CN104558128A - 与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关蛋白的编码基因ZmCCT能够显著提高植株对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性。

Description

与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
玉米茎腐病是世界各玉米产区普遍发生的重要土传病害，玉米进入乳熟期，整株叶片突然出现青灰色干枯，根部、茎基部呈现水渍状腐烂，致早枯，影响灌浆，降低千粒重。除了导致产量降低外，茎腐病还造成玉米倒伏，影响收获，同时对籽粒品质也有一定程度的影响。玉米茎腐病病原比较复杂，病原菌的种类及优势小种问题，国内外报道不尽一致，我国主要的致病菌是禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw.）和肿囊腐霉菌（Pythium inflatum Matth.）（龚士琛，闫漱琴，张瑞英等.玉米抗茎腐病育种研究进展.黑龙江农业科学，2004（4）：28-30.）。禾谷镰刀菌的腐生菌丝体及厚壁孢子在作物残茬上越冬，在玉米播后至抽雄吐丝期不断由根系侵入，病菌在植株体内蔓延扩展，玉米乳熟期达显症高峰，高温、高湿利于发病。目前在我国，玉米茎腐病已经发展为玉米生产中的第一大病害。江苏、河南、山东、四川和广西均有发生。近年四川省、河南省新乡地区发病严重。黄淮地区由于秋涝严重，造成茎腐病发病严重，给当地造成严重损失。经调查一般年份发病率10%～20%，个别年份和地区可达70%以上，减产25%～30%，重者甚至绝收。由于玉米茎腐病性状极为复杂，受环境影响很大，从而导致抗性测定的误差增大，因此，开展对玉米茎腐病的遗传基础研究相当困难。鉴于玉米茎腐病对经济和生态都有很重要的影响，培育抗病品种成为控制病害流行的有效手段。
玉米对茎腐病的抗性遗传机制，有两种不同的看法。一种认为玉米对茎腐病的抗性是数量性状，由一个主效基因与多个微效基因共同控制或由多个微效基因控制。Kappelman和Thompson（Kappelman AJ，Thompson DL.Inheritance of resistance toDiplodia stalk-rot in corn.Crop Sci.1966（6）：288-290.）研究结果表明，玉米对茎腐病的抗性受少数基因控制，加性效应和显性效应均起作用。Pè等（PèME,Gianfranceschi L,Taramino G,et al.Mapping quantitative trait loci(QTLs)for resistance to Gibberella zeae infectionin maize.Mol Gen Genet.1993(241):11-16）利用高抗茎腐病自交系B87和高感自交系33-16组配了150个F2：3家系，接种禾谷镰刀菌后对性状进行鉴定和分析，定位了5个抗禾谷镰刀菌茎腐病的QTL位点，分别位于第1、3、4、5和10号染色体上。杨琴、张东峰等（杨琴.玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病主效QTL的精细定位及克隆：[博士学位论文].北京：中国农业大学，2010）利用高抗玉米茎腐病自交系1145和高感自交系黄331组配后代群体，经接种禾谷镰刀菌后进行性状鉴定及分析，定位了2个QTL位点，分别位于1和10号染色体上。也有人认为玉米对茎腐病的抗性可能受一对完全显性单基因控制。一个抗禾谷镰刀菌茎腐病的单基因被定为在第6号染色体分子标记mmc0241和bnl3.03之间，遗传距离为5.0cM（Yang DE,Zhang CL,Zhang DS,Jin DM,Weng ML,Chen SJ,Nguyen H,Wang B Genetic analysis and molecular mapping of maize(Zea mays L.)stalk rot resistant gene Rfg1.Theor Appl Genet.2004(108):706-711）。
发明内容
本发明的目的是提供一种与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的蛋白，名称为ZmCCT，来源于高抗禾谷镰刀菌茎腐病的玉米（Zea mays L.）自交系品种1145，具体是如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的由序列1衍生的蛋白质。
序列表中序列1由238个氨基酸残基组成。
为了便于ZmCCT蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（a）中的ZmCCT蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的ZmCCT蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
编码所述ZmCCT蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述ZmCCT蛋白的基因（命名为ZmCCT）；所述ZmCCT基因是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列3的第5136-7682位所示的DNA分子；
