CN112126658A - 植物过表达荧光素酶报告基因重组载体及构建方法、应用 - Google Patents

植物过表达荧光素酶报告基因重组载体及构建方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了植物过表达荧光素酶报告基因重组载体及构建方法、应用，涉及基因重构技术领域，所述重组载体含有pCAMBIA3301双元表达载体和插入片段；所述插入片段包括启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因；所述启动子的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示；所述多克隆位点的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。本发明还公开了重组载体的构建方法和应用。本发明公开的重组载体解决了现有的pCAMBIA3301双元表达载体在用于过表达的时候，启动子后没有合适的酶切位点，每次插入目的基因均需要在其5’端引入CaMV35S启动子的问题，简化了目的基因的插入步骤。

Description

植物过表达荧光素酶报告基因重组载体及构建方法、应用
技术领域
本发明基因重组技术领域，特别涉及植物过表达荧光素酶报告基因重组载体及构建方法、应用。
背景技术
pCAMBIA3301双元表达载体是进行农杆菌转化时最常用的植物表达载体之一，许多转基因研究所用的表达载体都以其为骨架。其质粒图谱见图1。
由pCAMBIA3301双元表达载体图谱可以明显看出，在多克隆位点上游没有任何启动子，因此难以应用于蛋白的过表达。该载体适合研究特定DNA顺式元件对报告基因的启动效果或增强效果，但是如果研究特定目的蛋白在植物体内的过表达时选用此系列的载体则显得非常不方便。每次在插入外源基因的时候，都必须在目的基因的之前加上CaMV35S(或被植物识别的其他)启动子，造成设计困难，难以方便快捷的插入外源基因。
发明内容
本申请的目的在于克服现有技术中pCAMBIA 3301双元表达载体用于表达植物蛋白时每次插入外源基因都需要加上启动子导致设计困难的问题，提供了植物过表达荧光素酶报告基因重组载体。
本申请还公开了植物过表达荧光素酶报告基因重组载体的构建方法。
本申请还公开了植物过表达荧光素酶报告基因重组载体的应用。
为了实现上述发明目的，本申请提供了以下技术方案：一种植物过表达荧光素酶报告基因重组载体，所述重组载体含有pCAMBIA3301双元表达载体和插入片段；所述插入片段包括启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因；所述启动子的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示；所述多克隆位点的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。
所述荧光素酶报告基因为萤火虫荧光素酶基因LUC；所述萤火虫荧光素酶基因LUC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.3所示。这一植物过表达荧光素酶报告基因重组载体命名为pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC；这一插入片段命名为35S-MCS-LUC；pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.5所示。
所述荧光素酶报告基因为海肾荧光素酶基因RLUC；所述海肾荧光素酶基因LUC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.4所示。这一植物过表达荧光素酶报告基因重组载体命名为pCAMBIA3301-35S-MCS-RLUC；这一插入片段命名为35S-MCS-RLUC。pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.6所示。
所述启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因依次连接，插入到pCAMBIA3301双元表达载体的BstE II酶切位点和EcoR I酶切位点之间。
上述公开的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体在pCAMBIA3301双元表达载体上插入启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因按照5’→3’方向拼接而成的基因片段得到含有启动子、多个酶切位点和荧光素酶报告基因的重组基因，解决了现有的pCAMBIA3301双元表达载体在用于过表达的时候，其原有的启动子后没有合适的酶切位点，每次插入目的基因均需要在5’端引入启动子的问题，简化了目的基因的插入步骤；并同时提供了质粒报告基因。同时，该重组载体插入的质粒报告基因采用荧光素酶报告基因，其可以直接在活体细胞中检测，省略了杀死细胞的步骤，使pCAMBIA3301双元表达载体的应用范围更广，不仅可以应用于研究启动子增强或减弱效果，还可以用于研究蛋白质的表达效果。
本申请还公开了植物过表达荧光素酶报告基因重组载体的制备方法，其具体包括以下步骤：
S1：全基因合成插入片段；设计插入片段的基因序列；并通过全基因合成法以5’→3’方向合成依次含有启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因的插入片段，并分别在启动子上游引入EcoR I，荧光素酶报告基因下游引入BstE II的酶切位点，再连接在pEASY载体上，得到中间载体；
S2：用BstE II和EcoR I双酶切pCAMBIA3301双元表达载体，回收得到pCAMBIA3301双元表达载体片段；回收的所述pCAMBIA3301双元表达载体片段为电泳结果中的8452bp片段；用BstE II和EcoR I双酶切中间载体，回收得到插入片段，并与所述pCAMBIA3301双元表达载体片段连接得到所述重组载体。
回收的35S-MCS-LUC基因片段为电泳结果中的2268bp的片段；回收的35S-MCS-RLUC基因片段为电泳结果中的1554bp的片段。
在上述制备方法中采用全基因合成启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因连接而成的插入片段，并以BstE II和EcoR I为酶切位点，分别用定向克隆的方式，双酶切含有插入片段的载体和pCAMBIA3301双元表达载体，并用连接酶连接回收的pCAMBIA3301双元表达载体的大片段和插入片段，得到重组载体，避免载体的自身环化。
所述连接酶为T4 DNA。
本发明还公开了含有pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC的宿主细胞；所述宿主细胞为大肠杆菌Top10细胞。
本发明还公开了含有pCAMBIA3301-35S-MCS-RLUC的宿主细胞；所述宿主细胞为大肠杆菌Top10细胞。
本发明还公开了pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC、pCAMBIA3301-35S-MCS-RLUC在植物原生质体细胞瞬时过表达或者转基因植株中过表达目的基因的应用。
所述pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC和pCAMBIA3301-35S-MCS-RLUC在植物原生质体细胞瞬时过表达或者转基因植株中过表达目的基因的应用均采用以下具体方法：
取待检测的植物活体组织，然后提取活体组织的原生质体，通过PEG介导法将pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC或pCAMBIA3301-35S-MCS-RLUC转化到原生质体细胞中瞬时表达，实现荧光素酶报告基因在植物活体细胞的瞬时表达。
与现有技术相比，本发明的具有以下有益效果：
本发明公开的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体以pCAMBIA3301双元表达载体为载体骨架，并在pCAMBIA3301双元表达载体的EcoR I和BstE II酶切位点之间插入启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因按照5’→3’方向拼接而成的基因片段得到含有启动子、多个酶切位点和荧光素酶报告基因的重组载体，解决了现有的pCAMBIA3301双元表达载体在用于过表达的时候，其原有的启动子后没有合适的酶切位点，每次插入目的基因均需要在其5’端引入CaMV35S启动子的问题，简化了目的基因的插入步骤；并同时提供了质粒报告基因。
同时，该重组载体插入的质粒报告基因采用荧光素酶报告基因，其可以直接在活体细胞中检测，省略了杀死细胞的步骤，使pCAMBIA3301双元表达载体的应用范围更广，不仅可以应用于研究启动子增强或减弱效果，还可以用于研究蛋白质的表达效果。同时，本申请公开的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体插入的插入片段还包括了含有多个酶切位点的多克隆位点，使重组载体应用范围更广，适用性更好。
附图说明
图1本发明实施例中公开的pCAMBIA3301的质粒图谱；
图2本发明实施例中公开的pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC的质粒图谱；
图3本发明实施例中公开的pCAMBIA3301-35S-MCS-RLUC的质粒图谱；
图4本发明实施例中pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC的质粒转入TOP10感受态细胞的PCR鉴定图。
图5本发明实施例中的测序图；
图6本发明实施例中通过PEG介导法将pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC转化到南芥叶片的原生质体细胞中瞬时表达结果图。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例使用的pCAMBIA3301双元表达载体购自武汉淼灵生物科技有限公司；所述T4 DNA连接酶购自ThermoFisher；限制性内切酶购自ThermoFisher；TOP10制备试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。
TOP10感受态细胞制备：
