CN102477090A

CN102477090A - 促进叶绿体发育的蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102477090A
Application number: CN2010105742781A
Authority: CN
Inventors: 程祝宽; 洪丽兰; 李明; 唐丁; 王克剑
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-05-30

Abstract

本发明公开了一种水稻促进叶绿体发育的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。本发明的基因编码核糖核苷酸还原酶小亚基，它突变后会影响水稻叶绿体的发育，使水稻叶片上沿叶脉方向分布白色条纹。

Description

促进叶绿体发育的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及促进叶绿体发育的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

叶绿体是真核光合生物特有的细胞器，真核光合生物的光合作用是在叶绿体内进行的。光合作用是地球上唯一可大规模地把太阳能转变为化学能，把无机物合成有机物，并放出氧气的过程，它为人类、动植物和无数微生物的生命活动提供食物、能量和氧气。概括地说，光合作用是维持地球上生命活动的最根本的反应。因此对叶绿体发育机制的研究，将有助人们了解光合作用的调控机理，更好地利用太阳能。目前人们已经进行了大量的工作，其中不少进展是从叶片为淡绿色、甚至为黄色或白色的突变体的研究中获得的。利用分子生物学的方法，这些突变体的突变基因被克隆出来，并进行了相关的功能分析。根据这些基因的功能可将它们分为以下几类：叶绿素代谢相关基因，脂类代谢相关基因，蛋白代谢相关基因，物质转运与定位相关基因等。虽然目前的研究取得了不少进展，但是叶绿体是一个具有复杂结构和功能的系统，还有许多东西尚不清楚，叶绿体的发育机制以及光合作用的调控机理还有待进一步的研究。水稻是一种重要的粮食作物，目前已经发现大量叶色变淡甚至白化的突变体。例如在gramene网站目前已经登录albino突变体11个、chlorina突变体10个、virescent突变体12个、fgl(faded green leaf)突变体1个、pgl(pale green leaf)突变体1个、ygl(Yellow-green leaves)突变体1个等等，但是导致其突变的分子机制了解甚少。因此利用水稻叶色突变体克隆与叶绿体发育相关的基因，并分析其功能，进一步了解叶绿体的发育调控机制以及光合作用调控机制，具有重要的理论意义。光合作用与作物产量密切相关。

核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase，RNR)是催化核糖核苷经脱氧还原为脱氧核糖核苷(dNTP)的专一酶类，它存在于所有已知的具有细胞的生物中，为DNA的合成和损伤修复提供前体。此外，它还在维持动植物及真菌的基因组稳定中起关键作用。在酵母和哺乳动物中该酶的功能被广泛的研究，而在植物中该酶的报道还很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻促进叶绿体发育的蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的水稻促进叶绿体发育的蛋白(WS)，来源于水稻，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。

具体可为：

1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)由序列表中的SEQ ID №.4的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

序列表中序列2由339个氨基酸残基组成，序列表中序列4由345个氨基酸残基组成。

序列2与序列4的氨基酸序列比较见图4。

为了便于WS的纯化，可在由序列2或序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基端或羧基端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的WS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的WS的编码基因可通过将序列表中序列1或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述水稻促进叶绿体发育的蛋白(WS)的基因(WS)也属于本发明的保护范围。

所述水稻促进叶绿体发育的蛋白cDNA基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID №.1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №.2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №.1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的序列1由1020个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-1020位核苷酸。

1)序列表中SEQ ID №.3的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №.4蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №.3限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在严格条件下可与序列表中序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的序列3由1038个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-1038位核苷酸。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体(如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

