CN104975030A - 玉米黄绿叶突变基因ygl-1及其编码的蛋白质与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米黄绿叶突变基因ygl-1，如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质如SEQ ID NO.2所示。用于扩增玉米黄绿叶突变基因ygl-1的引物，如SEQ ID NO.4、5所示。本发明的玉米黄绿叶突变基因ygl-1，首次在玉米中发现，可以用于玉米良种选育和杂交育种，可以作为分子标记用于种质资源鉴定，选择含有玉米黄绿叶突变基因ygl-1的种质材料或转育后代，利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择，同时该标记还可用于对玉米种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料，对改良杂交种制种纯度控制效果具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于遗传学领域，具体涉及玉米黄绿叶突变基因ygl-1及该基因编码的蛋白质与应用。
背景技术
在自然界存在的所有突变类型中，叶色突变是最常见的突变形式之一，并且叶色突变通常可以直观表现出来，性状相对比较明显，也容易辨别和区分。早在20世纪30年代，生物学研究中就有相关叶色突变体的报道。至今已在水稻、大豆、玉米、大麦、小麦、番茄和油菜等多种植物中发现叶色突变体。其突变基因往往直接或间接影响光合色素，特别是叶绿素的合成和降解，导致各种色素的含量和比例发生变化，从而引起植物叶色发生变异。
玉米(Zea mays)是世界上重要的粮食作物，是动物饲料和工业燃料的主要来源。在当前世界人口增长、人均耕地面积减少的趋势下，目前的玉米生产情况已无法满足玉米市场的需要。玉米的产量90％以上是靠光合作用积累起来的，因此通过提高光合作用效率来提高玉米产量，即高光效育种，是解决这一问题的一条有效技术途径。叶色突变体是研究玉米光能利用的理想材料。在玉米中目前已经得到一些叶色突变体，但大部分研究仅局限于基因的初步定位。深入研究这些黄绿叶突变体的突变基因对于提高玉米光能利用效率和改良杂交种制种纯度控制效果具有重要的应用价值。
发明内容：
为克服现有技术中的不足，本发明提供了一种玉米黄绿叶突变基因ygl-1，及其编码的蛋白质与应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
玉米黄绿叶突变基因ygl-1，该基因的核苷酸序列为以下序列之一：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；
(3)在严格条件下，与(1)或(2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
(4)由于遗传密码子的简并性区别于(1)、(2)、(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
上述玉米黄绿叶突变基因ygl-1所编码的蛋白质，其氨基酸序列为以下序列之一：
(1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序列。
本发明的玉米黄绿叶突变基因ygl-1，来自玉米，与野生型基因YGL-1(如图6所示，其中，B73基因序列如SEQ ID NO.33所示，B73氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示)相比，在ORF第713碱基处缺失一个G(引起编码区发生移码突变造成提前终止)，ORF全长960bp，编码319个氨基酸，ANK，ANK_2和CHROMO结构域都发生了改变，如图1所示。
本发明的玉米黄绿叶突变基因ygl-1，为隐性基因，其表型为：全生育期的叶片都表现淡绿色，通过叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的测定试验，结果发现无论在苗期还是成株期黄叶突变体与正常植株相比其叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均显著下降，其中叶绿素b的含量下降最多，推测黄绿叶突变体ygl-1的表型主要是由叶绿素b的含量下降引起的。
本发明的玉米黄绿叶突变基因ygl-1，可以用于玉米良种选育和杂交育种，可以作为分子标记用于种质资源鉴定，选择含有玉米黄绿叶突变基因ygl-1的种质材料或转育后代，具体应用方式可以为：利用玉米黄绿叶突变基因ygl-1的特异性引物(如SEQ ID NO.3、4所示)，对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段大小，若只扩增出1405bp的条带，则该待测个体的基因型为野生型，若只扩增出1404bp的条带，则该待测个体的基因型为突变型，若同时扩增出两条带，则该待测个体的基因型为杂合型。
本发明的有益效果是：提供了一种玉米黄绿叶突变基因ygl-1，是玉米中首次发现，为玉米遗传育种研究提供了良好的工具。此外，叶色突变极易识别，可作为标记性状应用于玉米良种选育和杂交育种中，利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择，同时该标记还可用于对玉米种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料，对改良杂交种制种纯度控制效果具有重要的应用价值。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图。