取保存的TOP10保存菌种在空白的LB固体培养基上划线培养，取单菌落用LB液体培养基在37℃、220rpm条件下摇菌扩繁12～16h；按照每瓶0.5mL的量将菌液加入装有60mL2×YT培养基的锥形瓶中，继续摇菌扩繁直至菌液OD值为0.35～0.4后；在冰上按每管50mL的量将锥形瓶中的菌液加入离心管内，并在4℃、4000rmp的条件下离心10min，去掉上清，再加入10mL浓度为0.1mol/L且预冷的CaCl2溶液，并在4℃、4000rmp的条件下继续离心10min，去掉上清，再加入2mL浓度为0.1mol/L且预冷的CaCl2溶液；然后每管加入质量分数为50％的灭菌甘油，使得每管中甘油的浓度均为5％，再按照100μL/管的量分装到1.5ml EP管中于-80℃保存。
实施例1
植物过表达荧光素酶报告基因重组载体pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC的制备
S1：设计插入片段的基因序列；并通过全基因合成法以5’→3’方向合成依次含有启动子、多克隆位点、萤火虫荧光素酶报告基因LUC的插入片段，并分别在启动子上游引入EcoR I，荧光素酶报告基因下游引入BstE II的酶切位点，再连接在pEASY载体上，得到中间载体；
S2：用BstE II限制性内切酶、EcoR I限制性内切酶双酶在Buffer O缓冲溶液的条件下对pCAMBIA3301双元表达载体进行双酶切3h，并用琼脂糖凝胶电泳得到胶条，切胶回收得到8452bp片段，即为所需的pCAMBIA3301双元表达载体片段；同样的，用BstE II限制性内切酶和EcoR I限制性内切酶在Buffer O缓冲溶液的条件下对含有插入片段的pEASY载体进行双酶切3h，并用琼脂糖凝胶电泳得到胶条，切胶回收得到2268bp片段，即为所需的插入片段；
取1μL的T4 Buffer、0.5μL T4连接酶溶液加入5.5μL的ddH2O中，并加入上述获得的pCAMBIA3301双元表达载体片段、插入片段，在16℃条件下连接12～16h，得到连接得到pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC，其质粒谱图如图2所示。
实施例2
植物过表达荧光素酶报告基因重组载体pCAMBIA3301-35S-MCS-RLUC的制备
S1：设计插入片段的基因序列；并通过全基因合成法以5’→3’方向合成依次含有启动子、多克隆位点、海肾荧光素酶基因RLUC的插入片段，并分别在启动子上游引入EcoRI，荧光素酶报告基因下游引入BstE II的酶切位点，再连接在pEASY载体上，得到中间载体；
S2：用BstE II限制性内切酶、EcoR I限制性内切酶双酶在Buffer O缓冲溶液的条件下对pCAMBIA3301双元表达载体进行双酶切3h，并用琼脂糖凝胶电泳得到胶条，切胶回收得到8452bp片段，即为所需的pCAMBIA3301双元表达载体片段；同样的，用BstE II限制性内切酶和EcoR I限制性内切酶在Buffer O缓冲溶液的条件下对含有插入片段的pEASY载体进行双酶切3h，并用琼脂糖凝胶电泳得到胶条，切胶回收得到1554bp片段，即为所需的插入片段；
取1μL的T4 Buffer、0.5μL T4连接酶溶液加入5.5μL的ddH2O中，并加入上述获得的pCAMBIA3301双元表达载体片段、插入片段，在16℃条件下连接12～16h，得到连接得到pCAMBIA3301-35S-MCS-RLUC，其质粒谱图如图3所示。
实施例3
根据插入片段的萤火虫荧光素酶报告基因设计PCR扩增引物，其PCR扩增引物序列分别为：
F：GAATTCCATGGAGTCAAAGATTCAAAT
R：GGTNACCTTACACGGCGATCTTTCC
取100μL的TOP10感受态细胞，加入实施例1制备的1μL pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC质粒，然后混合均匀混匀，确保不产生气泡，在冰上反应20～30min，在42℃水浴90s，再放在冰中2min；然后加入到650-800μL LB液体培养基中，在37℃，220rpm条件下培养1h；取含有抗生素的固体LB培养平板，取菌液涂板，并将剩余菌液4℃保存。
按照0.2μL的引物、5μL的2×TaqmasterMix、1μL转化后的菌液、3.8μL的ddH2O配制PCR体系，并加入干净的EP管中，再按照10μL每管的量分装到PCR管中。在含有抗性的平板上分好区域，在超净工作台用枪头挑取单菌落，转移至20μLddH2O中，混匀后取1微升加入PCR反应体系进行检测，其鉴定结果如图4所示。根据鉴定结果选取双阳性菌斑，并摇菌提取质粒，送测序公司进行测序验证，其测序图如图5所示。
实施例4
通过PEG介导法将pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC转化到南芥叶片的原生质体细胞中瞬时表达
取4周龄生长良好的拟南芥叶片切1mm宽细条，置于甘露醇溶液中浸泡，并用酶解体系将浸泡后的细条在23℃、40～50rmp的条件下酶解3h，过筛离心得到沉淀，并用预冷的W5溶液轻柔洗涤，再离心得到沉淀，然后继续用预冷的W5溶液轻柔洗涤，然后，冰上放置30min；然后离心得到沉淀，并用MMG溶液重悬得到原生质体；
取实施例1制备的pCAMBIA3301-35S-MCS-LUC质粒于EP管中，然后加入上述得到原生质体，轻柔混匀后加入PEG/Ca溶液，轻柔混匀，放置15min；再加入W5溶液，颠倒混匀，在23℃，100g条件下离心2min，去掉上层清液，再分两次加入混匀WI溶液混匀，将混合液体置于六孔板内，在23℃、弱光条件下孵育6～18h，然后离心，再荧光观察。
W5：2mM pH5.7的MES溶液中含154mM NaCl，125mM CaCl2和5mM KCl。
PEG/Ca：20-40％PEG4000溶液中含0.2M甘露醇和100mM CaCl2。
WI：4mM pH5.7的MES溶液中含0.5M甘露醇和20mM的KCl。
MMG：4mM pH5.7的MES溶液中0.4M甘露醇和15mM的MgCl2。
并以南芥叶片的原生质体细胞为空白对照例，其荧光观察结果如图6所示。
本申请在原有的pCAMBIA3301载体基础上改建了35S、MCS和报告基因序列，形成含有启动子、多克隆位点、荧光素酶报告基因的重组载体，能够方便的在多克隆位点处插入目的基因，并同荧光素酶报告基因(如LUC、RLUC)进行融合表达。本申请公开的重组载体在植物体外，如原生质体当中可以用于快速验证体外蛋白功能，蛋白相互作用；在植物体内，可以用于观察过表达水平，验证体内蛋白功能等。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002712796080000071
Figure BDA0002712796080000081
Figure BDA0002712796080000091
Figure BDA0002712796080000101
Figure BDA0002712796080000111
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Figure BDA0002712796080000161
Figure BDA0002712796080000171
Figure BDA0002712796080000181
Figure BDA0002712796080000191
Figure BDA0002712796080000201
Figure BDA0002712796080000211
Figure BDA0002712796080000221
Figure BDA0002712796080000231
序列表
<110>四川轻化工大学
<120>植物过表达荧光素酶报告基因重组载体及构建方法、应用
<160>6
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>346
<212>DNA
<213>人工序列（Artificial sequence）
<400>1
TGAGACTTTT CAACAAAGGG TAATATCCGG AAACCTCCTC GGATTCCATT 50
GCCCAGCTAT CTGTCACTTT ATTGTGAAGA TAGTGGAAAA GGAAGGTGGC 100
TCCTACAAAT GCCATCATTG CGATAAAGGA AAGGCCATCG TTGAAGATGC 150
CTCTGCCGAC AGTGGTCCCA AAGATGGACC CCCACCCACG AGGAGCATCG 200
TGGAAAAAGA AGACGTTCCA ACCACGTCTT CAAAGCAAGT GGATTGATGT 250
GATATCTCCA CTGACGTAAG GGATGACGCA CAATCCCACT ATCCTTCGCA 300
AGACCCTTCC TCTATATAAG GAAGTTCATT TCATTTGGAG AGAACA 346
<210>2
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列（Artificial sequence）
<400>2
GGATCCAGAT CTGAGCTCTC TAGAACTAGT GACGTCCCCG GGCTGCAGAA 50
GCTT 54
<210>3
<211>1653
<212>DNA
<213>人工序列（Artificial sequence）
<400>3
ATGGAAGACG CCAAAAACAT AAAGAAAGGC CCGGCGCCAT TCTATCCGCT 50
GGAAGATGGA ACCGCTGGAG AGCAACTGCA TAAGGCTATG AAGAGATACG 100
CCCTGGTTCC TGGAACAATT GCTTTTACAG ATGCACATAT CGAGGTGGAC 150
ATCACTTACG CTGAGTACTT CGAAATGTCC GTTCGGTTGG CAGAAGCTAT 200
GAAACGATAT GGGCTGAATA CAAATCACAG AATCGTCGTA TGCAGTGAAA 250
ACTCTCTTCA ATTCTTTATG CCGGTGTTGG GCGCGTTATT TATCGGAGTT 300
GCAGTTGCGC CCGCGAACGA CATTTATAAT GAACGTGAAT TGCTCAACAG 350
TATGGGCATT TCGCAGCCTA CCGTGGTGTT CGTTTCCAAA AAGGGGTTGC 400
AAAAAATTTT GAACGTGCAA AAAAAGCTCC CAATCATCCA AAAAATTATT 450
ATCATGGATT CTAAAACGGA TTACCAGGGA TTTCAGTCGA TGTACACGTT 500