含有以上任一所述基因(LcP5CS1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增上述基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种均可应用于培育光合效率提高的转基因水稻。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得抗盐、耐旱性增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明的基因在籼稻中籼3037突变后得到白条突变体ws(white stripe)，该突变体叶片上沿叶脉方向分布白色条纹。通过构建籼粳杂交群体，利用图位克隆的方法，获得了控制这一性状的基因。序列比较表明，该基因编码核糖核苷酸还原酶小亚基。在ws突变体中该基因的突变位点与前人报道的该基因的突变体的突变位点不一样，说明这是一个新的突变体。这一新突变体的获得，对了解水稻叶绿体发育、降解和光合作用调控机制具有重要的应用价值，可为水稻育种提供一定的参考依据。新基因克隆后，可以探索利用转基因技术，提高植物的光合能力，从而增加作物产量，产生更高的经济效益。

本发明的基因编码核糖核苷酸还原酶小亚基，它突变后会影响水稻叶绿体的发育，使水稻叶片上沿叶脉方向分布白色条纹。核糖核苷酸还原酶广泛存在于各种生物中，是生物体内唯一的催化4种核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶。因此，该酶是研究DNA合成与修复、细胞增殖与分化及癌症的治疗与抗癌药物开发的重要靶点。因此，研究核糖核苷酸还原酶小亚基在水稻叶绿体发育、降解和光合作用过程中起的作用，有助于增加我们对植物中核糖核苷酸还原酶了解，分析其在提高植物的光合能力、影响细胞增殖与分化等方面的潜在的应用价值，最终探索通过转基因技术利用该基因来增加作物产量，产生更高的经济效益。

附图说明

图1为3037和ws突变体在田间的表型，左为3037植株，右为白条突变体ws。

图2为3037和ws突变体的表型；

A为对照3037的植株；B为白条突变体ws的植株；C为3037(左)与ws(右)的叶鞘；D为3037与ws的三叶期小苗，最左边一株为3037，右边三株为ws；E和G分别是3037与ws的成熟的叶片；F和H分别是经台盼蓝染色的3037与ws的成熟的叶片。

图3为3037和ws突变体的表型；

A为对照3037叶片的横切；B为A图的局部放大图；C为ws叶片的横切；D为C图的局部放大图。

图4为WS基因的定位及互补表达载体的构建；

A.WS基因位点被定位到水稻6号染色体短臂上的分子标记S7和C2之间。

B.WS基因的结构。黑色代表外显子，该基因只有一个外显子。箭头标示的是突变位点，GA碱基突变为TT碱基，导致天冬氨酸Asp转变为脯氨酸Ser。

C.互补表达载体的构建。pCWS，互补表达载体，包括WS基因上游3363bp和下游3510bp；pCWSC，互补表达载体对照，与pCWS相比少了部分外显子及5、端序列。

图5为pWSLRNAi转基因植株的表型；

A为对照日本晴(左)的植株和pWSLRNAi转基因植株(右)；B为3037(左)、ws(中)和pWSLRNAi转基因植株(右)的叶片；C为3037(左)、ws(中)和pWSLRNAi转基因植株(右)的叶鞘。

图6为WS与WSL氨基酸序列比较。

图7为日本晴和pWSLRNAi植株WSL基因表达量。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量

实施例1、水稻白条突变体ws的表型及遗传分析

1、水稻白条突变体ws的表型分析

水稻白条突变体ws是本实验室在田间发现的中籼3037(WT，购自扬州大学农学院)的自然突变体。与对照3037相比，白条突变体表型为从幼苗期开始，其叶片上沿叶脉方向分布白色条纹，随着植株的生长，白条在叶片上逐渐增多，表型最严重的是倒二叶片，而剑叶的表型则有所缓和。在孕穗期时，表型严重的植株其倒二叶片上大部分分布着白色条纹。突变体表型在正常的栽培条件下不影响水稻的正常的生长发育(图1)。对孕穗期植株各叶片进行叶绿素含量分析也显示了ws植株中叶片从下往上其叶绿素含量逐渐降低，在剑叶有回升。图1为3037和ws突变体在田间的表型，图中左为对照3037植株，呈深绿色；右为白条突变体ws的植株，呈白化状态。图2为对3037和ws突变体进一步的表型观察：A为对照3037的植株，植株通体深绿色；B为白条突变体ws的植株，部分叶片上分布白色条斑；C为3037与ws的叶鞘，左为对照3037的叶鞘，右为ws的叶鞘，其上也分布有白条斑；D为3037与ws的三叶期小苗，在该时期ws就显现出了表型，最左边一株为3037，右边三株为ws；E和G分别是3037与ws的成熟的叶片，ws上有很明显的白斑；F和H分别是经台盼蓝(Trypan Blue)染色的3037与ws的成熟的叶片，染色参照Wang和Liu的方法(Wang，C.and Liu，Z.(2006).Arabidopsis Ribonucleotide Reductases AreCritical for Cell Cycle Progression，DNA Damage Repair，and Plant Development.ThePlant Cell，18，350-365)，ws的叶片能被台盼蓝染成明显的蓝色，说明叶片中存在大量的死细胞。

