CN106701820A - 一种野生稻关键基因的改良和利用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种野生稻关键基因的改良和利用方法，尤其是野生稻进化关键基因的改良和利用方法。该方法通过分析野生稻材料的基因组序列，并与普通栽培稻基因组对照比较分析，获取野生稻关键基因改良的潜在靶位点，通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术或其他基因工程技术，对潜在靶位点进行定向编辑或改良。本发明提供的方法可以快速对野生稻(进化)关键基因进行定向改良，有利于扩大或加速野生稻的开发利用，大规模开发利用野生稻基因组中的各种优异基因(尤其是抗性基因)，快速批量获得丰富的育种材料和优异种质。因此，本发明提供的方法优点在于，目的性强、周期短、成本低，显著提高野生稻资源利用效率。

Description

一种野生稻关键基因的改良和利用方法
技术领域
本发明涉及生物技术和作物育种领域。具体而言，本发明涉及一种野生稻(进化)关键基因的改良和利用方法，该方法能够实现野生稻的人工加速进化，以便大规模开发利用野生稻和其优异基因。
背景技术
在我国，水稻一般指亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)。栽培稻培育过程中由于不断自交，纯合度提高，造成遗传多样性的降低；同时水稻品种选育过分依赖少数骨干亲本，导致遗传基础日益狭窄；此外极端气候频发，各种病虫害爆发流行，都严重威胁水稻高产、稳产。而水稻驯化过程中丢失大量的优异基因，特别是丧失抵抗生物和非生物逆境的优异基因资源，因此，科学有效地利用遗传基础丰富的野生稻资源是水稻遗传育种的重要方向。
作物野生近缘种在长期的自然选择中,产生许多栽培种没有的抗逆、抗病等优异基因。这些优异基因可以通过远缘杂交或生物技术等方法转育到栽培种中,从而增强抗性，培育出优质、高产的优良品种。野生稻是栽培稻的祖先，蕴含大量栽培稻丧失的独特优异基因。在我国水稻育种中利用的野生稻主要是普通野生稻(Oryza.rufipogon Griff.)、疣粒野生稻(Oryza.meyeriana Baill.)和药用野生稻(Oryza.officinalis Wall.),其中以普通野生稻研究利用的较多。
很多研究表明，普通野生稻驯化为亚洲栽培稻的过程中，很多农艺性状发生了改变，特别在植株和籽粒形态上改变很大，如普通野生稻一般表现为匍匍生长、穗散生，籽粒细长、有芒、落粒性强，种皮多为红色；而栽培稻一般表现为直立生长、穗下垂、密集，籽粒较宽、无芒或短芒、落粒性较弱，种皮多为白色。在比较分析其基因组序列差异的基础上，研究这些性状的改变背后的分子基序，有助于揭示或重建水稻的进化过程，加深对水稻野生近缘种进化关键基因的了解，拓宽水稻育种途径，丰富育种材料，提高水稻产量和品质。
随着基因测序技术的快速发展，大规模、高通量的基因测序广泛用于亚洲栽培稻的起源进化研究。Huang等(2012年)对大量亚洲栽培稻和普通野生稻进行了全基因组重测序，初步发现了一些野生稻驯化为栽培稻的选择性清除区域，认为这些区域是驯化目标区域。其中包括PROG1(PROSTRATE GROWTH 1，匍匐生长基因)、Bh4(Black hull4，颖壳颜色控制基因)、sh4(seed shattering 4，种子落粒性控制基因)、qSW5(grain width 5，粒宽控制基因)、OsC1(叶鞘和稃尖颜色控制基因)等基因。这些基因控制的亚洲栽培稻性状包括直立生长、分蘖、矮秆、籽粒长、籽粒宽、落粒性、种皮颜色、颖壳颜色、叶鞘和芒的颜色、直链淀粉含量和稻米香味等，包含了大部分普通野生稻与亚洲栽培稻显著差异的性状。
目前，对野生稻资源的利用手段主要还停留在传统育种技术上，主要通过杂交等传统技术转育野生稻优异基因，主要困难表现在：(1)由于种间杂交存在着生殖障碍，容易造成杂交不结实、杂种不育；(2)有利基因与不利基因之间有很强的连锁障碍，影响有利基因的利用；(3)杂交后代性状疯狂分离、难以稳定。因此，野生稻资源利用迫切需要引入新的方法和技术。
以基因工程技术为代表的现代生物技术手段，大大加快了育种进程。特别是2009年以来，新型基因组编辑技术飞速发展，使在基因组精确操纵真正应用到作物定向遗传改良中。这些技术包括ZFN(Zinc finger nuclease，锌指核酸酶)、TALEN(Transcriptionactivator-like effector nuclease，类转录激活因子效应物核酸酶)、CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associatedproteins 9)等技术。利用基因组技术进行基因靶向操作，实现了基因组水平上的定向修饰，实现特定碱基的替换、定向的基因敲除或植入，显著加快作物遗传改良的进程。
