CN103173424A - 一种可提高植物光合效率的蛋白rprp-1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可提高植物光合效率的蛋白RPRP-1及其编码基因与应用。该蛋白RPRP-1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物光合效率相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的蛋白RPRP-1可以提高植物的净光合速率、气孔导度和千粒重。本发明的蛋白RPRP-1编码基因将在单子叶植物中(水稻、小麦、玉米、牧草、冰草)等植物高光效育种中具有良好的应用前景。

Description

一种可提高植物光合效率的蛋白RPRP-1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可提高植物光合效率的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

粮食安全是关系我国国民经济发展、社会稳定的全局性重大战略问题。随着工业化、城镇化的发展以及人口的增加，我国粮食需求将呈刚性增长，而耕地减少、水资源短缺、气候变化等对粮食生产的约束日益突出，我国粮食供需将长期处于“紧平衡”状态，保障粮食安全面临严峻挑战。农作物的株型育种和杂种优势利用为我国粮食作物产量的提高，保障国民经济的快速发展做出了巨大贡献。在当前保障粮食安全作为我国长期国策的背景下，如何实现粮食作物产量水平的持续提升是横亘在我国社会经济、农业科技前进道路上的一道难题。

光合作用是决定作物产量最重要的因素之一，作物中90％以上的干重直接来源于光合作用。因此，光合作用效率的高低直接关系到作物的产量。植物的光合作用参数主要包括净光合速率、细胞间隙CO2浓度、蒸腾速率、气孔导度等，其中，净光合速率和气孔导度是光合效率的2个主要参数。

培育高光效作物是种植业的主要目标之一。当前，通过基因工程育种获得具有高光效品种是一种行之有效的方法。而该方法中最关键的技术瓶颈问题是与光合作用、光呼吸作用相关基因的筛选与功能发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种可提高植物光合效率的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的可提高植物光合效率的蛋白，名称为RPRP-1(RicePhotorespiration Related Protein)，来源于水稻(Oryza sativa L.sspnipponbare)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可提高植物光合效率的由1)衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由513个氨基酸残基组成。

为了便于RPRP-1蛋白的纯化，可在由序列表中SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述1)中的RPRP-1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的RPRP-1蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表1所示的标签的编码序列得到。上述2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码所述RPRP-1蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述RPRP-1蛋白的基因；所述RPRP-1基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID №：1第17-1555位的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1第17-1555位限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1618个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第17-1555位核苷酸，编码序列表中SEQ ID №：2所示的蛋白质(RPRP-1蛋白)。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述的重组表达载体具体可为图8所示的重组表达载体。图8所示的表达载体的载体骨架为pCambia2300，在载体骨架中先插入水稻肌动蛋白(Actinl)的启动子，再插入所述外源基因，外源基因由水稻肌动蛋白(Actinl)的启动子启动。

具体的，在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体按照包括如下步骤的方法制备得到：

(1)将所述水稻Actin启动子(其核苷酸序列可如序列表中SEQ ID №：3所示)序列插入到质粒pCambia2300的多克隆位点Kpn I之间，得到中间载体；

(2)将所述基因插入到所述中间载体的多克隆位点SmaI和Sa1I之间，得到所述重组表达载体。

所述表达盒由能够启动所述RPRP-1基因表达的启动子，所述RPRP-1基因，以及转录终止序列组成。

本发明的另一个目的是提供一种培育光合效率提高或千粒重增加的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育光合效率提高的转基因植物的方法是将上述任一所述的编码基因导入目的植物，得到光合效率或千粒重均高于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，所述编码基因是通过上述任一重组载体导入目的植物中。

上述方法中，所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物优选为水稻。

上述方法中，所述光合效率是由净光合速率和气孔导度两个参数体现的，具体光合效率高体现在净光合速率快和气孔导度大。

实验证明，本发明提供的RPRP-1基因与其编码的蛋白能够显著提高水稻的光合效率。将本发明所提供的RPRP-1基因导入野生型水稻日本晴中，获得转基因水稻，稳定遗传的9个转RPRP-1基因植株(Line1-9)，在正常生长状态下，转RPRP-1基因植株的光合效率要明显高于空载体对照植株。说明本发明对培育高育高光效水稻材料具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为水稻光合作用相关突变体的叶片图片。1：白化；2：黄化；3：失绿；4：条斑；5：野生型。