2.突变体ws的细胞学观察

通过半薄切片对比发现，野生型3037的叶片(图3A和B)有数量众多，排列紧凑，细胞质丰富的叶肉细胞；突变体ws的叶片(图3C和D)白色部位的叶肉细胞发育极不正常，只能看到一些空泡状结构。

3、水稻白条突变体ws的遗传分析

水稻白条突变体ws和粳型野生型材料(Japonica)日本晴(中国农科院作物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号I1A13071)，二品种杂交得F1代，F1代自交产生F2代，对F2代植株进行表型鉴定，日本晴和ws分别作为正、负对照，F2代植株的表型鉴定结果如表2所示，表明水稻白条这一性状符合单基因控制遗传规律。表2中，正常株数是指具有日本晴表型的株数，白条ws株数是指具有ws表型的株数。

表2水稻白条突变体ws的遗传分析

组合	正常株数	白条ws株数	总株数	分离比
					白条ws/日本晴	227	73	300	3.21∶1

实施例2、核糖核苷酸还原酶小亚基WS及其编码基因WS的获得

1.图位克隆WS的基因组基因

为了克隆WS基因，我们将用纯合的白条突变体ws和日本晴进行杂交，获得的F₁代自交得到F₂群体，对其中180个F2隐性个体(具有白条表型的F2代个体)进行WS基因的初步定位。应用STS(Sequence-Tagged Site)分子标记，利用PCR的方法，我们发现位于第6染色体上的STS标记S1、S2、S3和S4与突变位点在位置上具有明显的连锁性。突变位点和S2之间的交换单株，绝大多数在突变位点和S1之间也进行交换，而突变位点和S3之间的交换单株，绝大多数包含在突变位点和S4之间的交换单株中。同时突变位点和S3之间的交换单株与突变位点和S2之间的交换单株不同，因此推断突变基因可能位于标记S2和标记S3之间的区域。在此基础上，我们进一步扩大突变体ws和日本晴的杂交组合，获得了包含960株突变单株的F₂分离群体用于WS精细定位。参照已经完成的水稻基因组序列(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/和http://btn.genomics.org.cn)，对粳稻和籼稻的序列进行比较，利用序列差异发展了6个新的STS和CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)分子标记(表3)。最终将WS精细定位于BAC克隆AP005619标记S5和S6之间，这两个标记之间的物理距离约为9kb。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb)分析表明，9kb区域内共有3个基因，我们将这三个基因都进行了DNA序列测定，比较了突变体和野生型序列，发现其中两个基因在突变体中的序列都与野生型的一致，只有一个编码核糖核苷酸还原酶小亚基的基因，其ORF接近3’端有两个点突变GA＞TT，造成了一个天冬氨酸转变成一个脯氨酸。因此，我们将核糖核苷酸还原酶基因确定为目标基因，命名为WS。图4中C为WS基因结构，图中标记为基因的突变位点。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明，该基因从起始密码子到终止密码子的基因组全长为1020bp，没有内含子，共编码339个氨基酸。该基因的完整的ORF序列为序列表中序列1所示的序列。