但是，如何利用这些基因组编辑技术来进行野生稻基因的改良和利用，尚没有人提出明确的理论方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种野生稻(进化)关键基因的改良和利用方法。该方法通过分析野生稻材料的基因组序列，并与栽培稻基因组进行对比分析，获取野生稻(进化)关键基因改良的潜在靶位点，通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术或其他基因工程技术，对潜在靶位点进行定向编辑或改良。
具体而言，本发明提供一种野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)对目标野生稻材料进行全基因组测序，获得相应的基因组序列；
步骤(2)分析所述野生稻材料的基因组序列并将野生稻材料的基因组序列与普通栽培稻基因组进行对照比较分析；
步骤(3)获取野生稻关键基因改良的潜在靶位点；
步骤(4)通过基因编辑技术，对潜在靶位点进行定向编辑或改良。
进一步地，所述基因编辑技术为ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术中的一种。
进一步地，所述野生稻包括一般野生稻和所有水稻的近缘野生种。
进一步地，所述一般野生稻包括：普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻，所述方法优选采用普通野生稻。
进一步地，所述的关键基因包括野生稻在进化成栽培稻过程中起重要作用的生长发育、产量和品质、抗病虫害、抗非生物逆境的基因，优选为水稻进化关键基因。
进一步地，所述基因编辑技术包括基因编辑、转基因、基因沉默技术。
进一步地，所述步骤(4)包括：(4-1)通过基因克隆的方法，进行序列验证后，构建基因编辑或转基因或基因沉默载体；(4-2)利用构建产物转化根癌农杆菌菌株EHA105，(4-3)利用农杆菌介导的方法通过转化后的农杆菌菌株对目标野生水稻种子进行遗传转化，得到转基因野生稻植株；(4-4)对获得的转基因野生稻植株在靶位点测序分析或表达量分析，并对靶基因出现突变或所需表达量变化的植株，进行目标性状持续的性状观察和跟踪，(4-5)通过遗传分离，获得非转基因的，在目标关键基因序列正确，外观、农艺性状更接近栽培稻的野生稻材料。
进一步地，野生稻关键基因是野生稻进化关键基因。
另一方面，本发明提供所述野生稻关键基因的改良和利用方法在培育水稻品种中的应用，其特征在于，培育水稻品种过程中使用的材料通过权利要求1所述方法培育而来。
另一方面，本发明提供一种野生水稻直立化生长改良方法，所述方法包括：步骤(1)对目标野生稻材料进行全基因组测序，获得相应的基因组序列；
步骤(2)分析所述野生稻材料的基因组序列并将野生稻材料的基因组序列与普通栽培稻基因组进行对照比较分析，找到目标野生稻的PROG1基因；
步骤(3)获取野生稻PROG1基因的潜在靶位点；
步骤(4)通过基因编辑技术，对PROG1基因进行定向编辑，
所述步骤(4)包括：(4-1)通过基因克隆的方法，进行序列验证后，构建基因编辑或转基因或基因沉默载体；(4-2)利用构建产物转化根癌农杆菌菌株EHA105，(4-3)利用农杆菌介导的方法通过转化后的农杆菌菌株对目标野生水稻种子进行遗传转化，得到转基因野生稻植株；(4-4)对获得的转基因野生稻植株在靶位点测序分析或表达量分析，并对靶基因出现突变或所需表达量变化的植株，进行目标性状持续的性状观察和跟踪，(4-5)通过遗传分离，获得非转基因的，在目标关键基因序列正确，外观、农艺性状更接近栽培稻的野生稻材料。
本文中所涉及的“野生稻”包括一般意义的野生稻(普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻等)和其他所有水稻的近缘野生种，优选为普通野生稻。
本文中所涉及的“关键基因”包括野生稻进化过程中起重要作用的生长发育、产量和品质、抗病虫害、抗非生物逆境等主效基因，优选为水稻进化关键基因。
本文中所涉及的“基因改良”方法包括基因编辑、转基因、基因沉默等基因工程技术，优选为基因编辑技术。
本文中所涉及的“基因编辑”方法，包括ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等可对基因进行定向编辑的技术，优选为CRISPR/Cas9技术。
相对于传统育种方法，本方法有以下优点：
本发明的野生稻(进化)关键基因的改良和利用方法，从基因组分析入手，利用基因编辑技术手段，从而实现野生稻的人工加速进化，快速获得外观、农艺等性状更接近栽培稻的水稻材料。实现大规模开发利用各类野生稻资源和基因组中的丰富优异基因，批量获得具有各种优良性状的水稻材料。
本发明的方法目的性强、周期短、成本低，实现大规模开发利用野生稻基因组中的各种优异基因，可快速、批量获得具有各种优良性状的水稻材料，显著提高野生稻资源利用效率，并重建野生稻进化的人工路径。
附图说明
图1为本发明提供的野生稻(进化)关键基因的改良和利用方法的流程图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1 关键基因的确定及相应载体的制备
