CN102558321A - 植物耐低磷胁迫相关的蛋白AtLPT4及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了植物耐低磷胁迫相关的蛋白AtLPT4及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低磷胁迫相关的由1)衍生的蛋白质。将本发明的蛋白的编码基因AtLPT4在目的植物中，得到转基因植物。本发明得到的转基因植物表现磷营养性状。本发明的基因对培育耐低磷胁迫的植物新品种，以及植物对低磷耐受的研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种植物耐低磷胁迫相关的蛋白AtLPT4及其编码基因与应用。
背景技术
磷是植物必需的大量元素之一，参与植物的生长发育。植物细胞中的磷浓度一般在mM水平，而土壤磷浓度极低，一般低于10μM，因此植物经常面临低磷胁迫，土壤缺磷成为限制农业生产的重要限制因素。磷矿是不可再生的资源，大量施用磷肥会造成环境污染。因此，认识植物对低磷胁迫的反应机制，提高植物自身对低磷胁迫的耐受能力，进一步提高作物产量，已成为重要研究工作，倍受世界各国政府和植物及农业科学家的关注。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种典型的模式植物(其作用与实验鼠、果蝇等模式生物相当)，已被广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，约2.7万个基因。现在已知拟南芥基因组中含有超过1500个编码转录因子的基因，其中WRKY基因有74个，这些WRKY基因在植物响应低磷胁迫中的作用还不清楚。拟南芥的大多数基因在其他植物中都能找到与之同源的基因，有关拟南芥的绝大多数发现都能应用于其他植物的研究。以往的研究已经证明，对拟南芥的研究将帮助科学家找到提高农作物产量的方法。面对农作物生产中日益严重的土壤低磷胁迫问题，克隆调控植物响应低磷胁迫的转录因子基因并对其功能进行研究，对尽快培育抗低磷胁迫的作物品种有重要的实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐低磷胁迫相关的蛋白AtLPT4及其编码基因与应用。
本发明所提供的植物耐低磷胁迫相关的蛋白，名称为AtLPT4(Arabidopsis Low-Pistress Tolerant)，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0生态型，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低磷胁迫相关的由1)衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列2所示的蛋白序列由147个氨基酸残基组成。在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占42个，亲水氨基酸占32个，碱性氨基酸(Asp+Glu)占20个，酸性氨基酸(His+Arg+Lys)占25个，该蛋白质的分子量为17.2KD，等电点为9.21。
为了使1)中的AtLPT4分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列；为了使1)中的AtLPT4便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述2)中的AtLPT4可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的AtLPT4的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述植物耐低磷胁迫相关蛋白的编码基因(命名为AtLPT4)也属于本发明的保护范围。
植物耐低磷胁迫相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)编码序列如序列表中序列1所示；
2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码上述蛋白的基因；
3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码上述蛋白的基因。
其中，序列表中的序列1由444个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-444位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的AtLPT4蛋白。
上述2)或3)所述的基因具体可以是序列表中序列3。
上述序列表中序列3由1016个核苷酸组成，自序列3的5′端第254-505位核苷酸为第一个外显子，自序列3的5′端第608-799位核苷酸为第二个外显子。自序列3的5′端第506-607位核苷酸为第一个内含子。自序列3的5′端第1-253位核苷酸为5’UTR，自序列3的5′端第800-1016位核苷酸为3’UTR。
上述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
扩增上述AtLPT4基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述植物耐低磷胁迫相关蛋白的编码基因的表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。