表3本研究新创制的STS和CAPS标记

2.WS基因全长ORF的获得

水稻中籼3037叶片总RNA提取采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA 为模板，primer 1(5’-CCATCCAGAAACCACCCCGAT-3’)和primer 2(5’-GGAGATGTACACGAGGAGATTGG-3’)，进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：模板(cDNA)5μl(5ng)，引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP 终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶2.5U，10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μl，用双蒸水补足至50μl体积。

反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸8分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pBM19-T载体(Biomed，A1360)在室温下下连接20分钟，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得如序列表中序列1所示的WS的cDNA的ORF，其全长1020bp，其编码的氨基酸序列见序列表中序列2。

实施例3、白条突变体WS表型的互补实验

1、互补载体pCWS及互补对照载体pCWSC的构建

利用EcoR I单酶切BAC OsJNBb0055C04(购自中科院上海国家基因研究中心，编号OsJNBb0055C04)，获得包含有WS的起始密码子ATG上游的3363个碱基和终止密码子TGA后的3510个碱基的全长序列的DNA片段(7893bp)，克隆到pCAMBIA1300(DingGuo，MCV033)的EcoR I识别位点间，即构建成了互补表达载体pCWS。将构建好的互补载体pCWS用PstI酶切，去除WS基因的部分编码区和基因的5’启动子区，保留3’端的部分编码区和3’调控区，即构建成了互补对照载体pCWSC(图4中C)。

2、pCWS和pCWSC转化株系的获得及其表型鉴定

两载体pCWS和pCWSC通过电击的方法分别转入农杆菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105(北京亚平宁生物)中，利用农杆菌的介导法分别将pCWS和pCWSC转入白条突变体ws与日本晴杂交群体的自交F3代隐性个体(具有白条表型的个体)。转化的具体方法是将该F3代隐性个体幼胚灭菌后切出，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养1周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有pCWS和pCWSC质粒的EHA105菌株分别侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。

将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗，7天后移栽到水田，观察转基因植株的表型恢复情况。结果表明互补载体pCWS能恢复白条表型为野生型表型，而互补对照载体pCWSC不能恢复白条表型。功能互补实验表明WS控制白条突变体ws表型。

实施例4、WS同源基因WSL的获得及其转基因植株表型鉴定

1.WS同源基因WSL的获得

利用获得的WS的cDNAORF进行序列同源比对，我们在水稻基因组中找到一个氨基酸序列与WS基因有95％相似性的基因，将其命名为WSL基因。水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明，该基因从起始密码子到终止密码子的基因组全长为1038bp，没有内含子，共编码345个氨基酸(见序列表的序列4)。该基因在KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA)水稻日本晴的cDNA数据库有完整的cDNA序列，登录号为ak073063。该基因的完整的ORF序列见序列3。WS与WSL氨基酸序列的差异见图6。

2.WSL基因全长ORF的获得

以实施例2中水稻中籼3037叶片cDNA 为模板，primer3(5’-AGGCGAGGAGGAAGACGAGG-3’)和primer 4(5’-ACAAGAAACCATACGAACAC-3’)，进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：模板(cDNA)5μl(5ng)，引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP 终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶2.5U，10×TaqDNA聚合酶缓冲液5μl，用双蒸水补足至50μl体积。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pBM19-T载体(Biomed，A1360)在室温下下连接20分钟，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得如序列3所示的WSL的cDNA的ORF，其全长1038bp，其编码的氨基酸序列见序列4。

3.WSL基因RNA干扰转基因植株的获得

利用获得的WSL的cDNA ORF的一个片段(引物CTCGAGACGTACATCCGCGA和GAAGTCCTCGTCGATGCTGA扩增WSL的cDNA ORF得到的片段)反向重复地分别连到内含子序列的两端，然后将这三段拼合的序列与组成型CaMV35S启动子连接，克隆到pCAMBIA1300(CAMBIA，Canberra，Australia)的EcoR I和Hind III识别位点间，即构建成了RNAi干扰载体pWSLRNAi。

pWSLRNAi详细构建方法：

将用引物对primer 5(5’-CTCGAGACGTACATCCGCGA-3’)和primer 6(5’-GAAGTCCTCGTCGATGCTGA-3’)进行PCR反应扩增日本晴基因组DNA，反应条件如下：