4）在严格条件下与1）-3）中任一限定的DNA分子杂交且编码所述ZmCCT蛋白的DNA分子；
5）与1）-4）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述ZmCCT蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列表中的序列2由717个核苷酸组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第1-717位核苷酸，编码序列表中序列1所示的蛋白质（ZmCCT蛋白）。序列3由8147个核苷酸组成，第1-5135位为启动子序列；第5136-7682位为所述ZmCCT基因的基因组序列（第5136-5609位为第一外显子序列，第7440-7682位为第二外显子序列，第5610-7439位为内含子序列）；第7683-8147位为非翻译区序列。
整个序列3所示核苷酸序列组成的DNA片段也属于本发明的保护范围。
含有上述核酸分子或所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体为表达所述ZmCCT基因的载体，可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明中，所述重组表达载体中启动所述ZmCCT基因转录的启动子的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-5135位。
更为具体的，所述重组表达载体为在质粒pCAMBIA3301的多克隆位点间正向插入序列表中序列3所示DNA片段得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为Sac I。
所述表达盒由能够启动所述ZmCCT基因表达的启动子，所述ZmCCT基因，以及转录终止序列组成。
所述ZmCCT蛋白，或所述核酸分子，或所述DNA片段（序列3），或所述的重组载体、表达盒或重组菌在如下a1）或a2）中的应用也属于本发明的保护范围：
a1）调控植物抗禾谷镰刀菌茎腐病能力；
a2）选育抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高的植物品种。
在本发明的一个实施例中，所述调控植物抗禾谷镰刀菌茎腐病能力具体为提高植物抗禾谷镰刀菌茎腐病能力。所述选育抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高的植物品种的方法，具体可包括将所述ZmCCT蛋白表达量较高的植物作为亲本进行繁殖的步骤。
本发明的再一个目的是提供一种培育抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高的转基因植物的方法，具体可包括将编码所述ZmCCT蛋白的基因导入受体植物中得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比，抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高。
在上述方法中，所述ZmCCT蛋白在所述转基因植物（PCR鉴定阳性的植株）中的表达量高于所述受体植物中的表达量。编码所述ZmCCT蛋白的基因（ZmCCT基因）具体可是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列3的第5136-7682位所示的DNA分子；
4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA分子杂交且编码所述ZmCCT蛋白的DNA分子；
5）与1）-4）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述ZmCCT蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
在所述方法中，所述ZmCCT基因具体是通过含有序列表中序列3所示DNA片段的重组表达载体导入所述受体植物的。
在上述应用和方法中，所述抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高具体体现在：转入所述ZmCCT基因的植物（PCR鉴定阳性的转ZmCCT基因植物）后代中禾谷镰刀菌茎腐病抗性植株的比例升高。在本发明的一个实施例中，具体体现在所述PCR鉴定阳性的转ZmCCT基因植物的后代中禾谷镰刀菌茎腐病抗性植株的比例相对于所述受体植物升高。
在本发明中，上述所有的所述植物均可为单子叶植物，也可为双子叶植物。
在本发明的一个实施例中，所述植物为单子叶植物，为禾本科植物，为玉米，具体为玉米（Zea mays L.）品种HiⅡ。
扩增所述ZmCCT基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明所提供的ZmCCT基因能够提高转ZmCCT基因植株后代中抗禾谷镰刀菌茎腐病抗性植株的比例，同时后代中的转ZmCCT基因阳性植株与阴性植株相比，对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性有很大的提高。
附图说明