图2为叶色突变体GUS表达染色模式。1：未染上(白化)；2：维管束特异(失绿)；3：叶肉特异(白化)。

图3为潮霉素基因检测电泳图。M：1Kb分子量；P：阳性质粒；NT：阴性对照；1-9：为GUS染上色的阳性植株。

图4为T-DNA插入水稻基因组结构图(A)和RPRP-1基因与表型共分离电泳(B)。A图中T-DNA插入LOC_0s03g52840基因上游99bp。B图为表型与基因型对应图，其中He代表基因型为杂合型，HO代表基因型为突变纯合型，w代表基因型为野生纯合型。“+”代表表型为正常，“-”代表表型为突变体表型。

图5为RPRP-1基因的结构图。其中实框代表外显子，实线代表内含子。ATG和TAA代表起始和终止读码框。

图6为互补试验图。其中1，2代表2个转基因植株系，3代表转空载体shmt受体植株。

图7为互补载体RPRP-1-pCambia2300A结构图。抗性基因为NPTII基因，能使受体细胞获得抗Kan⁺抗性；CaMV35S是来源于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)的启动子，在双子叶植物中具有很强的活性，在禾本科植物中的效果也不错；Actin为目的基因启动子，RPRP-1为水稻的果聚糖丝氨酸羟甲基化转移酶编码的cDNA。

图8，其中A为转RPRP-1-pCambia2300A基因水稻T1代部分植株DNA的PCR分子检测的电泳图。其中，泳道1为DNA分子量标准，250bp Ladder；泳道2为空载体对照(转入空载体pCambia2300A)；泳道3为阳性对照(阳性质粒)；4-12为9个独立的阳性株系。B为部分转RPRP-1-pCambia2300A基因T2代阳性株系的RT-PCR表达分析。其中Actin基因为内参，1为转入空载体pCambia2300A的株系(空载体对照)，2-6为5个转RPRP-1-pCambia2300A基因株系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

水稻(Oryza sativa L.)品种日本晴：记载于“(A draft sequence of the ricegenome(Oryza sativa L.ssp.Japonica.Science.2002Apr5；296(5565)：92-100)”一文中，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。

pCambia2300载体：可购自Cambia，Queensland.Australia。

农杆菌AGL1：购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

实施例1、水稻光呼吸作用相关基因RPRP-1的获得

一、水稻光合作用相关突变体的筛选

对增强子T-DNA插入突变体库中T2代种子进行筛选，具体操作如下：每个独立系取20-25粒种子，用1％浓度(V/V)次氯酸钠溶液进行灭菌，摇晃10分钟，然后用自来水冲洗10分种，浸种催芽后，分别播种于土中(营养土：蛙石＝3：1)，种植于在温室(光周期16h/暗培养8h)，15天-30天观察苗期叶色变化。统计突变株系，具体表型涉及叶片白化、黄化、失绿、条斑叶等。(图1)

二、与水稻T-DNA插入共分离的突变体筛选、获得

剪取生长2周的突变体部分叶片，置入1.5ml离心管内染色，管内事先加配制好的GUS染液，37℃过夜，染色后加入95％乙醇脱色。统计所有突变体均能染上颜色的株系。共计筛选获得9个独立系与GUS基因共分离(图2)。提取突变体株系的DNA，用潮霉素基因(HPT)进行扩增，其中3个独立系均能扩增出目的基因HPT条带。

HPT1：5’-AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC-3’

HPT2：5’-TCIACACAGCCATCGGTCCAG-3’

PCR反应采用20uL体系：在PCR管内依次加入灭菌超纯水14.8uL、10XPCR溶液(含MgCl₂)、dNTP1.6uL(各2.5mM)、引物(HPT1和HPT2)各0.2uL(20mM)、DNA l uL、rTaq0.2uL(IU)。

PCR程序：95℃预变性3min；95℃变性30sec，58℃退火45sec；72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min，16℃保存。

取2uL PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。(图3)

三、与水稻光呼吸作用相关基因RPRP-1的克隆

基因克隆采取PCR-Walking方法。

接头长链：5’-CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT-3’

接头短链：5’-P-ACCTCCCC-NH₂-3’

接头引物(Apr1)：5’-GGATCCTAATACGAGTCACTATAGCGC-3’

接头引物(Apr2)：5’-CTATAgCgCTCgAgCggC-3’

T-DNA左侧引物(Lb1)：5’-CGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGC-3’

T-DNA左侧引物(Lb2)：5’-gTTCCTATAgggTTTCgCTCATgTgTTg-3’

经电泳检查，对获得清晰扩增条带的PCR产物，跑1％琼脂糖凝胶电泳，切带，回收产物，具体方法参照凝胶回收试剂盒操作说明(上海申能博彩)。

PCR验证预测基因(PRPR)与突变表型共分离

Serp1：5’-ggTTTgggAggTAgTggATTCg-3’