CGTCACATCT CATCTACCTC CCGGTTTTAA TGAATACGAT TTTGTGCCAG 550
AGTCCTTCGA TAGGGACAAG ACAATTGCAC TGATCATGAA CTCCTCTGGA 600
TCTACTGGTC TGCCTAAAGG TGTCGCTCTG CCTCATAGAA CTGCCTGCGT 650
GAGATTCTCG CATGCCAGAG ATCCTATTTT TGGCAATCAA ATCATTCCGG 700
ATACTGCGAT TTTAAGTGTT GTTCCATTCC ATCACGGTTT TGGAATGTTT 750
ACTACACTCG GATATTTGAT ATGTGGATTT CGAGTCGTCT TAATGTATAG 800
ATTTGAAGAA GAGCTGTTTC TGAGGAGCCT TCAGGATTAC AAGATTCAAA 850
GTGCGCTGCT GGTGCCAACC CTATTCTCCT TCTTCGCCAA AAGCACTCTG 900
ATTGACAAAT ACGATTTATC TAATTTACAC GAAATTGCTT CTGGTGGCGC 950
TCCCCTCTCT AAGGAAGTCG GGGAAGCGGT TGCCAAGAGG TTCCATCTGC 1000
CAGGTATCAG GCAAGGATAT GGGCTCACTG AGACTACATC AGCTATTCTG 1050
ATTACACCCG AGGGGGATGA TAAACCGGGC GCGGTCGGTA AAGTTGTTCC 1100
ATTTTTTGAA GCGAAGGTTG TGGATCTGGA TACCGGGAAA ACGCTGGGCG 1150
TTAATCAAAG AGGCGAACTG TGTGTGAGAG GTCCTATGAT TATGTCCGGT 1200
TATGTAAACA ATCCGGAAGC GACCAACGCC TTGATTGACA AGGATGGATG 1250
GCTACATTCT GGAGACATAG CTTACTGGGA CGAAGACGAA CACTTCTTCA 1300
TCGTTGACCG CCTGAAGTCT CTGATTAAGT ACAAAGGCTA TCAGGTGGCT 1350
CCCGCTGAAT TGGAATCCAT CTTGCTCCAA CACCCCAACA TCTTCGACGC 1400
AGGTGTCGCA GGTCTTCCCG ACGATGACGC CGGTGAACTT CCCGCCGCCG 1450
TTGTTGTTTT GGAGCACGGA AAGACGATGA CGGAAAAAGA GATCGTGGAT 1500
TACGTCGCCA GTCAAGTAAC AACCGCGAAA AAGTTGCGCG GAGGAGTTGT 1550
GTTTGTGGAC GAAGTACCGA AAGGTCTTAC CGGAAAACTC GACGCAAGAA 1600
AAATCAGAGA GATCCTCATA AAGGCCAAGA AGGGCGGAAA GATCGCCGTG 1650
TAA 1653
<210>4
<211>939
<212>DNA
<213>人工序列（Artificial sequence）
<400>4
ATGACCAGCA AAGTGTATGA TCCGGAACAG CGCAAACGCA TGATTACCGG 50
CCCGCAGTGG TGGGCGCGCT GCAAACAGAT GAACGTGCTG GATAGCTTTA 100
TTAACTATTA TGATAGCGAA AAACATGCGG AAAACGCGGT GATTTTTCTG 150
CATGGCAACG CGGCGAGCAG CTATCTGTGG CGGCATGTGG TGCCGCATAT 200
TGAACCAGTG GCGCGCTGCA TTATTCCGGA TCTGATTGGC ATGGGCAAAA 250
GCGGCAAAAG CGGCAACGGC AGCTATCGCC TGCTGGATCA TTATAAATAT 300
CTGACCGCGT GGTTTGAACT GCTGAACCTG CCGAAAAAAA TTATTTTTGT 350
GGGCCATGAT TGGGGCGCGT GCCTGGCGTT TCATTATAGC TATGAACATC 400
AGGATAAAAT TAAAGCGATT GTGCACGCGG AAAGCGTGGT GGATGTGATT 450
GAAAGCTGGG ATGAATGGCC GGATATTGAA GAAGATATTG CGCTGATTAA 500
AAGCGAAGAA GGCGAAAAAA TGGTGCTGGA AAACAACTTT TTTGTGGAAA 550
CCATGCTGCC GAGCAAAATT ATGCGCAAAC TGGAACCGGA AGAATTTGCG 600
GCGTATCTGG AACCGTTTAA AGAAAAAGGC GAAGTGCGCC GCCCGACCCT 650
GAGCTGGCCG CGCGAAATTC CGCTGGTGAA AGGCGGCAAA CCGGATGTGG 700
TCCAGATTGT GCGCAACTAT AACGCGTATC TGCGCGCGAG CGATGATCTG 750
CCGAAAATGT TTATTGAAAG CGATCCGGGC TTTTTTAGCA ACGCGATTGT 800
GGAAGGCGCG AAAAAATTTC CGAACACCGA ATTTGTGAAA GTGAAGGGCC 850
TGCATTTTAG CCAGGAAGAT GCGCCGGATG AAATGGGCAA ATATATTAAG 900
AGCTTTGTGG AACGCGTGCT GAAAAACGAA CAGGGCTAG 939
<210>5
<211>10706
<212>DNA
<213>人工序列（Artificial sequence）
<400>5
GAATTCCATG GAGTCAAAGA TTCAAATAGA GGACCTAACA GAACTCGCCG 50
TAAAGACTGG CGAACAGTTC ATACAGAGTC TCTTACGACT CAATGACAAG 100
AAGAAAATCT TCGTCAACAT GGTGGAGCAC GACACACTTG TCTACTCCAA 150
AAATATCAAA GATACAGTCT CAGAAGACCA AAGGGCAATT GAGACTTTTC 200
AACAAAGGGT AATATCCGGA AACCTCCTCG GATTCCATTG CCCAGCTATC 250
TGTCACTTTA TTGTGAAGAT AGTGGAAAAG GAAGGTGGCT CCTACAAATG 300
CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCCATCGT TGAAGATGCC TCTGCCGACA 350
GTGGTCCCAA AGATGGACCC CCACCCACGA GGAGCATCGT GGAAAAAGAA 400
GACGTTCCAA CCACGTCTTC AAAGCAAGTG GATTGATGTG ATATCTCCAC 450
TGACGTAAGG GATGACGCAC AATCCCACTA TCCTTCGCAA GACCCTTCCT 500
CTATATAAGG AAGTTCATTT CATTTGGAGA GAACACGGGG GACTCTTGAC 550
CATGGGATCC AGATCTGAGC TCTCTAGAAC TAGTGACGTC CCCGGGCTGC 600
AGAAGCTTAT GGAAGACGCC AAAAACATAA AGAAAGGCCC GGCGCCATTC 650
TATCCGCTGG AAGATGGAAC CGCTGGAGAG CAACTGCATA AGGCTATGAA 700
GAGATACGCC CTGGTTCCTG GAACAATTGC TTTTACAGAT GCACATATCG 750
AGGTGGACAT CACTTACGCT GAGTACTTCG AAATGTCCGT TCGGTTGGCA 800
GAAGCTATGA AACGATATGG GCTGAATACA AATCACAGAA TCGTCGTATG 850
CAGTGAAAAC TCTCTTCAAT TCTTTATGCC GGTGTTGGGC GCGTTATTTA 900
TCGGAGTTGC AGTTGCGCCC GCGAACGACA TTTATAATGA ACGTGAATTG 950
CTCAACAGTA TGGGCATTTC GCAGCCTACC GTGGTGTTCG TTTCCAAAAA 1000
GGGGTTGCAA AAAATTTTGA ACGTGCAAAA AAAGCTCCCA ATCATCCAAA 1050
AAATTATTAT CATGGATTCT AAAACGGATT ACCAGGGATT TCAGTCGATG 1100
TACACGTTCG TCACATCTCA TCTACCTCCC GGTTTTAATG AATACGATTT 1150
TGTGCCAGAG TCCTTCGATA GGGACAAGAC AATTGCACTG ATCATGAACT 1200
CCTCTGGATC TACTGGTCTG CCTAAAGGTG TCGCTCTGCC TCATAGAACT 1250
GCCTGCGTGA GATTCTCGCA TGCCAGAGAT CCTATTTTTG GCAATCAAAT 1300
CATTCCGGAT ACTGCGATTT TAAGTGTTGT TCCATTCCAT CACGGTTTTG 1350
GAATGTTTAC TACACTCGGA TATTTGATAT GTGGATTTCG AGTCGTCTTA 1400
ATGTATAGAT TTGAAGAAGA GCTGTTTCTG AGGAGCCTTC AGGATTACAA 1450
GATTCAAAGT GCGCTGCTGG TGCCAACCCT ATTCTCCTTC TTCGCCAAAA 1500
GCACTCTGAT TGACAAATAC GATTTATCTA ATTTACACGA AATTGCTTCT 1550
GGTGGCGCTC CCCTCTCTAA GGAAGTCGGG GAAGCGGTTG CCAAGAGGTT 1600
CCATCTGCCA GGTATCAGGC AAGGATATGG GCTCACTGAG ACTACATCAG 1650
CTATTCTGAT TACACCCGAG GGGGATGATA AACCGGGCGC GGTCGGTAAA 1700
GTTGTTCCAT TTTTTGAAGC GAAGGTTGTG GATCTGGATA CCGGGAAAAC 1750