含有上述植物耐低磷胁迫相关的蛋白的编码基因的重组载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有AtLPT4基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pBIB、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。
使用AtLPT4基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Super启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述重组载体具体的构建方法如下：是将上述植物耐低磷胁迫相关蛋白的编码基因插入pCAMBIA1300：Super载体的多克隆位点间构成的重组表达载体；
所述pCAMBIA1300：Super载体是将核苷酸序列如序列表中序列4的自5’端第113-1112位所示的Super启动子插入pCAMBIA1300质粒的HindIII和XbaI酶切位点之间构成的载体。
本发明的另一个目的是提供一种培育耐低磷胁迫性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育耐低磷胁迫性提高的转基因植物的方法，是将上述的植物耐低磷胁迫相关蛋白的编码基因(AtLPT4基因)转入目的植物中，得到耐低磷胁迫性能高于所述目的植物的转基因植物。
本发明的又一个目的是提供一种磷含量和/或生物量提高的转基因植物的方法。该方法是将上述的植物耐低磷胁迫相关蛋白的编码基因(AtLPT4基因)转入目的植物中，得到磷含量和/生物量高于所述目的植物的转基因植物。
上述生物量提高可以是目的植物的根部和/或冠部的干重增加。
上述磷含量提高可以是目的植物的根部和/或冠部磷含量增加。
具体地，上述植物耐低磷胁迫相关蛋白的编码基因可以是通过上述重组载体导入目的植物中。
携带有本发明的AtLPT4基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
上述目的植物可以是双子叶植物或单子叶植物，具体可为拟南芥。
实验证明：AtLPT4基因可以提高植物响应低磷胁迫的能力。本发明方法获得的AtLPT4过量表达株系：Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19，在这3个AtLPT4基因过量表达株系的叶和根中均过量表达；AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)在正常供磷(MS)和低磷(LP)培养基上均表现出较野生型磷营养高效表型，过量表达株系明显较野生型在生长上更有优势，具体表现为过量表达株系的地上部(叶)比野生型大、根的数量明显多于野生型；AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的冠部和根部单株磷含量都明显高于野生型(WT)的单株磷含量。
本发明的方法可用于培育耐低磷的植物新品种。本发明的基因对培育耐低磷新品种，以及植物对低磷耐受的研究具有重要意义，如利用本发明的基因可对该基因进行过量表达，从而提高植物对低磷的耐受能力。
附图说明
图1为AtLPT4基因过量表达株系的分子检测，图中A为冠部(叶)的检测结果，B为根部分的检测结果。
图2为野生型和AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)在正常供磷(MS)和低磷(LP)条件下的表型观察结果。
图3为野生型和AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的单株干重测定结果。
图4为野生型和AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的单株磷含量测定结果。
图5为低磷胁迫条件下AtLPT4基因的表达变化结果，图中A为冠部(叶)的检测结果，B为根部的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、转基因AtLPT4植物的获得及检测分析
一、转基因AtLPT4拟南芥的获得
1、cDNA的获得
提取10天拟南芥(Columbia型(Col-0生态型)，(购自美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC))幼苗总RNA、反转录为cDNA。以此cDNA为模板、利用分别设有XbaI和KpnI酶切位点的一对引物进行PCR扩增，得到植物耐低磷胁迫相关蛋白的基因AtLPT4的cDNA全长。引物序列如下：
Primer1：5′-gctctagaATGGAGGATAGGAGGTGTGA-3′(XbaI)；
Primer2：5′-ggggtaccTCATTCCTTCAAGCAAAAGGGA-3′(KpnI)。
采用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，扩增体系为50μL，含10×Pyrobest PCR缓冲液5.0μL，10mM dNTP mix 1.0μL，引物各1.0μL，Pyrobest酶0.5μL，模板3.0μL(0.1μg)，补充灭菌超纯水至50μL，反应体系在冰上进行操作。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性30s，56℃30s，72℃1.5min，循环数30个，72℃延伸10min。