Serp2：5’-TCCTgCCTCTgggACCAACATC-3’

Ser1b3：5’-CggTCAATACACTACATggCgTg-3’

Serp1，Serp2：插入位点两侧引物，Serlb3：T-DNA左边界序列引物。

PCR反应采用20uL体系：在PCR管内依次加入灭菌超纯水14.8uL、10XPCR溶液(含MgCl₂)、dNTP1.6uL(各2.5mM)、引物各0.2uL(20mM)、DNA1uL、rTaq0.2uL(IU)。电泳如图4。

四、基因的扩增

以日本晴的eDNA为模板，以以下核苷酸序列为引物，进行PCR扩增。

SHMTf：TACCCGGGTCGCCGCTCGCCCACCAT(下划线为SmaI酶切位点)

SHMTr：ACGCGTCGACCACCTCAGGAATTCAGCTTGATG(下划线为SalI酶切位点)

将PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，上述PCR扩增得到的片段具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，共1618bp，其中编码区长1539bp，共编码513个氨基酸，该编码区有序列表中SEQ ID №：1中第17-1555位的核苷酸序列，将该具有序列表中SEQ ID №：1中第17-1555位的核苷酸序列的片段命名为RPRP-1。该RPRP-1全长eDNA编码序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸残基序列。

实施例2、本发明的RPRP-1及其编码基因的功能验证

一、RPRP-1的互补验证

1)取生长2周的野生型水稻日本晴的部分叶片，提取总RNA，反转录为eDNA，以此eDNA为模板，以实施例1中的SHMTr和SHMTf为引物，扩增完整的基因编码区，连入pEASY-T1simple载体，进行测序。

2)将水稻Actin启动子(其核苷酸序列可如序列表中SEQ ID №：3所示)序列插入到质粒pCambia2300的多克隆位点Kpn I之间，得到中间载体pCambia2300A；

3)将步骤1)中测序正确的包含有RPRP-1基因的核苷酸序列从pEASY-T1 simple载体酶切后连入pCambia2300A植物双元表达载体的多克隆位点SmaI和SalI之间，构建成互补载体，将鉴定表明正确的含有RPRP-1的重组表达载体命名为RPRP-1-pCambia2300A(图7)。最后经酶切鉴定正确后，导入农杆菌EHA105菌株，转化植物受体shmt材料，用于突变体互补回复实验。

设转空载体shmt受体植株为对照，结果见图6，转基因植株的株高、育性、叶色等均恢复，而转空载体shmt受体植株的相应表型均未恢复，表明RPRP-1基因能够恢复突变体shmt的生长发育。

二、过表达RPRP-1基因提高光合效率

本例以转化受体日本晴，作为示例，通过农杆菌介导的转化方法，将RPRP-1-pCambia2300A载体导入日本晴中，获得再生的转基因植株，即转RPRP-1-pCambia2300A植株，分别经DNA和RNA分子水平上的鉴定，获得9个独立的转基因RPRP-1-pCambia2300A植株，鉴定结果见图8。采用美国LI-COR公司的便携式光合仪LI-6400测定植株光合气体交换。以生育期一致、分蘖盛期的完全展开的成熟叶片为材料，测定光合作用参数。光合作用参数为净光合速率、气孔导度，测试结果见表2。

表2.转RPRP-1基因株系水稻、空载体、野生型水稻光合生理指标和农艺性状比较

表2中，wT表示野生型水稻；VC表示转pCambia2300A的空载体水稻；RP-1-RP-9为9个独立阳性转基因株系。

测试结果显示，转RPRP-1-pCambia2300A植株的净光合速率、气孔导度和千粒重比均比野生型植株和转空载体植株有明显的提高，这说明RPRP-1可明显提高水稻的光合效率。野生型植株和转空载体植株的光合效率无显著差异。

Claims (9)

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物光合效率相关的由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1第17-1555位的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1第17-1555位限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌；所述重组载体优选为重组表达载体或重组克隆载体。

5.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在提高植物光合效率中的应用。

6.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在培育光合效率提高的植物中的应用。

7.一种培育光合效率提高或千粒重增加的转基因植物的方法，是将权利要求2-3任一所述的编码基因导入目的植物，得到光合效率或千粒重均高于所述目的植物的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2-3任一所述的编码基因是通过权利要求4所述的重组载体导入目的植物中。

9.根据权利要求5或6任一所述的应用和权利要求7或8任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物优选为水稻。

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