GCTGGGCGTT AATCAAAGAG GCGAACTGTG TGTGAGAGGT CCTATGATTA 1800
TGTCCGGTTA TGTAAACAAT CCGGAAGCGA CCAACGCCTT GATTGACAAG 1850
GATGGATGGC TACATTCTGG AGACATAGCT TACTGGGACG AAGACGAACA 1900
CTTCTTCATC GTTGACCGCC TGAAGTCTCT GATTAAGTAC AAAGGCTATC 1950
AGGTGGCTCC CGCTGAATTG GAATCCATCT TGCTCCAACA CCCCAACATC 2000
TTCGACGCAG GTGTCGCAGG TCTTCCCGAC GATGACGCCG GTGAACTTCC 2050
CGCCGCCGTT GTTGTTTTGG AGCACGGAAA GACGATGACG GAAAAAGAGA 2100
TCGTGGATTA CGTCGCCAGT CAAGTAACAA CCGCGAAAAA GTTGCGCGGA 2150
GGAGTTGTGT TTGTGGACGA AGTACCGAAA GGTCTTACCG GAAAACTCGA 2200
CGCAAGAAAA ATCAGAGAGA TCCTCATAAA GGCCAAGAAG GGCGGAAAGA 2250
TCGCCGTGTA AGGTGACCAG CTCGAATTTC CCCGATCGTT CAAACATTTG 2300
GCAATAAAGT TTCTTAAGAT TGAATCCTGT TGCCGGTCTT GCGATGATTA 2350
TCATATAATT TCTGTTGAAT TACGTTAAGC ATGTAATAAT TAACATGTAA 2400
TGCATGACGT TATTTATGAG ATGGGTTTTT ATGATTAGAG TCCCGCAATT 2450
ATACATTTAA TACGCGATAG AAAACAAAAT ATAGCGCGCA AACTAGGATA 2500
AATTATCGCG CGCGGTGTCA TCTATGTTAC TAGATCGGGA ATTAAACTAT 2550
CAGTGTTTGA CAGGATATAT TGGCGGGTAA ACCTAAGAGA AAAGAGCGTT 2600
TATTAGAATA ACGGATATTT AAAAGGGCGT GAAAAGGTTT ATCCGTTCGT 2650
CCATTTGTAT GTGCATGCCA ACCACAGGGT TCCCCTCGGG ATCAAAGTAC 2700
TTTGATCCAA CCCCTCCGCT GCTATAGTGC AGTCGGCTTC TGACGTTCAG 2750
TGCAGCCGTC TTCTGAAAAC GACATGTCGC ACAAGTCCTA AGTTACGCGA 2800
CAGGCTGCCG CCCTGCCCTT TTCCTGGCGT TTTCTTGTCG CGTGTTTTAG 2850
TCGCATAAAG TAGAATACTT GCGACTAGAA CCGGAGACAT TACGCCATGA 2900
ACAAGAGCGC CGCCGCTGGC CTGCTGGGCT ATGCCCGCGT CAGCACCGAC 2950
GACCAGGACT TGACCAACCA ACGGGCCGAA CTGCACGCGG CCGGCTGCAC 3000
CAAGCTGTTT TCCGAGAAGA TCACCGGCAC CAGGCGCGAC CGCCCGGAGC 3050
TGGCCAGGAT GCTTGACCAC CTACGCCCTG GCGACGTTGT GACAGTGACC 3100
AGGCTAGACC GCCTGGCCCG CAGCACCCGC GACCTACTGG ACATTGCCGA 3150
GCGCATCCAG GAGGCCGGCG CGGGCCTGCG TAGCCTGGCA GAGCCGTGGG 3200
CCGACACCAC CACGCCGGCC GGCCGCATGG TGTTGACCGT GTTCGCCGGC 3250
ATTGCCGAGT TCGAGCGTTC CCTAATCATC GACCGCACCC GGAGCGGGCG 3300
CGAGGCCGCC AAGGCCCGAG GCGTGAAGTT TGGCCCCCGC CCTACCCTCA 3350
CCCCGGCACA GATCGCGCAC GCCCGCGAGC TGATCGACCA GGAAGGCCGC 3400
ACCGTGAAAG AGGCGGCTGC ACTGCTTGGC GTGCATCGCT CGACCCTGTA 3450
CCGCGCACTT GAGCGCAGCG AGGAAGTGAC GCCCACCGAG GCCAGGCGGC 3500
GCGGTGCCTT CCGTGAGGAC GCATTGACCG AGGCCGACGC CCTGGCGGCC 3550
GCCGAGAATG AACGCCAAGA GGAACAAGCA TGAAACCGCA CCAGGACGGC 3600
CAGGACGAAC CGTTTTTCAT TACCGAAGAG ATCGAGGCGG AGATGATCGC 3650
GGCCGGGTAC GTGTTCGAGC CGCCCGCGCA CGTCTCAACC GTGCGGCTGC 3700
ATGAAATCCT GGCCGGTTTG TCTGATGCCA AGCTGGCGGC CTGGCCGGCC 3750
AGCTTGGCCG CTGAAGAAAC CGAGCGCCGC CGTCTAAAAA GGTGATGTGT 3800
ATTTGAGTAA AACAGCTTGC GTCATGCGGT CGCTGCGTAT ATGATGCGAT 3850
GAGTAAATAA ACAAATACGC AAGGGGAACG CATGAAGGTT ATCGCTGTAC 3900
TTAACCAGAA AGGCGGGTCA GGCAAGACGA CCATCGCAAC CCATCTAGCC 3950
CGCGCCCTGC AACTCGCCGG GGCCGATGTT CTGTTAGTCG ATTCCGATCC 4000
CCAGGGCAGT GCCCGCGATT GGGCGGCCGT GCGGGAAGAT CAACCGCTAA 4050
CCGTTGTCGG CATCGACCGC CCGACGATTG ACCGCGACGT GAAGGCCATC 4100
GGCCGGCGCG ACTTCGTAGT GATCGACGGA GCGCCCCAGG CGGCGGACTT 4150
GGCTGTGTCC GCGATCAAGG CAGCCGACTT CGTGCTGATT CCGGTGCAGC 4200
CAAGCCCTTA CGACATATGG GCCACCGCCG ACCTGGTGGA GCTGGTTAAG 4250
CAGCGCATTG AGGTCACGGA TGGAAGGCTA CAAGCGGCCT TTGTCGTGTC 4300
GCGGGCGATC AAAGGCACGC GCATCGGCGG TGAGGTTGCC GAGGCGCTGG 4350
CCGGGTACGA GCTGCCCATT CTTGAGTCCC GTATCACGCA GCGCGTGAGC 4400
TACCCAGGCA CTGCCGCCGC CGGCACAACC GTTCTTGAAT CAGAACCCGA 4450
GGGCGACGCT GCCCGCGAGG TCCAGGCGCT GGCCGCTGAA ATTAAATCAA 4500
AACTCATTTG AGTTAATGAG GTAAAGAGAA AATGAGCAAA AGCACAAACA 4550
CGCTAAGTGC CGGCCGTCCG AGCGCACGCA GCAGCAAGGC TGCAACGTTG 4600
GCCAGCCTGG CAGACACGCC AGCCATGAAG CGGGTCAACT TTCAGTTGCC 4650
GGCGGAGGAT CACACCAAGC TGAAGATGTA CGCGGTACGC CAAGGCAAGA 4700
CCATTACCGA GCTGCTATCT GAATACATCG CGCAGCTACC AGAGTAAATG 4750
AGCAAATGAA TAAATGAGTA GATGAATTTT AGCGGCTAAA GGAGGCGGCA 4800
TGGAAAATCA AGAACAACCA GGCACCGACG CCGTGGAATG CCCCATGTGT 4850
GGAGGAACGG GCGGTTGGCC AGGCGTAAGC GGCTGGGTTG TCTGCCGGCC 4900
CTGCAATGGC ACTGGAACCC CCAAGCCCGA GGAATCGGCG TGACGGTCGC 4950
AAACCATCCG GCCCGGTACA AATCGGCGCG GCGCTGGGTG ATGACCTGGT 5000
GGAGAAGTTG AAGGCCGCGC AGGCCGCCCA GCGGCAACGC ATCGAGGCAG 5050
AAGCACGCCC CGGTGAATCG TGGCAAGCGG CCGCTGATCG AATCCGCAAA 5100
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CAAGGGCGAC GAGCAACCAG ATTTTTTCGT TCCGATGCTC TATGACGTGG 5200
GCACCCGCGA TAGTCGCAGC ATCATGGACG TGGCCGTTTT CCGTCTGTCG 5250
AAGCGTGACC GACGAGCTGG CGAGGTGATC CGCTACGAGC TTCCAGACGG 5300
GCACGTAGAG GTTTCCGCAG GGCCGGCCGG CATGGCCAGT GTGTGGGATT 5350
ACGACCTGGT ACTGATGGCG GTTTCCCATC TAACCGAATC CATGAACCGA 5400
TACCGGGAAG GGAAGGGAGA CAAGCCCGGC CGCGTGTTCC GTCCACACGT 5450
TGCGGACGTA CTCAAGTTCT GCCGGCGAGC CGATGGCGGA AAGCAGAAAG 5500
ACGACCTGGT AGAAACCTGC ATTCGGTTAA ACACCACGCA CGTTGCCATG 5550
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GCCGGTTCCT AATGTACGGA GCAGATGCTA GGGCAAATTG CCCTAGCAGG 6050