将扩增片段用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收扩增片段，连接到pMD18-T载体，酶切、扩增、测序鉴定，测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，为本发明的与植物耐低磷胁迫相关的cDNA基因命名为AtLPT4，序列表中序列1的核苷酸序列由444个碱基组成，其ORF编码序列为自序列表中序列1的第1-444位核苷酸，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。将上述获得的正确的含有AtLPT4的重组载体命名为pMD18-AtLPT4。
2、基因组DNA的获得
提取10天拟南芥(Columbia型)幼苗总DNA，以此DNA为模板、利用一对引物进行PCR扩增，得到植物耐低磷胁迫相关基因的基因组DNA全长。引物序列如下：
Primer3：5′-GTTTGAAATTTGAATCCATT-3′；
Primer4：5′-CTTCTTTATGTTTGGTAATTTG-3′。
采用Takara公司的高保真的Pyrobest DNA聚合酶进行扩增，扩增体系为50μL，含10×pyrobest PCR缓冲液5.0μL，10mM dNTP mix 1.0μL，引物各1.0μL，Pyrobest酶0.5μL，模板3.0μL(0.1μg)，补充灭菌超纯水至50μL，反应体系在冰上进行操作。在PE 9700仪器上进行扩增，预变性5min，95℃变性30s，56℃30s，72℃1.5min，循环数30个，72℃延伸10min。
对PCR产物进行测序，得到1016bp的核苷酸片段，是具有序列表中序列3的核苷酸序列，为本发明的与植物耐低磷胁迫相关的AtLPT4基因组基因，将其命名为gAtLPT4。将gAtLPT4连接到pMD18-T载体得到的重组载体命名为pMD18-gAtLPT4。序列表中序列3由1016个核苷酸组成，自序列3的5′端第254-505位核苷酸为第一个外显子，自序列3的5′端第608-799位核苷酸为第二个外显子。自序列3的5′端第506-607位核苷酸为第一个内含子。自序列3的5′端第1-253位核苷酸为5’UTR，自序列3的5′端第800-1016位核苷酸为3’UTR。
3、重组载体的获得
将上述步骤1中得到的含有AtLPT4基因的重组载体pMD18-AtLPT4和pCAMBIA1300：Super载体，同时用内切酶XbaI和KpnI进行大体系酶切。将所切得的AtLPT4基因片段和线性化的pCAMBIA1300：Super质粒片段进行回收，连接，并测序验证，即获得验证正确的含有AtLPT4基因的重组载体并将其命名为Super：AtLPT4。
上述pCAMBIA1300：Super载体的构建方法为：利用引物aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT和tctagaCTAGAGTCGATTTGGT从质粒pMSP-1(GenBank号为EU181145)中扩增出核苷酸序列如序列表中序列4的自5’端第113-1112位所示的Super启动子；将扩增得到的Super启动子用HindIII和XbaI双酶切，回收Super启动子片段，插入到质粒pCAMBIA1300(GenBank号为FJ362601)的HindIII和XbaI酶切位点之间中，得到pCAMBIA1300：Super质粒。
4、得到转基因AtLPT4拟南芥
将上述步骤3中得到的Super：AtLPT4利用农杆菌转化侵染Columbia野生型拟南芥植株。从而获得AtLPT4过量表达T1代转Super：AtLPT4拟南芥植株。经过在含50μg/L潮霉素的MS培养基上筛选转Super：AtLPT4拟南芥阳性植株并进行分离比统计，在T3代即得到转Super：AtLPT4拟南芥单拷贝纯合株系，即AtLPT4过量表达株系。得到后续实验用AtLPT4过量表达株系为：Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19。
将野生型拟南芥(Columbia型)幼苗、过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)在MS培养基上萌发生长2周，取样，分别提取植株冠部(叶)和根两部分总RNA，总RNA的提取按Invitrogen Trizol Reagent的产品说明书进行。
将上述提取的总RNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳检查完整性后，用紫外分光光度计和电泳方法相结合作精确定量。然后分别取相同量的RNA进行电泳然后Northern杂交。Northern杂交的探针片段的获得方法如下：
以AtLPT4基因的cDNA全长产物为模板，用下述引物对进行扩增
Primer5：5′-ATGGAGGATAGGAGGTGTGA-3′；
Primer6：5′-TCATTCCTTCAAGCAAAAGGGA-3′。
PCR扩增出长度为444bp的AtLPT4基因全长作为探针。
检测结果如图1所示，图中A为冠部(叶)的检测结果，B为根部分的检测结果，可知AtLPT4基因在3个AtLPT4基因过量表达株系(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的叶和根中均过量表达。
二、检测分析
1、野生型和转AtLPT4基因植株在正常供磷(MS)和低磷(LP)条件下的表型观察