在进行野生稻进化关键基因进行改良之前，首先需要对目标野生稻材料进行全基因组测序，获得相应的基因组序列。本实施例中，以东乡野生稻为待改良的目标野生水稻，对该水稻进行测序及改造。本发明中所采用的东乡野生稻为常规可获得的野生稻。
在获取了东乡野生稻的全基因组序列之后，分析该野生稻材料的基因组序列并将野生稻材料的基因组序列与普通栽培稻基因组进行对照比较分析，获取野生稻关键基因改良的潜在靶位点。
在本实施例中，通过对比找到了若干关键基因，其中包括PROG1基因该基因为匍匐生长基因。
下面以PROG1基因为例进行改良过程的描述，不过首先介绍用于水稻PROG1基因打靶的重组载体的制备过程。
1.1，选择水稻PROG1基因(LOC_Os07g0153600)中第一外显子中自翻译起始密码子ATG后第101-位的核苷酸序列TGGATCCCTCATCGGCTTCTTGG，(下划线部分为5’-(N)X-NGG-3’结构中NGG部分)，作为打靶位点。
1.2，按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(OsPROG1KO1P1)和可与之互补的反向寡核苷酸链(OsPROG1KO1P2)，
具体序列为：
OsPROG1 KO1 P1:GGCATGGATCCCTCATCGGCTTCT
OsPROG1 KO1 P2:AAACAGAAGCCGATGAGGGATCCA
其中未被下划线标注的部分为上述靶位点中去除NGG的序列或互补序列，下划线部分为用于连接载体的粘性末端。
1.3,经过退火程序，将OsPROG1 KO1 P1和OsPROG1 KO1 P2两链退火形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建重组载体的插入片段。
1.4，用Bsa I内切酶(NEB公司)在37℃酶切包含能够在水稻细胞内表达的向导RNA表达框(核苷酸序列如Seq ID No.1所示)和能够在水稻细胞内表达的Cas9核酸酶表达框的水稻CRISPR/Cas9基因工程载体(核苷酸序列如Seq ID No.2所示)，载体结构和构建方法按现有文献(Xu et al,Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediatedCRISPR-Cas system in rice,RICE,2014)所示，使用Bsa I内切酶酶切水稻CRISPR/Cas9基因工程载体2小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。
1.5，用T4连接酶(NEB公司)将重组载体骨架片段和插入片段相连，转入大肠杆菌中。经测序验证后，提取阳性转化子，构成用于水稻OsPROG1基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒。
实施例2 农杆菌稳定转基因介导的野生稻OsPROG1基因打靶和T0代转基因材料的获得
2.1，从实施例1获得的重组载体，利用冻融法将表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。
2.2，成熟野生稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤组织与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用转入了OsPROG1基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体的根癌农杆菌，进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(YongboDuan,et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacteriummediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selectionin Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等的方法。
共获得47株T0代转基因水稻植株。
2.3，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，提取所获47株含有所述野生稻OsPROG1基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体的转基因植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为：
OsPROG1 KO1 genome check FP:AAAAGTCTATATGAGGAATAAC
OsPROG1 KO1 genome check RP:CCGCCGCCGTGACGCCATGGGA