GGAAAAAGGT CGAAAAGGTC TCTTTCCTGT GGATAGCACG TACATTGGGA 6100
ACCCAAAGCC GTACATTGGG AACCGGAACC CGTACATTGG GAACCCAAAG 6150
CCGTACATTG GGAACCGGTC ACACATGTAA GTGACTGATA TAAAAGAGAA 6200
AAAAGGCGAT TTTTCCGCCT AAAACTCTTT AAAACTTATT AAAACTCTTA 6250
AAACCCGCCT GGCCTGTGCA TAACTGTCTG GCCAGCGCAC AGCCGAAGAG 6300
CTGCAAAAAG CGCCTACCCT TCGGTCGCTG CGCTCCCTAC GCCCCGCCGC 6350
TTCGCGTCGG CCTATCGCGG CCGCTGGCCG CTCAAAAATG GCTGGCCTAC 6400
GGCCAGGCAA TCTACCAGGG CGCGGACAAG CCGCGCCGTC GCCACTCGAC 6450
CGCCGGCGCC CACATCAAGG CACCCTGCCT CGCGCGTTTC GGTGATGACG 6500
GTGAAAACCT CTGACACATG CAGCTCCCGG AGACGGTCAC AGCTTGTCTG 6550
TAAGCGGATG CCGGGAGCAG ACAAGCCCGT CAGGGCGCGT CAGCGGGTGT 6600
TGGCGGGTGT CGGGGCGCAG CCATGACCCA GTCACGTAGC GATAGCGGAG 6650
TGTATACTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 6700
ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC 6750
ATCAGGCGCT CTTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT 6800
TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT 6850
CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA ACATGTGAGC AAAAGGCCAG 6900
CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG 6950
GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT 7000
GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC 7050
TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC 7100
CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA GCGTGGCGCT TTCTCATAGC TCACGCTGTA 7150
GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC 7200
GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT 7250
TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG 7300
GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG 7350
AAGTGGTGGC CTAACTACGG CTACACTAGA AGGACAGTAT TTGGTATCTG 7400
CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT 7450
CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG GTTTTTTTGT TTGCAAGCAG 7500
CAGATTACGC GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT TGATCTTTTC 7550
TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG 7600
TCATGCATTC TAGGTACTAA AACAATTCAT CCAGTAAAAT ATAATATTTT 7650
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ATACTGTTCT TCCCCGATAT CCTCCCTGAT CGACCGGACG CAGAAGGCAA 7750
TGTCATACCA CTTGTCCGCC CTGCCGCTTC TCCCAAGATC AATAAAGCCA 7800
CTTACTTTGC CATCTTTCAC AAAGATGTTG CTGTCTCCCA GGTCGCCGTG 7850
GGAAAAGACA AGTTCCTCTT CGGGCTTTTC CGTCTTTAAA AAATCATACA 7900
GCTCGCGCGG ATCTTTAAAT GGAGTGTCTT CTTCCCAGTT TTCGCAATCC 7950
ACATCGGCCA GATCGTTATT CAGTAAGTAA TCCAATTCGG CTAAGCGGCT 8000
GTCTAAGCTA TTCGTATAGG GACAATCCGA TATGTCGATG GAGTGAAAGA 8050
GCCTGATGCA CTCCGCATAC AGCTCGATAA TCTTTTCAGG GCTTTGTTCA 8100
TCTTCATACT CTTCCGAGCA AAGGACGCCA TCGGCCTCAC TCATGAGCAG 8150
ATTGCTCCAG CCATCATGCC GTTCAAAGTG CAGGACCTTT GGAACAGGCA 8200
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GTGGTCCCTT TATACCGGCT GTCCGTCATT TTTAAATATA GGTTTTCATT 8300
TTCTCCCACC AGCTTATATA CCTTAGCAGG AGACATTCCT TCCGTATCTT 8350
TTACGCAGCG GTATTTTTCG ATCAGTTTTT TCAATTCCGG TGATATTCTC 8400
ATTTTAGCCA TTTATTATTT CCTTCCTCTT TTCTACAGTA TTTAAAGATA 8450
CCCCAAGAAG CTAATTATAA CAAGACGAAC TCCAATTCAC TGTTCCTTGC 8500
ATTCTAAAAC CTTAAATACC AGAAAACAGC TTTTTCAAAG TTGTTTTCAA 8550
AGTTGGCGTA TAACATAGTA TCGACGGAGC CGATTTTGAA ACCGCGGTGA 8600
TCACAGGCAG CAACGCTCTG TCATCGTTAC AATCAACATG CTACCCTCCG 8650
CGAGATCATC CGTGTTTCAA ACCCGGCAGC TTAGTTGCCG TTCTTCCGAA 8700
TAGCATCGGT AACATGAGCA AAGTCTGCCG CCTTACAACG GCTCTCCCGC 8750
TGACGCCGTC CCGGACTGAT GGGCTGCCTG TATCGAGTGG TGATTTTGTG 8800
CCGAGCTGCC GGTCGGGGAG CTGTTGGCTG GCTGGTGGCA GGATATATTG 8850
TGGTGTAAAC AAATTGACGC TTAGACAACT TAATAACACA TTGCGGACGT 8900
TTTTAATGTA CTGAATTAAC GCCGAATTAA TTCGGGGGAT CTGGATTTTA 8950
GTACTGGATT TTGGTTTTAG GAATTAGAAA TTTTATTGAT AGAAGTATTT 9000
TACAAATACA AATACATACT AAGGGTTTCT TATATGCTCA ACACATGAGC 9050
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ATTATGGAGA AACTCGAGTC AAATCTCGGT GACGGGCAGG ACCGGACGGG 9150
GCGGTACCGG CAGGCTGAAG TCCAGCTGCC AGAAACCCAC GTCATGCCAG 9200
TTCCCGTGCT TGAAGCCGGC CGCCCGCAGC ATGCCGCGGG GGGCATATCC 9250
GAGCGCCTCG TGCATGCGCA CGCTCGGGTC GTTGGGCAGC CCGATGACAG 9300
CGACCACGCT CTTGAAGCCC TGTGCCTCCA GGGACTTCAG CAGGTGGGTG 9350
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TAGCGCTCCC GCAGACGGAC GAGGTCGTCC GTCCACTCCT GCGGTTCCTG 9550
CGGCTCGGTA CGGAAGTTGA CCGTGCTTGT CTCGATGTAG TGGTTGACGA 9600
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GGGCGTCGTT CTGGGCTCAT GGTAGACTCG AGAGAGATAG ATTTGTAGAG 9700
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TATAGAGGAA GGTCTTGCGA AGGATAGTGG GATTGTGCGT CATCCCTTAC 9800
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CGTCTTCTTT TTCCACGATG CTCCTCGTGG GTGGGGGTCC ATCTTTGGGA 9900
CCACTGTCGG CAGAGGCATC TTGAACGATA GCCTTTCCTT TATCGCAATG 9950
ATGGCATTTG TAGGTGCCAC CTTCCTTTTC TACTGTCCTT TTGATGAAGT 10000