图1为T0代转ZmCCT基因玉米植株进行PCR鉴定的电泳图谱。泳道1为D2000Marker，从下到上的条带大小依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb以及2kb；泳道2、3、4、5、6、8、9、10、12、13、14、15、17、18、19、21、23、24、25和26为转基因未成功个体；泳道7、11、16、20、22为阳性转基因个体（条带大小为518bp）。
图2为转ZmCCT基因阳性植株（P）及阴性植株（N）的抗病表现。其中，A为植株表面，B为劈茎后。A和B中，P均代表转基因阳性植株，N均代表转基因阴性植株。
图3为T0代转ZmCCT基因玉米植株后代进行qRT-PCR鉴定的电泳图谱。泳道1为D2000Marker，上下两条带分别为250bp和100bp；泳道2、3、4、5、6、7为阳性转基因个体（P）；8、9、10、11、12、13为阴性转基因个体（N）；28和32为PCR反应循环数；GADPH为内参基因。
图4为T1代材料的抗病率统计结果。其中，P代表转基因阳性植株，N代表转基因阴性植株。
图5为T2/T3代材料的抗病率统计结果。其中，P代表转基因阳性植株，N代表转基因阴性植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
玉米（Zea mays L.）自交系1145：国家农作物种质保存中心，其编号为0L010346，该玉米为高抗禾谷镰刀菌茎腐病的品种（参见“Qin Yang,Guangming Yin,Yanling Guo,et al.A major QTL for resistance to Gibberella stalk rot in maize.Theor Appl Genet,(2010)121:673-687.”一文）。
玉米（Zea mays L.）品种HiⅡ：记载于“Germán Andrés González,María GabrielaPacheco,Cecilia Décima Oneto,et al.Somatic embryogenesis and plant regenerationcapacity in Argentinean maize(Zea mays L.)inbred lines.Electronic Journal ofBiotechnology,Jan15,2012”一文。
质粒pCAMBIA3301：记载于“Huixia Shou,Reid G.Palmer,Kan Wang.Irreproducibility of the Soybean Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure.PlantMolecular Biology Reporter,2002(20):325-334.”一文。
农杆菌LBA4404：Clontech公司的Agrobacterium tumefaciens LBA4404Electro-Cells，货号：9115。
禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw.）记载于“Qin Yang,Guangming Yin,Yanling Guo,et al.A major QTL for resistance to Gibberella stalk rot in maize.Theor ApplGenet,(2010)121:673-687.”一文。
实施例1、与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的基因ZmCCT的获得
一、与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的基因ZmCCT全长cDNA序列的获得
采用伤根土埋法（参见“宋佐衡等.保健栽培措施对玉米茎腐病控制效应研究,辽宁农业科学.1993年第05期”）将禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw.）分生孢子人工接种于处于抽雄期的高抗禾谷镰刀菌茎腐病的玉米（Zea mays L.）自交系1145的植株。接种后16h，取其叶片。使用Invitrogen公司提供的TriZol试剂提取总RNA。使用BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，利用基因特异的引物—5'RACE引物（5'GSPB）和3'RACE引物（3'GSPA）（见表1），以及试剂盒中提供的通用引物，并参照试剂盒说明书来扩增5’RACE产物和3’RACE产物，并对其测序。将得到的目的基因ZmCCT的5’端序列和3’端序列进行序列拼接，得到ZmCCT基因的全长cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
表1基因功能鉴定所用的所有引物序列信息
为了进一步证实上述拼接所得的ZmCCT基因全长cDNA序列（序列2）的正确性，设计如下用于扩增ZmCCT基因全长cDNA序列的特异性引物。
引物1：5'-ATGTCGTCGGGGCCAGCAGC-3'（序列表中序列2的第1-20位）；
引物2：5'-TTGCCAAGGTAACCGAATGA-3'（序列表中序列2的第698-717位的反向互补序列）。