图1突变基因ygl-1与6种野生型基因YGL-1氨基酸序列比对，其中实线，点划线，虚线分别代表ANK_2，ANK,和CHROMOSO结构域。
图2为ygl-1突变体的表型观察照片，其中，a：两周大的ygl-1突变体；b：两周大的野生型Lx7226；c：六周大的ygl-1突变体(左侧)和野生型Lx7226(右侧)；d：开花期的ygl-1突变体(左侧)和野生型Lx7226(右侧)。
图3为叶绿体超微结构的透射电镜观察，其中，a，c分别是苗期和成株期的ygl-1突变体；b，d分别是苗期和成株期的野生型Lx7226。
图4为ygl-1基因的遗传连锁图谱。
图5为ygl-1基因的图位克隆。
图6突变体基因ygl-1与6种野生型基因YGL-1的DNA序列比对，其中六种野生植株分别是Lx7226，B73，Chang7-2，Ye478，Yuanwu02和Zheng58。
图7突变基因ygl-1与野生型基因YGL-1的表达分析，其中，R：根；S：茎；L：叶；E：雌穗；T：雄穗；1w：1周；6w：6周；10w：10周。
具体实施方式
以下结合具体实例，对本发明进行详细说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1 表型及遗传分析
(1)叶片特性分析
玉米ygl-1突变体是在选育自交系(两份玉米自交系为原武02和掖478，材料为本单位育种常用材料，本单位工作人员徐相波博士，于2009年在本单位的龙山试验基地发现)的后代材料中发现的，其全生育期的叶片都表现淡绿色(图2)。
(2)叶绿素相关成份含量测定
在苗期和成株期对正常植株Lx7226和黄叶突变体ygl-1的叶片相对应的位置取材，进行叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的测定，结果发现无论在苗期还是成株期黄叶突变体与正常植株相比其叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均显著下降，其中叶绿素b的含量下降最多，推测黄绿叶突变体ygl-1的表型主要是由叶绿素b的含量下降引起的(表1)。
表1 叶绿素相关成分含量测定
**显著性差异P＝0.01，*显著性差异P＝0.05，(Chl a为叶绿素a；Chl b为叶绿素b；Carotenoid为类胡萝卜素)。
(3)叶绿体透射电镜观察
在苗期和成株期对正常植株Lx7226和黄绿叶突变体ygl-1的叶片相对应的位置取材，经过前处理后进行透射电镜观察，发现黄绿叶突变体与正常植株相比其叶绿体基质片层少，排列不规则，结构松散，如图3所示。
(4)遗传分析
利用玉米黄叶突变体ygl-1分别与叶色正常的自交系Lx7226，B73和Chang7-2杂交，用得到的F2分离群体进行遗传分析，结果表明ygl-1的黄绿叶表型由隐性单基因控制(表2)。
表2 ygl-1突变体的遗传分析
实施例2 突变基因ygl-1位点的定位
用实验室合成的224对核心SSR引物借助BSA分离群体分离分析法找到了1个与目标基因连锁的多态性分子标记P3，位于Bin1.01区，与玉米中黄绿叶突变体已知功能基因elm1(8.06)、elm2(9.03)和vyl(Chr.9)不在同一个染色体上，初步断定控制该性状的基因是一个功能尚不清楚的新基因。利用maizegdb网站公布的Bin1.01区的23对SSR引物挖掘与目标基因连锁的多态性分子标记，发现5个具有多态性，分别是P1，P2，P4，P5，P6(如表3所示)。利用这6个多态性分子标记对F2分离群体中231株黄绿叶突变体的基因型进行检测，结合它们的表型，构建了黄绿叶突变基因ygl-1的遗传连锁图谱，ygl-1基因被定位在遗传距离是7.5cM的两个分子标记P2和P4之间，所对应的物理距离为2.6Mb(图4)。通过进一步开发与ygl-1基因连锁的多态性分子标记，新找到4个SSR标记，分别是P7，P8，P9和P10。用这4个SSR标记筛选P2和P4两标记间的34个交换单株，结果发现P7，P8，P9和P10处分别有12，7，5和7个交换单株。因此ygl-1被定位在物理距离约为0.86Mb的标记P8和P9之间(图5b)。
为了对ygl-1基因进行精细定位，新开发了4个SSR标记P11，P12，P13和P14。分别用SSR标记P3和P9对2247个F3个体和2930个F2个体进行基因型的检测，结合它们的表型发现P3标记有32个交换单株，其中22个来自F3群体10个来自F2群体，P9标记有96个交换单株，其中52个来自F3群体44个来自F2群体。用标记P11，P12，P13和P14对P3和P9间的128个交换单株进行基因型的鉴定，发现分别有3，1，1和4个交换单株，并且标记P12和P13位于基因ygl-1的两侧。因此目前目标基因被定位在物理距离约为48Kb的两个分子标记P12和P13之间(图5c)。
利用基因分析与预测软件(www.softberry.com)对这48Kb进行基因预测，结合maizeGDB网站公布的注释基因，在该区间有三个候选基因，其中一个编码43KD的叶绿体信号识别蛋白，与拟南芥中的黄绿叶突变体CHAOS编码的43KD的叶绿体信号识别蛋白有54﹪的同源性。据我们所知，另外两个基因未见报道与叶绿素代谢相关，所以推测编码43KD叶绿体信号识别蛋白的基因就是我们的候选基因(图5d)。
表3 图位克隆ygl-1基因用到的引物
实施例3 突变基因ygl-1的克隆
基因编码区序列使用PCR引物(如SEQ ID NO.3、4所示)从野生型和突变体叶片基因组中扩增获得，直接连接克隆载体，测序，然后用序列分析软件DNAStar进行序列比对。PCR扩增程序：95℃5min，95℃45s，65℃45s，72℃90s，共30个循环，最后72℃10min，4℃forever。