GACAGATAGC TGGGCAATGG AATCCGAGGA GGTTTCCCGA TATTACCCTT 10050
TGTTGAAAAG TCTCAATAGC CCTTTGGTCT TCTGAGACTG TATCTTTGAT 10100
ATTCTTGGAG TAGACGAGAG TGTCGTGCTC CACCATGTTA TCACATCAAT 10150
CCACTTGCTT TGAAGACGTG GTTGGAACGT CTTCTTTTTC CACGATGCTC 10200
CTCGTGGGTG GGGGTCCATC TTTGGGACCA CTGTCGGCAG AGGCATCTTG 10250
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TTGGTCTTCT GAGACTGTAT CTTTGATATT CTTGGAGTAG ACGAGAGTGT 10450
CGTGCTCCAC CATGTTGGCA AGCTGCTCTA GCCAATACGC AAACCGCCTC 10500
TCCCCGCGCG TTGGCCGATT CATTAATGCA GCTGGCACGA CAGGTTTCCC 10550
GACTGGAAAG CGGGCAGTGA GCGCAACGCA ATTAATGTGA GTTAGCTCAC 10600
TCATTAGGCA CCCCAGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATGTTGT 10650
GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT 10700
GATTAC 10706
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列（Artificial sequence）
<400>6
GAATTCCATG GAGTCAAAGA TTCAAATAGA GGACCTAACA GAACTCGCCG 50
TAAAGACTGG CGAACAGTTC ATACAGAGTC TCTTACGACT CAATGACAAG 100
AAGAAAATCT TCGTCAACAT GGTGGAGCAC GACACACTTG TCTACTCCAA 150
AAATATCAAA GATACAGTCT CAGAAGACCA AAGGGCAATT GAGACTTTTC 200
AACAAAGGGT AATATCCGGA AACCTCCTCG GATTCCATTG CCCAGCTATC 250
TGTCACTTTA TTGTGAAGAT AGTGGAAAAG GAAGGTGGCT CCTACAAATG 300
CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCCATCGT TGAAGATGCC TCTGCCGACA 350
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CATGGGATCC AGATCTGAGC TCTCTAGAAC TAGTGACGTC CCCGGGCTGC 600
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ATTACCGGCC CGCAGTGGTG GGCGCGCTGC AAACAGATGA ACGTGCTGGA 700
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ATAAATATCT GACCGCGTGG TTTGAACTGC TGAACCTGCC GAAAAAAATT 950
ATTTTTGTGG GCCATGATTG GGGCGCGTGC CTGGCGTTTC ATTATAGCTA 1000
TGAACATCAG GATAAAATTA AAGCGATTGT GCACGCGGAA AGCGTGGTGG 1050
ATGTGATTGA AAGCTGGGAT GAATGGCCGG ATATTGAAGA AGATATTGCG 1100
CTGATTAAAA GCGAAGAAGG CGAAAAAATG GTGCTGGAAA ACAACTTTTT 1150
TGTGGAAACC ATGCTGCCGA GCAAAATTAT GCGCAAACTG GAACCGGAAG 1200
AATTTGCGGC GTATCTGGAA CCGTTTAAAG AAAAAGGCGA AGTGCGCCGC 1250
CCGACCCTGA GCTGGCCGCG CGAAATTCCG CTGGTGAAAG GCGGCAAACC 1300
GGATGTGGTC CAGATTGTGC GCAACTATAA CGCGTATCTG CGCGCGAGCG 1350
ATGATCTGCC GAAAATGTTT ATTGAAAGCG ATCCGGGCTT TTTTAGCAAC 1400
GCGATTGTGG AAGGCGCGAA AAAATTTCCG AACACCGAAT TTGTGAAAGT 1450
GAAGGGCCTG CATTTTAGCC AGGAAGATGC GCCGGATGAA ATGGGCAAAT 1500
ATATTAAGAG CTTTGTGGAA CGCGTGCTGA AAAACGAACA GGGCTAGGGT 1550
GACCAGCTCG AATTTCCCCG ATCGTTCAAA CATTTGGCAA TAAAGTTTCT 1600
TAAGATTGAA TCCTGTTGCC GGTCTTGCGA TGATTATCAT ATAATTTCTG 1650
TTGAATTACG TTAAGCATGT AATAATTAAC ATGTAATGCA TGACGTTATT 1700
TATGAGATGG GTTTTTATGA TTAGAGTCCC GCAATTATAC ATTTAATACG 1750
CGATAGAAAA CAAAATATAG CGCGCAAACT AGGATAAATT ATCGCGCGCG 1800
GTGTCATCTA TGTTACTAGA TCGGGAATTA AACTATCAGT GTTTGACAGG 1850
ATATATTGGC GGGTAAACCT AAGAGAAAAG AGCGTTTATT AGAATAACGG 1900
ATATTTAAAA GGGCGTGAAA AGGTTTATCC GTTCGTCCAT TTGTATGTGC 1950
ATGCCAACCA CAGGGTTCCC CTCGGGATCA AAGTACTTTG ATCCAACCCC 2000
TCCGCTGCTA TAGTGCAGTC GGCTTCTGAC GTTCAGTGCA GCCGTCTTCT 2050
GAAAACGACA TGTCGCACAA GTCCTAAGTT ACGCGACAGG CTGCCGCCCT 2100
GCCCTTTTCC TGGCGTTTTC TTGTCGCGTG TTTTAGTCGC ATAAAGTAGA 2150
ATACTTGCGA CTAGAACCGG AGACATTACG CCATGAACAA GAGCGCCGCC 2200
GCTGGCCTGC TGGGCTATGC CCGCGTCAGC ACCGACGACC AGGACTTGAC 2250
CAACCAACGG GCCGAACTGC ACGCGGCCGG CTGCACCAAG CTGTTTTCCG 2300
AGAAGATCAC CGGCACCAGG CGCGACCGCC CGGAGCTGGC CAGGATGCTT 2350
GACCACCTAC GCCCTGGCGA CGTTGTGACA GTGACCAGGC TAGACCGCCT 2400
GGCCCGCAGC ACCCGCGACC TACTGGACAT TGCCGAGCGC ATCCAGGAGG 2450
CCGGCGCGGG CCTGCGTAGC CTGGCAGAGC CGTGGGCCGA CACCACCACG 2500
CCGGCCGGCC GCATGGTGTT GACCGTGTTC GCCGGCATTG CCGAGTTCGA 2550
GCGTTCCCTA ATCATCGACC GCACCCGGAG CGGGCGCGAG GCCGCCAAGG 2600
CCCGAGGCGT GAAGTTTGGC CCCCGCCCTA CCCTCACCCC GGCACAGATC 2650
GCGCACGCCC GCGAGCTGAT CGACCAGGAA GGCCGCACCG TGAAAGAGGC 2700
GGCTGCACTG CTTGGCGTGC ATCGCTCGAC CCTGTACCGC GCACTTGAGC 2750
GCAGCGAGGA AGTGACGCCC ACCGAGGCCA GGCGGCGCGG TGCCTTCCGT 2800
GAGGACGCAT TGACCGAGGC CGACGCCCTG GCGGCCGCCG AGAATGAACG 2850
CCAAGAGGAA CAAGCATGAA ACCGCACCAG GACGGCCAGG ACGAACCGTT 2900
TTTCATTACC GAAGAGATCG AGGCGGAGAT GATCGCGGCC GGGTACGTGT 2950
TCGAGCCGCC CGCGCACGTC TCAACCGTGC GGCTGCATGA AATCCTGGCC 3000
GGTTTGTCTG ATGCCAAGCT GGCGGCCTGG CCGGCCAGCT TGGCCGCTGA 3050
AGAAACCGAG CGCCGCCGTC TAAAAAGGTG ATGTGTATTT GAGTAAAACA 3100
GCTTGCGTCA TGCGGTCGCT GCGTATATGA TGCGATGAGT AAATAAACAA 3150
ATACGCAAGG GGAACGCATG AAGGTTATCG CTGTACTTAA CCAGAAAGGC 3200
GGGTCAGGCA AGACGACCAT CGCAACCCAT CTAGCCCGCG CCCTGCAACT 3250
CGCCGGGGCC GATGTTCTGT TAGTCGATTC CGATCCCCAG GGCAGTGCCC 3300
GCGATTGGGC GGCCGTGCGG GAAGATCAAC CGCTAACCGT TGTCGGCATC 3350
GACCGCCCGA CGATTGACCG CGACGTGAAG GCCATCGGCC GGCGCGACTT 3400
CGTAGTGATC GACGGAGCGC CCCAGGCGGC GGACTTGGCT GTGTCCGCGA 3450
TCAAGGCAGC CGACTTCGTG CTGATTCCGG TGCAGCCAAG CCCTTACGAC 3500