按照获得转AtLPT4基因株系的方法将空载体pCAMBIA1300：Super导入野生型拟南芥中，制备得到空载体对照。
将在MS培养基上萌发后生长一周的野生型拟南芥(Columbia型)、空载体对照和AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)拟南芥幼苗移入正常供磷(MS)和含有200μM Pi的低磷(LP)培养基(以正常MS培养基为基础，将Pi浓度由1.25mM调整为200μM，其它成分与正常MS培养基一致。正常MS培养基组成为：每升溶液含1650mg NH4NO3，1900mg KNO3，370mg MgSO4·7H2O，170mg KH2PO4，440mg CaCl2·2H2O，22.3mg MnSO4·4H2O，0.83mg KI，0.025mgCuSO4·5H2O，6.25mg H3BO5，0.025mg CoCl·6H2O，8.65mg ZnSO4·7H2O，0.25mgNa2MoO4·2H2O，27.8mg FeSO4·7H2O，37.3mg Na2EDTA)上继续生长10天，观察其性状。培养条件采用全日照光照培养，温度22℃，光强80μmol·m-2·s-1。
结果如图2(空载体对照与野生型对照的实验结果表型一致，故省略空载体对照结果)所示，在正常供磷(MS)和低磷(LP)培养基上生长14天后，AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)均表现出高于野生型对照和空载体对照的磷营养表型，过量表达株系明显较野生型和空载体对照生长有优势，表现为过量表达株系的地上部(叶)比野生型和空载体对照大、根的数量明显多于野生型和空载体对照。
2、干重测定
将野生型(WT)、空载体对照和AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)在MS培养基上生长14天，分根部和冠部取样并记录所取样品的株数。样品在80℃烘干过夜，然后称取干重。计算每株的干重。
结果如图3(空载体对照与野生型对照的实验结果表型一致，故省略空载体对照结果)所示，结果表明，在正常供磷条件下，AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的冠部和根部干重都明显高于野生型(WT)和空载体对照植株的干重。在正常供磷条件下，AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的冠部和根部干重较野生型明显增加，其中冠部干重增加76-147％，根部干重增加76-147％；在低磷处理(LP)条件下，AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的冠部和根部干重也较野生型明显增加，其中冠部干重增加38-95％，根部干重增加34-113％。说明AtLPT4过量表达后，导致植物生长有优势。
3、磷含量的测定
将野生型(WT)、空载体对照植株和AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)在MS培养基上生长14天，分根部和冠部取样。样品在80℃烘干过夜，然后在马福炉中进行灰化处理(300℃1小时，575℃6小时)。灰化后的样品用5mL 0.1N HCl浸提，浸提液用钒钼黄法进行磷含量测定。钒钼黄法方法具体如下所述：吸取定容后的提取液2.00mL放入10mL容量瓶中，加2滴二硝基酚指示剂，滴加6mol/L NaOH中和至溶液刚呈黄色，加入2.00mL钒钼酸铵试剂，用水定容10mL。15分钟后在波长450nm处进行测定，以空白溶液(空白试验的浸提液按上述步骤进行显色)调节仪器零点。标准曲线：准确吸取50g/L Pi标准液(利用KH2PO4和双蒸水配制标准液)0、0.2、0.5、1、1.5、2、3mL分别放入10mL容量瓶中，按上述步骤显色，即得0、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15μg/mL Pi(利用KH2PO4和双蒸水配制标准液)的标准系列溶液，与待测液一起测定，读取吸光度，然后绘制标准曲线和求直线回归方程。
结果如图4(空载体对照与野生型对照的实验结果表型一致，故省略空载体对照结果)所示，结果表明，在正常供磷条件下，AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的冠部和根部单株磷含量都明显高于野生型(WT)和空载体对照植株的单株磷含量。在正常供磷条件下，AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的冠部和根部单株磷含量较野生型明显增加，其中冠部单株磷含量增加66-119％，根部单株磷含量增加28-69％；在低磷处理(LP)条件下，AtLPT4过量表达植株(Super：AtLPT4-12、Super：AtLPT4-7和Super：AtLPT4-19)的冠部和根部单株磷含量也较野生型明显增加，其中冠部单株磷含量增加52-106％，根部单株磷含量增加24-92％。说明AtLPT4过量表达后，导致植物的单株磷含量增加。
4、低磷条件下AtLPT4基因的表达变化结果