序列分析发现，突变体基因ygl-1在ORF713处缺失一个G，引起编码区发生移码突变造成提前终止(图6)。
实施例4 突变基因ygl-1与野生型基因YGL-1的序列特征分析
通过搜索玉米基因组数据库，发现YGL-1为单拷贝基因，且只有一个外显子。其ORF全长1281bp，编码426个氨基酸，167-278为ANK结构域，175-269为ANK_2结构域，363-418为CHROMO结构域。
ygl-1ORF全长960bp，编码319个氨基酸，ANK结构域，ANK_2结构域和CHROMO结构域都发生了改变，其它特征都和YGL-1相同。
实施例5 突变基因ygl-1与野生型基因YGL-1的表达分析
用semi-quantitative RT-PCR方法对突变基因ygl-1与野生型基因YGL-1的进行表达分析，YGL-1基因在ygl-1突变体和野生型的根、茎、叶、雌穗和雄穗中都有表达，且均在雌穗中表达量最高(图7a)。此外，分别对ygl-1突变体植株和野生型在1周、6周、10周时取材进行基因表达分析，结果显示，ygl-1突变体与野生型相比该基因的表达在整个生育期没有明显差异(图7b)。在黑暗或光照条件处理下，该基因的表达在ygl-1突变体与野生型中在黑暗条件下均明显提高(图7c)。
实施例6 突变基因ygl-1在辅助育种中的应用
使用PCR引物(如SEQ ID NO.3、4所示)从野生型和突变体叶片基因组中扩增获得，直接连接克隆载体(全式金公司Peasy-T1)，测序，然后用序列分析软件DNAStar进行序列比对。PCR扩增体系：ddH2O 13.6ul，10x buffer 2.0ul，上游引物0.75ul，下游引物0.75ul，dNTP 0.5ul，Easy-Taq酶0.4ul，基因组DNA 2.0ul。所用试剂都是购自全式金公司。PCR扩增程序：95℃5min，95℃45s，65℃45s，72℃90s，共30个循环，最后72℃10min，4℃forever。上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院玉米研究所
<120> 玉米黄绿叶突变基因ygl-1及其编码的蛋白质与应用
<130>
<160> 34
<170> PatentIn version 3.3
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ccaggcctcc gaacctgaac cctcccacaa cgccatctcc atcccttcat gcaccatctc 300
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Pro Thr Thr Pro Ser Pro Ser Leu His Ala Pro Ser Leu Leu Arg Leu
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Arg Ala Arg Arg Leu Ile Ala Ala Ala Val Phe Gln Asp Gln Lys Pro
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Lys Glu Pro Ala Ser Lys Gly Gly Asp Asp Glu Glu Glu Ala Tyr Gly
100 105 110
Glu Val Asp Arg Ile Val Ser Ser Arg Thr Val Ser Ser Pro Val Phe
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Glu Trp Lys Asp Gly His Glu Pro Ser Trp Val Pro Ala Glu Ala Ile
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Ala Ala Asp Val Val Ala Glu Tyr Glu Thr Pro Trp Trp Thr Ala Ala
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Lys Lys Ala Asp Ser Glu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ala Asp Glu Thr
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Leu Arg Arg Asp Pro Asp Ala Glu Asp Ala Gln Gly Arg Thr Ala Ala
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Arg Cys Trp Ser Trp Ala Pro Thr Arg Arg Leu Pro Thr Gly Arg Ala
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Ala Arg Arg Trp Ser Trp Ser Arg Arg Cys Ser Pro Gly Arg Pro Arg
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Ala Thr Arg Arg Arg Ser Ser Phe Gly Arg Gly Trp Arg Arg Arg Arg