ATATGGGCCA CCGCCGACCT GGTGGAGCTG GTTAAGCAGC GCATTGAGGT 3550
CACGGATGGA AGGCTACAAG CGGCCTTTGT CGTGTCGCGG GCGATCAAAG 3600
GCACGCGCAT CGGCGGTGAG GTTGCCGAGG CGCTGGCCGG GTACGAGCTG 3650
CCCATTCTTG AGTCCCGTAT CACGCAGCGC GTGAGCTACC CAGGCACTGC 3700
CGCCGCCGGC ACAACCGTTC TTGAATCAGA ACCCGAGGGC GACGCTGCCC 3750
GCGAGGTCCA GGCGCTGGCC GCTGAAATTA AATCAAAACT CATTTGAGTT 3800
AATGAGGTAA AGAGAAAATG AGCAAAAGCA CAAACACGCT AAGTGCCGGC 3850
CGTCCGAGCG CACGCAGCAG CAAGGCTGCA ACGTTGGCCA GCCTGGCAGA 3900
CACGCCAGCC ATGAAGCGGG TCAACTTTCA GTTGCCGGCG GAGGATCACA 3950
CCAAGCTGAA GATGTACGCG GTACGCCAAG GCAAGACCAT TACCGAGCTG 4000
CTATCTGAAT ACATCGCGCA GCTACCAGAG TAAATGAGCA AATGAATAAA 4050
TGAGTAGATG AATTTTAGCG GCTAAAGGAG GCGGCATGGA AAATCAAGAA 4100
CAACCAGGCA CCGACGCCGT GGAATGCCCC ATGTGTGGAG GAACGGGCGG 4150
TTGGCCAGGC GTAAGCGGCT GGGTTGTCTG CCGGCCCTGC AATGGCACTG 4200
GAACCCCCAA GCCCGAGGAA TCGGCGTGAC GGTCGCAAAC CATCCGGCCC 4250
GGTACAAATC GGCGCGGCGC TGGGTGATGA CCTGGTGGAG AAGTTGAAGG 4300
CCGCGCAGGC CGCCCAGCGG CAACGCATCG AGGCAGAAGC ACGCCCCGGT 4350
GAATCGTGGC AAGCGGCCGC TGATCGAATC CGCAAAGAAT CCCGGCAACC 4400
GCCGGCAGCC GGTGCGCCGT CGATTAGGAA GCCGCCCAAG GGCGACGAGC 4450
AACCAGATTT TTTCGTTCCG ATGCTCTATG ACGTGGGCAC CCGCGATAGT 4500
CGCAGCATCA TGGACGTGGC CGTTTTCCGT CTGTCGAAGC GTGACCGACG 4550
AGCTGGCGAG GTGATCCGCT ACGAGCTTCC AGACGGGCAC GTAGAGGTTT 4600
CCGCAGGGCC GGCCGGCATG GCCAGTGTGT GGGATTACGA CCTGGTACTG 4650
ATGGCGGTTT CCCATCTAAC CGAATCCATG AACCGATACC GGGAAGGGAA 4700
GGGAGACAAG CCCGGCCGCG TGTTCCGTCC ACACGTTGCG GACGTACTCA 4750
AGTTCTGCCG GCGAGCCGAT GGCGGAAAGC AGAAAGACGA CCTGGTAGAA 4800
ACCTGCATTC GGTTAAACAC CACGCACGTT GCCATGCAGC GTACGAAGAA 4850
GGCCAAGAAC GGCCGCCTGG TGACGGTATC CGAGGGTGAA GCCTTGATTA 4900
GCCGCTACAA GATCGTAAAG AGCGAAACCG GGCGGCCGGA GTACATCGAG 4950
ATCGAGCTAG CTGATTGGAT GTACCGCGAG ATCACAGAAG GCAAGAACCC 5000
GGACGTGCTG ACGGTTCACC CCGATTACTT TTTGATCGAT CCCGGCATCG 5050
GCCGTTTTCT CTACCGCCTG GCACGCCGCG CCGCAGGCAA GGCAGAAGCC 5100
AGATGGTTGT TCAAGACGAT CTACGAACGC AGTGGCAGCG CCGGAGAGTT 5150
CAAGAAGTTC TGTTTCACCG TGCGCAAGCT GATCGGGTCA AATGACCTGC 5200
CGGAGTACGA TTTGAAGGAG GAGGCGGGGC AGGCTGGCCC GATCCTAGTC 5250
ATGCGCTACC GCAACCTGAT CGAGGGCGAA GCATCCGCCG GTTCCTAATG 5300
TACGGAGCAG ATGCTAGGGC AAATTGCCCT AGCAGGGGAA AAAGGTCGAA 5350
AAGGTCTCTT TCCTGTGGAT AGCACGTACA TTGGGAACCC AAAGCCGTAC 5400
ATTGGGAACC GGAACCCGTA CATTGGGAAC CCAAAGCCGT ACATTGGGAA 5450
CCGGTCACAC ATGTAAGTGA CTGATATAAA AGAGAAAAAA GGCGATTTTT 5500
CCGCCTAAAA CTCTTTAAAA CTTATTAAAA CTCTTAAAAC CCGCCTGGCC 5550
TGTGCATAAC TGTCTGGCCA GCGCACAGCC GAAGAGCTGC AAAAAGCGCC 5600
TACCCTTCGG TCGCTGCGCT CCCTACGCCC CGCCGCTTCG CGTCGGCCTA 5650
TCGCGGCCGC TGGCCGCTCA AAAATGGCTG GCCTACGGCC AGGCAATCTA 5700
CCAGGGCGCG GACAAGCCGC GCCGTCGCCA CTCGACCGCC GGCGCCCACA 5750
TCAAGGCACC CTGCCTCGCG CGTTTCGGTG ATGACGGTGA AAACCTCTGA 5800
CACATGCAGC TCCCGGAGAC GGTCACAGCT TGTCTGTAAG CGGATGCCGG 5850
GAGCAGACAA GCCCGTCAGG GCGCGTCAGC GGGTGTTGGC GGGTGTCGGG 5900
GCGCAGCCAT GACCCAGTCA CGTAGCGATA GCGGAGTGTA TACTGGCTTA 5950
ACTATGCGGC ATCAGAGCAG ATTGTACTGA GAGTGCACCA TATGCGGTGT 6000
GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA GGCGCTCTTC 6050
CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG 6100
CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG 6150
GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA 6200
CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG 6250
ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA 6300
GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC 6350
TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT 6400
CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG 6450
GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA 6500
GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG 6550
TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC 6600
AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA 6650
CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC 6700
CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC 6750
ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG 6800
AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG 6850
CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GCATTCTAGG 6900
TACTAAAACA ATTCATCCAG TAAAATATAA TATTTTATTT TCTCCCAATC 6950
AGGCTTGATC CCCAGTAAGT CAAAAAATAG CTCGACATAC TGTTCTTCCC 7000
CGATATCCTC CCTGATCGAC CGGACGCAGA AGGCAATGTC ATACCACTTG 7050
TCCGCCCTGC CGCTTCTCCC AAGATCAATA AAGCCACTTA CTTTGCCATC 7100
TTTCACAAAG ATGTTGCTGT CTCCCAGGTC GCCGTGGGAA AAGACAAGTT 7150
CCTCTTCGGG CTTTTCCGTC TTTAAAAAAT CATACAGCTC GCGCGGATCT 7200
TTAAATGGAG TGTCTTCTTC CCAGTTTTCG CAATCCACAT CGGCCAGATC 7250
GTTATTCAGT AAGTAATCCA ATTCGGCTAA GCGGCTGTCT AAGCTATTCG 7300
TATAGGGACA ATCCGATATG TCGATGGAGT GAAAGAGCCT GATGCACTCC 7350
GCATACAGCT CGATAATCTT TTCAGGGCTT TGTTCATCTT CATACTCTTC 7400