以上述总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用上述引物1和引物2进行扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，经PCR扩增获得了长度约为720bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到pEASY-T1载体（北京全式金生物技术有限公司）上，进行测序鉴定。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列2完全相同，即ZmCCT基因的全长cDNA序列如序列表中序列2所示，编码序列表中序列1所示的蛋白，将该蛋白命名为ZmCCT。
二、与抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的基因ZmCCT基因组DNA序列的获得
采用伤根土埋法（参见“宋佐衡等.保健栽培措施对玉米茎腐病控制效应研究,辽宁农业科学.1993年第05期”）将禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schw.）分生孢子人工接种处于抽雄期的高抗禾谷镰刀菌茎腐病的玉米（Zea mays L.）自交系1145的植株。接种后16h，取其叶片，利用SDS碱式裂解法提取基因组DNA。
以上述获得的基因组DNA为模板，利用上述引物1和引物2进行PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，经PCR扩增获得了长度约为2600bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到pEASY-T1载体（北京全式金生物技术有限公司）上，进行测序鉴定。测序结果表明，该产物的核苷酸序列为序列表中序列3的第5136-7682位，其中第5136-5609位为第一外显子序列，第5610-7439位为内含子序列，第7440-7682位为第二外显子序列。
三、含有ZmCCT基因组DNA序列的基因组区段的获得
制备两端均带有限制性内切酶Sac I识别位点的“含有ZmCCT基因组DNA序列的基因组区段序列”，即“GAGCTC+序列3+GAGCTC”，记为DNA片段甲。将DNA片段甲连接到pEASY-T1载体（北京全式金生物技术有限公司）上，所得重组质粒命名为pEASY-ZmCCT。
对pEASY-ZmCCT进行测序鉴定。测序结果表明，插入pEASY-T1载体的外源基因序列正为“GAGCTC+序列3+GAGCTC”。其中，序列3的第1-5135位为启动子序列；第5136-7682位为所述ZmCCT基因的基因组序列（第5136-5609位为第一外显子序列，第7440-7682位为第二外显子序列，第5610-7439位为内含子序列）；第7683-8147位为非翻译区序列。
实施例2、转ZmCCT基因玉米的获得及其功能鉴定
一、重组表达载体pCAMBIA3301-ZmCCT的构建
用限制性内切酶Sac I酶切实施例1步骤三所得的重组质粒pEASY-ZmCCT，回收目的片段（含有ZmCCT基因组DNA序列的基因组区段，约8.1K），将其与同样经SacI酶切的pCAMBIA3301载体的骨架片段相连，获得重组质粒。
对所得的重组质粒进行Sac I酶切鉴定，将经鉴定表明含有大小约为8.1kb目的条带的重组质粒进行测序，将经测序表明在pCAMBIA3301载体的Sac I酶切位点处正向插入序列表中序列3的重组质粒命名为pCAMBIA3301-ZmCCT。
在重组表达载体pCAMBIA3301-ZmCCT中，启动ZmCCT基因组DNA序列转录的启动子为序列3的第1-5135位。
二、转ZmCCT基因玉米的获得
1、农杆菌的转化及鉴定
将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA3301-ZmCCT导入农杆菌LBA4404。具体操作如下：
（1）将5μl浓度为100ng/μl的pCAMBIA3301-ZmCCT质粒DNA加入到50μlLBA4404农杆菌感受态细胞中，轻弹混匀，并置于冰上30分钟。
（2）将（1）中的混合物在液氮中冷冻1分钟。
（3）将（2）中冷冻的混合物在37℃水浴条件下孵育5分钟。
（4）向（3）中得到的混合液中加入1ml的YEP液体培养基。28℃条件下，120rpm培养4小时。
（5）将（4）中得到的培养液1000rpm离心30秒，弃去上清液，得到底层细胞悬浮液。
（6）向（5）中得到的细胞悬浮液中加入100ul的YEP液体培养基，重悬细胞，并将重悬混合液涂在含有卡纳霉素和利福平的固体培养基上。
（7）将（6）中涂好的固体培养基在黑暗条件下，于28℃培养36-48小时。
（8）将（7）中培养得到的菌落进行菌体PCR鉴定及测序鉴定得到阳性转化菌株。
对转化后的重组农杆菌用引物3和引物4组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有序列3所示ZmCCT基因组区段（PCR目的条带大小约为8.1kb）的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pCAMBIA3301-ZmCCT。同时设置转入pCAMBIA3301空载体的农杆菌对照，将转入pCAMBIA3301空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pCAMBIA3301。