2.4，以OsPROG1KO1 genome check FP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，30株植株中，带有OsPROG1基因靶标序列上的突变，突变效率为63.8％；突变的形式包括碱基的插入和/或缺失，产生无义突变，引起OsPROG1基因翻译终止；其中，10株转基因植物在两条染色体同一等位位点上同时出现了无义突变，被选为进一步筛选的材料。
实施例3 T0代转基因水稻插入T-DNA拷贝数的检测
使用上述47株转基因株系基因组DNA，参照Litao Yang(Litao Yang,Jiayu Ding,et al.Estimating the copy number of transgenes in transformed rice by real-time quantitative PCR.Plant Cell Rep.,2005,23:759-763)等的方法利用实时荧光定量PCR方法鉴定所插入的T-DNA拷贝数。结果表明，47株中有3株(编号为：T-33、T-37、T-44)仅携带单个拷贝的T-DNA插入片段。该步骤的目的是为了后面选择非转基因植株提供参考。因为拷贝数越少的T0植株，后代越容易得到非转因植株。
实施例4 子代中非转基因株系的分离
取100粒T-33种子萌发成苗后，使用100mg/L潮霉素溶液涂抹子代叶片，28棵T1代植株表现为潮霉素敏感。随机抽提10株潮霉素敏感T1代及1株潮霉素抗性植物的叶片DNA，用ACTIN基因特异引物扩增作为阳性对照，所有植株均获得ACTIN基因特异条带，表明所提取DNA质量可以用于检测目标基因；使用35S启动子、T-Nos和HPT三种特异引物对上述10株潮霉素敏感T1代及1株潮霉素抗性植物的叶片DNA进行PCR扩增，均没有获得目的条带，这说明在遗传过程中，这些敏感植株中的外源DNA片段基因分离，这些子代已无外源DNA插入。随机挑选两株(T-33-73和T-33-84)通过实施例2中的方式对打靶位点测序表明，染色体对的两个等位位点中OsPROG1基因靶位点出仍然存在无义突变。说明基因编辑造成的突变稳定的遗传给下一代了，即获得了具有突变的非转基因的后代植株。
通过上面对野生稻的改良，将东乡野生稻由匍匐生长转变为直立生长。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)对目标野生稻材料进行全基因组测序，获得相应的基因组序列；
步骤(2)分析所述野生稻材料的基因组序列并将野生稻材料的基因组序列与普通栽培稻基因组进行对照比较分析；
步骤(3)获取野生稻关键基因改良的潜在靶位点；
步骤(4)通过基因编辑技术，对潜在靶位点进行定向编辑或改良。
2.根据权利要求1所述的野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，所述基因编辑技术为ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术中的一种。
3.根据权利要求1所述的野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，所述野生稻包括一般野生稻和所有水稻的近缘野生种。
4.根据权利要求1所述的野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，所述一般野生稻包括：普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻，所述方法优选采用普通野生稻。
5.根据权利要求1所述的野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，所述的关键基因包括野生稻在进化成栽培稻过程中起重要作用的生长发育、产量和品质、抗病虫害、抗非生物逆境的基因，优选为水稻进化关键基因。
6.根据权利要求1所述的野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括基因编辑、转基因、基因沉默技术。
7.根据权利要求1所述的野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，所述步骤(4)包括：(4-1)通过基因克隆的方法，进行序列验证后，构建基因编辑或转基因或基因沉默载体；(4-2)利用构建产物转化根癌农杆菌菌株EHA105，(4-3)利用农杆菌介导的方法通过转化后的农杆菌菌株对目标野生水稻种子进行遗传转化，得到转基因野生稻植株；(4-4)对获得的转基因野生稻植株在靶位点测序分析或表达量分析，并对靶基因出现突变或所需表达量变化的植株，进行目标性状持续的性状观察和跟踪，(4-5)通过遗传分离，获得非转基因的，在目标关键基因序列正确，外观、农艺性状更接近栽培稻的野生稻材料。
8.根据权利要求1所述的野生稻关键基因的改良和利用方法，其特征在于，野生稻关键基因是野生稻进化关键基因。
9.根据权利要求1所述的野生稻关键基因的改良和利用方法在培育水稻品种中的应用，其特征在于，培育水稻品种过程中使用的材料通过权利要求1所述方法培育而来。
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