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ttctccgcct ccgcgcgcgc cggctcatcg ccgccgcggt gttccaggac cagaagccga 360
aggagccagc aagcaaggga ggtgatgacg aggaggaggc gtacggcgag gtggaccgca 420
tcgtctccag ccgcacagtc agcagcccgg tgttcgcgga ggacggctcg gccaccgccg 480
ccgtcgccac ggagttcctg gtggagtgga aggacgggca cgagccgtcg tgggtgcccg 540
cggaggccat agccgcggac gtggtggccg agtacgagac gccgtggtgg acggcggcca 600
agaaggcgga ctcggaggcg ctggcggcgc tgctcgcgga cgagacgttg cggcgggacc 660
ccgacgcgga ggacgcgcag gggcgcaccg cggcgcactt cgccgcgggg ctggggtccg 720
aggagtgcct gcgcgcgctc ggcgcggctg gagcggacgt gggccgtcgg gagcgcgcgg 780
ggggcgggct cacgccgcta cacatggcgg tcgggtacgg ccgcgcgggc gccgtgcgcg 840
cgctgctgga gctgggcgcc gacccggagg cccccgacgg gcagggccgc acgccgctgg 900
agctggtcca ggaggtgctc gccagggcgc ccaagggcaa cccggcgacg ttccagcttc 960
ggcaggggct ggaggcggcg cagaaggagc tggagaaggc cgtgtacgag tgggccgagg 1020
tggagaaggt gatcgacggc cgcggcgaag gcaagtggcg ggagtacctg gtggagtggc 1080
gcgacggcgg cgagagggag tgggtgaagg cggcgtgggt ggcggaggac ctggtgagcg 1140
acttcgaggc cgggctggag tacgccgtgg ccgaggccgt gctcgacaag aggcaggcgg 1200
cgacagcgac ggcggaagag gaggacagct gggagtacct tgtcaaatgg gtcgacattg 1260
aggaggccac gtgggagccc gccgagaacg tggacaccga gctcgtgcag aagttcgagc 1320
agcagcagtc ggggtctgca ggcggtgatt gatggcggca gcactgcacc accgtcgccg 1380
caggtgatag agattacttg atgaa 1405
<210> 34
<211> 426
<212> PRT
<213> 玉米(Zea mays L.) B73(YGL-1)
<400> 34
Met Ala Trp Asp Thr Pro Ala Ser Arg Thr Gln Ser Pro Tyr Pro Leu
1 5 10 15
Ala His His Pro Ser Lys His Thr Thr Val Phe Arg Val Arg Ser Thr
20 25 30
Arg Ala Thr Thr Arg Asp Leu Pro Leu Val Thr Pro Met Glu Ala Val
35 40 45
Leu Arg His Pro Ser Leu Ser Arg Thr Arg Pro Pro Asn Leu Asn Pro
50 55 60
Pro Thr Thr Pro Ser Pro Ser Leu His Ala Pro Ser Leu Leu Arg Leu
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Leu Ile Ala Ala Ala Val Phe Gln Asp Gln Lys Pro
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ser Lys Gly Gly Asp Asp Glu Glu Glu Ala Tyr Gly
100 105 110
Glu Val Asp Arg Ile Val Ser Ser Arg Thr Val Ser Ser Pro Val Phe
115 120 125
Ala Glu Asp Gly Ser Ala Thr Ala Ala Val Ala Thr Glu Phe Leu Val
130 135 140
Glu Trp Lys Asp Gly His Glu Pro Ser Trp Val Pro Ala Glu Ala Ile
145 150 155 160
Ala Ala Asp Val Val Ala Glu Tyr Glu Thr Pro Trp Trp Thr Ala Ala
165 170 175
Lys Lys Ala Asp Ser Glu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ala Asp Glu Thr
180 185 190
Leu Arg Arg Asp Pro Asp Ala Glu Asp Ala Gln Gly Arg Thr Ala Ala
195 200 205
