR检测。

泳道M为DL2000(购自TAKARA，货号D501)；泳道1为亲本中花17；泳道2为水；泳道3-17为转pPROG1载体基因植株；泳道18-32为转pTCK载体基因植株。

图4为转基因植株。

a：转pPROG1-1植株(TL9)俯视图；b：转pPROG1-1植株(TL9)正视图；c：分蘖基部比较；d：转pTCK的对照植株(CL5)；e：主茎穗大小比较；f：叶片角度大小比较；g：转基因植株(TL)与转基因对照植株(CL)的四个产量性状比较，包括一次枝梗数，二次枝梗数，穗粒数和单株产量。

图5为PROG1基因亚细胞定位结果。

a：微分干涉差成像；b：DAPI染色图片；c：GFP检测图片；d：整合图片；标尺为10μm。

图6为PROG1基因表达组织定位结果。A：胚芽鞘；b和c：分蘖基部；d和e：叶鞘基部；f：叶枕。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及测序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。

实施例1、PROG1基因的获得

a)PROG1基因的精细定位

元江普通野生稻渗入系YIL18(Tan L B，Liu F X，Xue W，Wang G J，Ye S，ZhuZ F，Fu Y C，Wang X K，Sun C Q.Development of Oryza rufipogon and Oryzasativa introgression lines and assessment for yield-related quantitativetrait loci.J Integr Plant Biol，2007，49：871-884)(中国农业大学)与轮回亲本特青的对比如图1所示。元江普通野生稻渗入系YIL18表现为明显的匍匐生长、分蘖基部不形成弯曲，主茎穗小、叶片角大度；轮回亲本特青表现为直立生长、分蘖基部形成明显的弯曲、主茎穗较大、叶片角度较小。

利用元江普通野生稻匍匐渗入系YIL18与轮回亲本特青回交，构建次级分离群体，将PROG1基因初步定位于水稻第7染色体短臂RM298与RM481标记之间。进一步，利用3,600隐性纯合单株(直立生长)，将PROG1基因精细定位于pr5和pr7两标记之间，其物理距离为8.8kb。在该区间内，粳稻品种日本晴基因组上仅仅只有一个预测基因LOC_Os07g05900；如图2所示。

b)PROG1基因的获得

根据元江野生稻基因组序列设计引物，引物序列如下：

PROG1-F：5′-TTGGTACAATTGTAGATCTCATTGA-3′；

PROG1-R：5′-AAGCTCTAAGGAATTGATCGTCTCC-3′。

以元江普通野生稻因组DNA为模板，在引物PROG1-F和引物PROG1-R的引导下，用常规PCR法扩增PROG1基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化3700bp左右的的DNA片段，将该片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司，货号D504A)中，获得pMD18-T-PROG1载体，测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如序列表中序列1所示；序列表中序列1自5′末端第2169-2651位为编码区，编码序列表中序列2所示的蛋白。

根据序列表中序列1的核苷酸序列设计两对引物PROGiP1、PROG1P2和PROG1P3、PROG1P4并在引物两端分别引入限制性内切酶Hind III和Kpn I识别位点及保护碱基，引物序列如下：

PROG1P1：5′-AAGCTTGGTACAATTGTAGATCTCATTGA-3′(带下划线部分为限制性内切酶Hind III识别位点)；

PROG1P2：5′-GGTACCAAGCTCTAAGGAATTGATCGTCTCC-3′(带下划线部分为限制性内切酶Kpn I识别位点)；

PROG1P3：5′-AAGCTTGGTACAATTGTAGATCTCATTGA-3′(带下划线部分为限制性内切酶Hind III识别位点)；

PROG1P4：5′-GGTACCGAAAGGAAAATGGTACAAGCTA-3′(带下划线部分为限制性内切酶Kpn I识别位点)。

以pMD18-T-PROG1载体为模板，分别在引物PROG1P1和PROG1P2的引导下和引物PROG1P3和PROGiP4的引导下，进行常规PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收并纯化长度为3600bp左右和2100bp左右的DNA片段，分别命名为PROG和TCK，PROG含有PROG1编码区和2168bp的PROG1编码区上游5′侧翼序列；TCK仅含有2168bp的PROG1编码区上游5′侧翼序列。

分别将PROG和TCK克隆入植物表达载体pCAMBIA1300多克隆位点的Hind III和Kpn I酶切位点之间，得到含PROG1基因的植物表达载体pPROG1和仅含有PROG1基因上游5′侧翼序列的植物表达载体pTCK，如图2e所示。然后，利用农杆菌将pPROG1和pTCK分别转化粳稻品种中花17的成熟胚愈伤组织，方法如下述文献描述：Hiei Y，Ohta S，Komari T & Kumashiro T.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.Plant J.1994，6：271-282)。经预分化、分化分别得到50株经PCR鉴定为阳性的转基因植株。利用植物表达载体pCAMBIA1300中包含的潮霉素抗性基因序列设计PCR引物进行转基因植株检测，PCR鉴定引物序列如下：引物1：5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′和引物2：5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃30sec，58℃45sec，72℃1min，共35个循环；最后72℃10min。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，阳性转基因植株可扩增出约1Kb的条带。