反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸8分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后连入3’有碱基T的线性pMD19-T(Takara，D101)载体中得到载体pMD19-WSL，分别用Sal I和BamH I以及Pst I和Xba I双酶切载体pMD19-WSL得到片段1和片段2，用BglII和Xba I双酶切载体pUCCRNAi(购自中国科学院遗传发育研究所)得到片段3，将片段1、2、3同时连入过表达载体pCam13OX的Pst I和Sal I识别位点间，即构建成了RNAi干扰载体pWSLRNAi。pCam13OX的构建方法如下：用引物对35S-F：(5’-AAGCTTCCCAGATTAGCCTTTTCAAT-3’)和35S-R：(5’-CTGCAGTCCCCCGTGTTCTCTCCAA-3’)扩增质粒pBI121(DingGuo，MCV032)得到约850bp的组成型CaMV35S启动子片段，将该片段用Pst I和Hind III双酶切然后连入载体pCAMBIA1300(DingGuo，MCV033)的PStI和HindIII识别位点间，构成中间载体pCam13OXM。用EcoR I和Sac I双酶切质粒pBI121，将得到的片段连入中间载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间，最终得到过表达载体pCam13OX。

通过电击的方法将载体pWSLRNAi转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，利用农杆菌的介导法将其转入粳型野生型材料日本晴中。转化方法同实施例2。

得到的转基因植株在幼苗期即显示出叶脉发白的表型，随着植株生长，白斑表型逐渐明显，到抽穗期时，白条几乎分布了整个叶面，尤其是叶片与叶鞘连接处(图5)。转基因植株的白条表型明显强于ws突变体，说明WSL基因也参与了水稻叶片中叶绿体的发育。图5中A为对照日本晴(左)的植株和pWSLRNAi转基因植株(右)；B为3037(左)、ws(中)和pWSLRNAi转基因植株(右)的叶片；C为3037(左)、ws(中)和pWSLRNAi转基因植株(右)的叶鞘。

pWSLRNAi植株WSL表达量的定量检测：

取转基因植株及野生型材料日本晴的成熟期叶片，提取总RNA，采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。采用SYBR Green嵌合荧光法进行qPCR(Real-timePCR)比较转基因植株及野生型材料日本晴的抽穗期叶片cDNA中WSL基因的表达量，以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照。扩增WSL基因用引物对primer 7(5’-AACCCGTTCGACTGGATGGAG-3’)和primer 8(5’-ACAAGAAACCATACGAACAC-3’)，扩增Ubiquitin基因用引物对primer 9(5′-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3’) 和 primer 10(5′-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3’)。

PCR扩增反应条件如下：反应体积20μl，其中含有：模板(cDNA)1μl(25ng)，正向引物、反向引物终浓度各0.5μM，dNTP终浓度各200μM，SYBR Green(20X)0.5μl，Hot start Taq DNA聚合酶1U，10×Taq DNA聚合酶缓冲液2μl，用双蒸水补足至20μl体积。

反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性25秒，58℃退火25秒，72℃延伸25秒，扩增40个循环；最后在72℃下延伸5分钟。PCR扩增反应及数据处理使用BioRad CFX96real-time PCR detection system完成。

结果显示以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照，转pWSLRNAi植株中WSL基因的表达下降了约9倍(见图7)，确实达到了干扰的效果。图7为日本晴和pWSLRNAi植株WSL基因表达量；左(Nip)为野生型材料日本晴的成熟期叶片cDNA，右(pWSLRNAi)为转pWSLRNAi植株的成熟期叶片cDNA。