His Phe Ala Ala Gly Leu Gly Ser Glu Glu Cys Leu Arg Ala Leu Gly
210 215 220
Ala Ala Gly Ala Asp Val Gly Arg Arg Glu Arg Ala Gly Gly Gly Leu
225 230 235 240
Thr Pro Leu His Met Ala Val Gly Tyr Gly Arg Ala Gly Ala Val Arg
245 250 255
Ala Leu Leu Glu Leu Gly Ala Asp Pro Glu Ala Pro Asp Gly Gln Gly
260 265 270
Arg Thr Pro Leu Glu Leu Val Gln Glu Val Leu Ala Arg Ala Pro Lys
275 280 285
Gly Asn Pro Ala Thr Phe Gln Leu Arg Gln Gly Leu Glu Ala Ala Gln
290 295 300
Lys Glu Leu Glu Lys Ala Val Tyr Glu Trp Ala Glu Val Glu Lys Val
305 310 315 320
Ile Asp Gly Arg Gly Glu Gly Lys Trp Arg Glu Tyr Leu Val Glu Trp
325 330 335
Arg Asp Gly Gly Glu Arg Glu Trp Val Lys Ala Ala Trp Val Ala Glu
340 345 350
Asp Leu Val Ser Asp Phe Glu Ala Gly Leu Glu Tyr Ala Val Ala Glu
355 360 365
Ala Val Leu Asp Lys Arg Gln Ala Ala Thr Ala Thr Ala Glu Glu Glu
370 375 380
Asp Ser Trp Glu Tyr Leu Val Lys Trp Val Asp Ile Glu Glu Ala Thr
385 390 395 400
Trp Glu Pro Ala Glu Asn Val Asp Thr Glu Leu Val Gln Lys Phe Glu
405 410 415
Gln Gln Gln Ser Gly Ser Ala Gly Gly Asp
420 425
Claims (10)
1.玉米黄绿叶突变基因ygl-1，其特征在于：该基因的核苷酸序列为以下序列之一：
（1）如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
（2）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序列；
（3）在严格条件下，与(1)或（2）的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
（4）由于遗传密码子的简并性区别于（1）、（2）、（3）的核苷酸序列的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的玉米黄绿叶突变基因ygl-1所编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为以下序列之一：
（1）如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
（2）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个氨基酸的序列。
3.权利要求1所述的玉米黄绿叶突变基因ygl-1在玉米良种选育和杂交育种中的应用。
4.权利要求1所述的玉米黄绿叶突变基因ygl-1作为分子标记在玉米种质资源鉴定中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用玉米黄绿叶突变基因ygl-1的特异性引物，对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段大小，若只扩增出1405bp的条带，则该待测个体的基因型为野生型，若只扩增出1404bp的条带，则该待测个体的基因型为突变型，若同时扩增出两条带，则该待测个体的基因型为杂合型。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4所示。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的条件为：95℃5min，95℃45s，65℃45s，72℃90s，共30个循环，最后72℃10min，4℃forever。
8.用于扩增权利要求1所述的玉米黄绿叶突变基因ygl-1的引物，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4所示。
9.权利要求8所述的引物在鉴别玉米YGL-1基因位点的基因型中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用玉米黄绿叶突变基因ygl-1的特异性引物，对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段大小，若只扩增出1405bp的条带，则该待测个体的基因型为野生型，若只扩增出1404bp的条带，则该待测个体的基因型为突变型，若同时扩增出两条带，则该待测个体的基因型为杂合型。
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