将经PCR鉴定为阳性的转基因植株培养至成熟，观察不同时期的植株形态，结果如图4所示，所得到的50株转pPROG1载体植株(TL9)均表现为明显的匍匐生长；50株转pTCK载体的对照植株(CL5)均表现为直立生长；所得到的50株转pPROG1载体植株(TL9)的分蘖基部均不形成明显弯曲，而50株转pTCK载体的对照植株(CL5)的分蘖基部均形成明显的弯曲；所得到的50株转pPROG1的主茎穗均较小，而50株转pTCK载体的对照植株(CL5)的主茎穗均较大；所得到的50株转pPROG1载体植株(TL9)均有更大的叶片角度，所得到的50株转pTCK载体的对照植株(CL5)载体对照植株(CL5)的叶片角度均较小；比较50株转pPROG1载体植株(TL)与50株转pTCK载体的对照植株(CL)的四个产量性状，转pPROG1载体植株(TL)的一次枝梗数，二次枝梗数，穗粒数和单株产量都比转pTCK载体的对照植株(CL)小。

图4显示的是一株转pPROG1载体植株(TL9)和一株转pTCK载体的对照植株(CL5)。

实施例2、PROG1基因的亚细胞定位

根据序列表中的序列1设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶SmaI和XbaI识别位点及保护碱基，引物序列如下：

PROG1-GFP-F：5′-CGCCCGGGCATGGATCCCTCATCGGCTTC-3′(带下划线部分为限制性内切酶SmaI识别位点及保护碱基)；

PROG1-GFP-R：5′-GCTCTAGAGAGGCCGAGCTCGAGGACAA-3′(带下划线部分为限制性内切酶XbaI识别位点及保护碱基)。

以pMD18-T-PROG1载体为模板，在引物PROG1-GFP-F和引物PROG1-GFP-R的引导下，用常规PCR法扩增PROG1基因的CDS序列(不包括终止密码子TAG)。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收并纯化498bp的DNA片段，将其克隆入植物表达载体pCAMBIA1300-Actin::GFP，多克隆位点的SmaI和XbaI酶切位点之间，得到水稻PROG1-GFP融合蛋白的植物表达载体，命名为pCAMBIA1300-Actin::PROG1-GFP。pCAMBIA1300-Actin::GFP为在双元转化载体pCAMBIA1300的多克隆位点Kpn I和Sma I间插入水稻Actin启动子，并在pCAMBIA1300的多克隆位点Xba I和SpeI间插入GFP基因获得。然后，利用农杆菌将pCAMBIA1300-Actin::PROG1-GFP转化粳稻品种中花17的成熟胚愈伤组织，方法如文献Hiei Y，Ohta S，Komari T & Kumashiro T.Efficient transformation ofrice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis ofthe boundaries of the T-DNA.Plant J.1994，6：271-282中所述，经预分化、分化得到转PROG1-GFP基因植株。取转PROG1-GFP基因植株的幼根，进行冷冻切片，并用5μg/ml的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色，然后在共聚焦激光显微镜(Nikon C1 Si confocal laser microscope)下观察。如图5所示，PROG1-GFP蛋白定位于细胞核内。结合生物信息学预测的结果，推测PROG1基因是-个转录因子。

实施例3、PROG1基因的表达组织定位

根据序列表中序列1设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶BamHI和SmaI识别位点及保护碱基，引物序列如下：

PROG1-GUS-F：5’-CCGGATCCTTGGTACAATTGTAGATCTC-3’(带下划线部分为限制性内切酶BamH I识别位点及保护碱基)；

PROG1-GUS-R：5’-CGCCCGGGGAAAGGAAAATGGTACAAGC-3’(带下划线部分为限制性内切酶SmaI识别位点及保护碱基)。

以pMD18-T-PROG1载体为模板，在引物PROG1-GUS-F和引物PROG1-GUS-R的引导下，用常规PCR法扩增PROG1基因的5′端上游序列。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化长度2168bp的DNA片段，将回收的长度2168bp的DNA片段克隆到pMD18-T载体中，测序，测序结果表明该2168bp左右的DNA片段的序列如序列表中序列1自5′末端第1-2168位所示。

利用BamH I和Sma I酶切位点将上述2168bp左右的DNA片段克隆入植物表达载体pCAMBIA1300-GUS，得到PROG1基因的5′端上游序列驱动下的GUS基因表达载体，命名为pCAMBIA1300-PROG1::GUS，pCAMBIA1300-GUS为在双元转化载体pCAMBIA1300的多克隆位点Sma I和Sac I间插入GUS基因片段获得。然后，利用农杆菌将pCAMBIA1300-PROG1::GUS转化粳稻品种中花17的成熟胚愈伤组织，方法如步骤b)中所述，经预分化、分化得到转基因植株。GUS染色的方法如文献Scarpella E，Rueb S & Meijer A H.The RADICLELESS1 gene is a required forvascular pattern formation in rice.Development，2003，130：645-658所述。GUS染色结果如图6所示，说明PROG1基因的5′端上游2168bp的DNA片段具有启动子的功能，且PROG1基因主要在水稻胚芽鞘、分蘖基部、叶鞘基部和叶枕中表达，这些组织部位与水稻株型构成有直接的关系。

序列表

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述编码基因是如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1或3所示的DNA分子；

2)其编码序列是自序列1的5′末端第2169-2651位的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为pCAMBIA1300。

6.一种改变水稻株型和穗粒数的方法，是将权利要求2或3所述的基因导入目的水稻组织或细胞中，得到株型和穗粒数改变的转基因水稻。

7.一种改变水稻株型和穗粒数的方法，是沉默目的水稻中所含有的权利要求2或3所述的基因，得到株型和穗粒数改变的转基因水稻。

8.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

9.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。