引物3：5'-GAGCTCTTGTTGCGACTTGT-3'（序列表中序列3的第1-20位）；
引物4：5'-GAGCTCGACAAACAGTACAT-3'（序列表中序列3的第8128-8147位的反向互补序列）。
2、重组农杆菌对玉米植株的转化及鉴定
将上述所得的重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA3301-ZmCCT（或空载体对照LBA4404/pCAMBIA3301）转化玉米（Zea mays L.）品种HiⅡ。
用事先活化好的重组农杆菌浸泡玉米愈伤组织，获得转化愈伤组织，转化后，用除草剂进行抗性筛选，获得转基因苗，即转入pCAMBIA3301-ZmCCT的玉米植株和转入pCAMBIA3301空载体的玉米植株。
进一步对上述获得的转基因玉米植株（T0代）进行PCR鉴定，筛选PCR阳性株系。提取转基因玉米植株的基因组DNA，作为模板，对转入pCAMBIA3301-ZmCCT的玉米植株进行PCR鉴定，以序列3所示ZmCCT基因组区段和pCAMBIA3301载体自身序列为靶基因，以引物对（LBCCT F/R）进行PCR扩增。同时设置未转基因的受体亲本玉米（Zea mays L.）品种HiⅡ作为对照。
LBCCT FP：5’-TAGCTAGCTCCACCACAGCA-3’（序列3的第7693-7712位）；
LBCCT RP：5’-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3’（该序列对应pCAMBIA3301载体上自带序列）。
对转入pCAMBIA3301-ZmCCT的玉米植株进行PCR鉴定的结果（图1）显示扩增出预期大小目的条带（518bp）的转基因玉米为阳性，其中获得的5个T0代转基因阳性植株记为Y3-1、Y3-14、Y3-18、Y3-23和Y3-25。
三、转ZmCCT基因玉米的抗病性鉴定
（一）实验方法
将步骤二获得的5个T0代转ZmCCT基因植株Y3-1、Y3-14、Y3-18、Y3-23和Y3-25，进行自交后得到5个转基因T1代群体，将T1代群体种植于北京上庄试验田，每个转基因T1代群体均种植137株，用于鉴定每个单株对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性性状，并结合基因型的分析来鉴定ZmCCT基因的功能。实验重复3次，结果取平均值。具体操作如下：
1、基因型分析及ZmCCT基因表达量测定：
（1）基因型分析
由于未纯合的转基因阳性植株在后代会发生分离，即后代群体中会出现转基因阳性以及阴性植株，这样可以把以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代群体分成两种基因型，即阳性（P）和阴性（N）。
采取PCR基因分型的方法，用pCAMBIA3301-ZmCCT载体特异的一对引物（LBCCT F/R，序列同上）PCR鉴定以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代群体的基因型，能够扩出条带（518bp）的个体为转基因阳性个体（P），不能扩出相应条带的个体为转基因阴性个体（N）。
（2）ZmCCT基因表达量测定
分别以步骤（1）转ZmCCT基因阳性的植株群体（P）和转ZmCCT基因阴性的植株群体（N）为实验材料。提取各实验材料的总RNA。使用反转录试剂盒（Fermentas），将RNA反转录成cDNA，存于-80℃备用。
采用试剂盒SYBR Premix EX Taq Kit（宝生物工程），按照试剂盒说明书进行qRT-PCR，检测ZmCCT基因的表达量。
正向引物：5’-ATGAGAACGACGACCAGCCT-3’（序列2的第320-339位）；
反向引物：5’-GACGACTGATCTACCGGCAT-3’（序列2的第553-572位的反向互补序列）。
反应体系：20μl。
反应程序：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，28或32个循环；72℃10min；5℃保温。
内参基因采用GADPH。内参基因的扩增引物为5’-ATCAACGGCTTCGGAAGGAT-3’和5’-CCGTGGACGGTGTCGTACTT-3’。
同时设置步骤二中鉴定得到的转入pCAMBIA3301空载体的玉米阳性植株作为空载体对照（CK），设置未转基因的受体亲本的玉米（Zea mays L.）品种HiⅡ作为亲本对照（WT）。
2、对禾谷镰刀菌茎腐病的抗性性状的分析：
采取土埋伤根的方法（参见“宋佐衡等.保健栽培措施对玉米茎腐病控制效应研究,辽宁农业科学.1993年第05期”），用禾谷镰刀菌对未纯合的转基因后代群体植株进行接菌处理，具体步骤：在玉米植株吐丝器后，在距离玉米植株5-10厘米处竖直向下切断部分毛细根，抛开土壤，埋入60-80克用玉米籽粒扩繁的禾谷镰刀菌，并浇水保湿。
进一步，对经步骤1鉴定为转ZmCCT基因阳性的植株群体（P）和转ZmCCT基因阴性的植株群体（N）分别进行抗病性植株比例统计。具体如下：用禾谷镰刀菌人工接种大约45天后，将玉米植株做劈茎处理，茎基部及根中空且有腐烂现象的认定为感病株，茎基部及根完整且正常的认定为抗病株（图2）。分别将转ZmCCT基因阳性的植株群体（P）和转ZmCCT基因阴性的植株群体（N）中抗病植株的比例计算出来。