将在MS培养基上萌发生长一周的野生型拟南芥(Columbia型)幼苗分别转移到低磷MS培养基(含10μM Pi，即以正常MS培养基为基础，将Pi浓度由1.25mM调整为10μM，其它成分与正常MS培养基一致)。正常MS培养基溶液每升组成为：1650mgNH4NO3，1900mg KNO3，370mg MgSO4·7H2O，170mg KH2PO4，440mg CaCl2·2H2O，22.3mg MnSO4·4H2O，0.83mg KI，0.025mg CuSO4·5H2O，6.25mg H3BO5，0.025mgCoCl·6H2O，8.65mg ZnSO4·7H2O，0.25mg Na2MoO4·2H2O，27.8mg FeSO4·7H2O，37.3mg Na2EDTA)上培养。培养条件采用全日照光照培养，温度22摄氏度，光强100μmol/(m2*s)。每隔一段时间的时间点分根冠取样，分别提取植株冠部(叶)和根两部分总RNA，总RNA的提取按Invitrogen Trizol Reagent的产品说明书进行。
将上述提取的总RNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳检查完整性后，用紫外分光光度计和电泳方法相结合作精确定量。然后分别取相同量的RNA进行电泳然后Northern杂交。Northern杂交的探针片段的获得方法如下：
以AtLPT4基因的cDNA全长产物为模板，用下述引物对进行扩增
Primer5：5′-ATGGAGGATAGGAGGTGTGA-3′；
Primer6：5′-TCATTCCTTCAAGCAAAAGGGA-3′。
PCR扩增出长度为444bp的AtLPT4基因全长作为探针。
低磷胁迫条件下AtLPT4基因表达结果如图5所示，图5结果表明，在冠部(叶)和根部AtLPT4基因都明显受低磷诱导表达。
Claims (10)
1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低磷胁迫相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)编码序列如序列表中序列1所示；
2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码上述蛋白的基因；
3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码上述蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述基因2)或3)的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
5.含有权利要求2-4中任一所述基因的转基因细胞系、重组菌或表达盒。
6.含有权利要求2-4中任一所述基因的重组载体。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的构建方法如下：是将权利要求2-4中任一所述的基因插入pCAMBIA1300：Super载体的多克隆位点间构成的重组表达载体；
所述pCAMBIA1300：Super载体的是将核苷酸序列如序列表中序列4的自5’端第113-1112位所示的Super启动子插入pCAMBIA1300质粒的HindIII和XbaI酶切位点之间构成的载体。
8.一种培育耐低磷胁迫性提高的转基因植物的方法，是将权利要求2-4中任一所述的基因导入目的植物中，得到的耐低磷胁迫性能高于所述目的植物的转基因植物。
9.一种培育磷含量或生物量提高的转基因植物的方法，是将权利要求2-4中任一所述的基因导入目的植物中，得到的磷含量或生物量高于所述目的植物的转基因植物。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：权利要求2-4中任一所述的基因是通过权利要求6或7所述的重组载体导入目的植物中。
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Cited By (2)
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| CN107435047A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-12-05 | 华南农业大学 | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SALANOUBAT M. ET AL.: "NM_111063.3", 《GENBANK》 * |
| YI-FANG CHEN ET AL.: "The WRKY6 Transcription Factor Modulates PHOSPHATE1 Expression in Response to Low Pi Stress in Arabidopsis", 《THE PLANT CELL》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107435047A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-12-05 | 华南农业大学 | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 |
| CN116854793A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-10-10 | 华南农业大学 | AtWRKY45基因在调控植物螯合素的合成与植物镉胁迫耐受性中的应用 |
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