CGAGCAAAGG ACGCCATCGG CCTCACTCAT GAGCAGATTG CTCCAGCCAT 7450
CATGCCGTTC AAAGTGCAGG ACCTTTGGAA CAGGCAGCTT TCCTTCCAGC 7500
CATAGCATCA TGTCCTTTTC CCGTTCCACA TCATAGGTGG TCCCTTTATA 7550
CCGGCTGTCC GTCATTTTTA AATATAGGTT TTCATTTTCT CCCACCAGCT 7600
TATATACCTT AGCAGGAGAC ATTCCTTCCG TATCTTTTAC GCAGCGGTAT 7650
TTTTCGATCA GTTTTTTCAA TTCCGGTGAT ATTCTCATTT TAGCCATTTA 7700
TTATTTCCTT CCTCTTTTCT ACAGTATTTA AAGATACCCC AAGAAGCTAA 7750
TTATAACAAG ACGAACTCCA ATTCACTGTT CCTTGCATTC TAAAACCTTA 7800
AATACCAGAA AACAGCTTTT TCAAAGTTGT TTTCAAAGTT GGCGTATAAC 7850
ATAGTATCGA CGGAGCCGAT TTTGAAACCG CGGTGATCAC AGGCAGCAAC 7900
GCTCTGTCAT CGTTACAATC AACATGCTAC CCTCCGCGAG ATCATCCGTG 7950
TTTCAAACCC GGCAGCTTAG TTGCCGTTCT TCCGAATAGC ATCGGTAACA 8000
TGAGCAAAGT CTGCCGCCTT ACAACGGCTC TCCCGCTGAC GCCGTCCCGG 8050
ACTGATGGGC TGCCTGTATC GAGTGGTGAT TTTGTGCCGA GCTGCCGGTC 8100
GGGGAGCTGT TGGCTGGCTG GTGGCAGGAT ATATTGTGGT GTAAACAAAT 8150
TGACGCTTAG ACAACTTAAT AACACATTGC GGACGTTTTT AATGTACTGA 8200
ATTAACGCCG AATTAATTCG GGGGATCTGG ATTTTAGTAC TGGATTTTGG 8250
TTTTAGGAAT TAGAAATTTT ATTGATAGAA GTATTTTACA AATACAAATA 8300
CATACTAAGG GTTTCTTATA TGCTCAACAC ATGAGCGAAA CCCTATAGGA 8350
ACCCTAATTC CCTTATCTGG GAACTACTCA CACATTATTA TGGAGAAACT 8400
CGAGTCAAAT CTCGGTGACG GGCAGGACCG GACGGGGCGG TACCGGCAGG 8450
CTGAAGTCCA GCTGCCAGAA ACCCACGTCA TGCCAGTTCC CGTGCTTGAA 8500
GCCGGCCGCC CGCAGCATGC CGCGGGGGGC ATATCCGAGC GCCTCGTGCA 8550
TGCGCACGCT CGGGTCGTTG GGCAGCCCGA TGACAGCGAC CACGCTCTTG 8600
AAGCCCTGTG CCTCCAGGGA CTTCAGCAGG TGGGTGTAGA GCGTGGAGCC 8650
CAGTCCCGTC CGCTGGTGGC GGGGGGAGAC GTACACGGTC GACTCGGCCG 8700
TCCAGTCGTA GGCGTTGCGT GCCTTCCAGG GGCCCGCGTA GGCGATGCCG 8750
GCGACCTCGC CGTCCACCTC GGCGACGAGC CAGGGATAGC GCTCCCGCAG 8800
ACGGACGAGG TCGTCCGTCC ACTCCTGCGG TTCCTGCGGC TCGGTACGGA 8850
AGTTGACCGT GCTTGTCTCG ATGTAGTGGT TGACGATGGT GCAGACCGCC 8900
GGCATGTCCG CCTCGGTGGC ACGGCGGATG TCGGCCGGGC GTCGTTCTGG 8950
GCTCATGGTA GACTCGAGAG AGATAGATTT GTAGAGAGAG ACTGGTGATT 9000
TCAGCGTGTC CTCTCCAAAT GAAATGAACT TCCTTATATA GAGGAAGGTC 9050
TTGCGAAGGA TAGTGGGATT GTGCGTCATC CCTTACGTCA GTGGAGATAT 9100
CACATCAATC CACTTGCTTT GAAGACGTGG TTGGAACGTC TTCTTTTTCC 9150
ACGATGCTCC TCGTGGGTGG GGGTCCATCT TTGGGACCAC TGTCGGCAGA 9200
GGCATCTTGA ACGATAGCCT TTCCTTTATC GCAATGATGG CATTTGTAGG 9250
TGCCACCTTC CTTTTCTACT GTCCTTTTGA TGAAGTGACA GATAGCTGGG 9300
CAATGGAATC CGAGGAGGTT TCCCGATATT ACCCTTTGTT GAAAAGTCTC 9350
AATAGCCCTT TGGTCTTCTG AGACTGTATC TTTGATATTC TTGGAGTAGA 9400
CGAGAGTGTC GTGCTCCACC ATGTTATCAC ATCAATCCAC TTGCTTTGAA 9450
GACGTGGTTG GAACGTCTTC TTTTTCCACG ATGCTCCTCG TGGGTGGGGG 9500
TCCATCTTTG GGACCACTGT CGGCAGAGGC ATCTTGAACG ATAGCCTTTC 9550
CTTTATCGCA ATGATGGCAT TTGTAGGTGC CACCTTCCTT TTCTACTGTC 9600
CTTTTGATGA AGTGACAGAT AGCTGGGCAA TGGAATCCGA GGAGGTTTCC 9650
CGATATTACC CTTTGTTGAA AAGTCTCAAT AGCCCTTTGG TCTTCTGAGA 9700
CTGTATCTTT GATATTCTTG GAGTAGACGA GAGTGTCGTG CTCCACCATG 9750
TTGGCAAGCT GCTCTAGCCA ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG 9800
CCGATTCATT AATGCAGCTG GCACGACAGG TTTCCCGACT GGAAAGCGGG 9850
CAGTGAGCGC AACGCAATTA ATGTGAGTTA GCTCACTCAT TAGGCACCCC 9900
AGGCTTTACA CTTTATGCTT CCGGCTCGTA TGTTGTGTGG AATTGTGAGC 9950
GGATAACAAT TTCACACAGG AAACAGCTAT GACCATGATT AC 9992

Claims (9)

1.一种植物过表达荧光素酶报告基因重组载体，其特征在于，所述重组载体含有pCAMBIA3301双元表达载体和插入片段；所述插入片段包括启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因；
所述启动子的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示；所述多克隆位点的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体，其特征在于，所述荧光素酶报告基因是萤火虫荧光素酶基因LUC；所述萤火虫荧光素酶基因LUC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.3所示；所述重组载体的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.5所示。
3.根据权利要求1所述的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体，其特征在于，所述荧光素酶报告基因是海肾荧光素酶基因RLUC；所述海肾荧光素酶基因RLUC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.4所示；所述重组载体的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.6所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体，其特征在于，所述启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因依次连接，插入到pCAMBIA3301双元表达载体的BstE II酶切位点和EcoR I酶切位点之间。
5.权利要求1～4任一项所述的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：全基因合成插入片段；设计插入片段的基因序列；并通过全基因合成法以5’→3’方向合成依次含有启动子、多克隆位点和荧光素酶报告基因的插入片段，并分别在启动子上游引入EcoR I，荧光素酶报告基因下游引入BstE II的酶切位点，再连接在pEASY载体上，得到中间载体；
S2：用BstE II和EcoR I双酶切pCAMBIA3301双元表达载体，回收得到pCAMBIA3301双元表达载体片段；回收的所述pCAMBIA3301双元表达载体片段为电泳结果中的8452bp片段；
用BstE II和EcoR I双酶切全基因合成后的中间载体，回收得到插入片段，并与所述pCAMBIA3301双元表达载体片段连接得到所述重组载体。
6.含有权利要求1～4任一项所述的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌Top10细胞。
8.权利要求1～4任一项所述的植物过表达荧光素酶报告基因重组载体在植物原生质体细胞瞬时过表达或者转基因植株中过表达目的基因的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，取待检测的植物活体组织，然后提取植物活体组织的原生质体，通过PEG介导法将权利要求1～4任一项所述的重组载体转化到原生质体细胞中瞬时表达。
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