同时设置步骤二中鉴定得到的转入pCAMBIA3301空载体的玉米阳性植株作为空载体对照（CK），设置未转基因的受体亲本的玉米（Zea mays L.）品种HiⅡ作为亲本对照（WT）。
另外，将经上述基因型分析鉴定为转基因阳性的T1代植株自交，获得T2代群体；将经上述基因型分析鉴定为转基因阳性的T2代植株自交，获得T3代群体。对T2代群体和T3代群体也采用如上的方法进行基因型分析和抗病性性状分析。
（二）实验结果
1、5个T0代转ZmCCT基因植株后代ZmCCT基因表达量测定
结果如图3所示，从图中可以看出，5个T0代转ZmCCT基因植株后代群体中，阳性转基因植株（P）的ZmCCT基因表达量远远高于阴性转基因材料（N）。而作为亲本对照（WT）和空载体对照（CK）的两玉米植株中ZmCCT基因表达量与阴性转基因材料（N）相比，基本一致，无统计学差异。
2、5个T0代转ZmCCT基因植株后代抗病性测定
结果显示：在T1代群体水平上（图4），Y3-1、Y3-23及Y3-25中阳性植株（P）的抗病植株比例相对于阴性植株（N）均有显著性的提高，其中Y3-1中阳性植株（P）的抗病植株比例较阴性植株（N）提高达33%，Y3-23中阳性植株（P）的抗病植株比例较阴性植株（N）提高达13%，Y3-25中阳性植株（P）的抗病植株比例较阴性植株（N）提高达10%。
在T2代群体水平上（图5），Y3-1、Y3-18、Y3-23及Y3-25中阳性植株（P）的抗病植株比例相对于阴性植株（N）均有显著性的提高，其中Y3-1中阳性植株（P）的抗病植株比例较阴性植株（N）提高达35%，Y3-18中阳性植株（P）的抗病植株比例较阴性植株（N）提高达17%，Y3-23中阳性植株（P）的抗病植株比例较阴性植株（N）提高达25%，Y3-25中阳性植株（P）的抗病植株比例较阴性植株（N）提高达9%。
选取T2代转基因阳性的Y3-23自交，获得T3代群体。结果显示，在T3代群体水平上（图5），Y3-23中阳性植株（P）的抗病植株比例相对于阴性植株（N）仍有显著性的提高，Y3-23中阳性植株（P）的抗病植株比例较阴性植株（N）提高达7%。
3、亲本对照及空载体对照抗病性测定
相比于以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代的鉴定结果（图4和图5），未转基因的玉米（Zea mays L.）品种HiⅡ（WT）中的抗病植株比例仅为5%，远低于以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代中的抗病植株比例。空载体对照的实验结果与亲本对照基本一致，无统计学差异。
综合以上1-3的结果，可见相对于未转基因的亲本对照和空载体对照，以上5个T0代转ZmCCT基因植株后代中的抗病植株比例大大提高，且后代中的阳性植株（P）中抗病植株比例远高于阴性植株（N），同时阳性植株（P）中ZmCCT基因的表达量也远高于阴性植株（N）。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗禾谷镰刀菌茎腐病相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）序列表中序列3的第5136-7682位所示的DNA分子；
4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
5）与1）-4）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.DNA片段，其核苷酸序列为序列表中序列3。
5.含有权利要求2或3所述核酸分子，或权利要求4所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；
所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子的核苷酸序列具体为序列3的第1-5135位。
7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4所述的DNA片段，或权利要求5或6所述的重组载体、表达盒或重组菌在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控植物抗禾谷镰刀菌茎腐病能力；
a2）选育抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高的植物品种。
8.一种培育抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入受体植物中得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比，抗禾谷镰刀菌茎腐病能力提高。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所述编码权利要求1所述蛋白质的基因是通过含有权利要求4所述DNA片段的重组载体导入所述受体植物的。
10.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
所述单子叶植物具体为禾本科植物；
所述禾本科植物具体为玉米。
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