CN112941157A - 多重荧光定量pcr检测食品中肉类种源的引物组及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肉类种源检测技术领域，公开了一种多重荧光定量PCR检测食品中肉类种源的引物组及方法，所述多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的引物组包括：牛、鸡、猪、鸭特异性引物和探针；所述多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法包括：DNA的提取及浓度、纯度的测定；多重实时荧光PCR反应体系与条件的筛选；实验对照设置；检出限的确定；牛、鸡、猪、鸭源性成分的多重检测；定量标准曲线的制作。本发明建立在牛、猪、鸡、鸭物种的特异性引物和探针体系上，具有较高的准确性、抗干扰能力和可移植性，能够通过多重荧光定量PCR技术在一个反应孔中一次性准确快速检测出四种肉类成分并定量，节省检测时间和成本。
Description
技术领域
本发明属于肉类种源检测技术领域，尤其涉及一种多重荧光定量PCR检测食品中肉类种源的引物组及方法。
背景技术
目前，在动物源性鉴定中，对不同工艺加工的肉类样品的前处理以及DNA提取较为笼统，多数仅以生鲜肉类为主，缺乏对不同工艺加工的肉制品样本进行分别研究的技术方案。肉类品种的鉴定方法主要为蛋白质鉴定和核酸鉴定。当肉类经过蒸煮、煎烤等加工后，蛋白质结构被破坏，而经过加工后核酸的结构不发生改变，因此，通过对肉制品的DNA检测来鉴定成为可靠的方法。有研究证明，高温的水烹调肉如烹煮、蒸烤、压力处理等烹饪过的牛肉制品可以提取其线粒体DNA片段，而后经PCR扩增可以鉴别出来。实时荧光PCR鉴别方法是肉制品动物源性成分检测的主要方法之一，也是当前较为先进的一种分子生物学检验方法，检测灵敏性高，专属性好，具有较高的应用价值。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有动物源性鉴定方法中，对不同工艺加工的肉类样品的前处理以及DNA提取较为笼统，多数仅以生鲜肉类为主，缺乏对不同工艺加工的肉制品样本进行分别研究的技术方案。
解决以上问题及缺陷的难度为：一方面：就目前应用较为广泛的DNA提取方法而言，高盐法提取DNA虽然简便、快速，但所提取的DNA纯度及稳定性较差，影响后期的聚合酶链反应；经典的酚一氯仿抽提法则由于消化时间长及抽提步骤繁琐，影响实验的进程。特别是高温加工对DNA存在一定程度的降解。因此，有必要对加工后熟肉的DNA提取方法上进行优化以提取足够数量和质量的DNA。另外一方面：已报道的研究多为定性的检测，缺乏同时对DNA提取液中多种肉类种源DNA浓度的定量研究。因实时荧光定量PCR技术的灵敏度极高，可能因运输及加工过程中污染其他肉类的定性检出误判为掺假。
解决以上问题及缺陷的意义为：使用多重实时荧光定量PCR技术，针对混合熟肉制品的核酸提取物采用牛、鸡、猪、鸭的特异性引物和探针在一个反应池中准确鉴定出四种肉类种源成分。通过分别计算出牛、鸡、猪、鸭DNA浓度的对数值和荧光信号达到设定循环阈值时PCR循环数的实时荧光定量线性公式并制作曲线，对未知样品开展实时荧光定量PCR检测，通过循环数即可计算出DNA浓度。本发明对熟肉制品种源快速鉴定并定量提供一种有效的技术方法，为各监督执法部门提供技术支撑，使之能够采用该种方法，对各类疑似掺假商家所销售的肉制品进行快速、准确的检验，及时发现并处理造价产品，提高我国市场上肉制品的安全性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种多重荧光定量PCR检测食品中肉类种源的引物组及方法。
本发明是这样实现的，一种多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的引物组，所述多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的引物组包括：牛、鸡、猪、鸭特异性引物和探针；
所述牛源性引物序列如SEQ ID NO：1所示，所述牛源性探针序列如SEQ ID NO：2所示；所述鸡源性引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述鸡源性探针序列如SEQ ID NO：4所示；所述猪源性引物序列如SEQ ID NO：5所示，所述猪源性探针序列如SEQ ID NO：6所示；所述鸭源性引物序列如SEQ ID NO：7所示，所述鸭源性探针序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的引物组的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法，所述多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法包括以下步骤：
步骤一，DNA的提取及浓度、纯度的测定；
步骤二，多重实时荧光PCR反应体系与条件的筛选；
步骤三，实验对照设置；
步骤四，检出限的确定；
步骤五，牛、鸡、猪、鸭源性成分的多重检测；
步骤六，定量标准曲线的制作。
进一步，步骤一中，所述DNA的提取及浓度、纯度的测定，包括：
将牛、鸡、猪、鸭生肉材料通过煮的方式制成熟肉制品，采用如下方法提取熟肉制品的DNA：
(1)裂解：在液氮中将组织研磨成完全粉末状，将50mg的组织转移到1.5ml离心管，加入0.6mldBIOZOL试剂，上下颠倒充分混匀约30秒，室温放置10min；
(2)离心：4℃离心13000g 10min，吸取上清转移到一个新的无菌2.0ml离心管内；
(3)DNA沉淀：向裂解混合物内加入0.7ml异丙醇，上下颠倒混匀5次，室温下放置5min后4℃离心6000g 10min，吸弃上清；
(4)DNA洗涤：向含有DNA沉淀的离心管内加入1ml浓度为75％的乙醇；通过将离心管颠倒混合10次使DNA充分悬浮，待DNA沉淀到管底后小心把上清吸出；
(5)DNA收集：除去管底残余乙醇后，缓慢加入去离子水将DNA沉淀溶解；用微量紫外分光光度计测量260nm和280nm处的吸光度A 260和A 280，以A 260/A 280的比值确定DNA的纯度并计算DNA浓度。
进一步，步骤二中，所述多重实时荧光PCR反应体系与条件的筛选，包括：
通过预试验筛选出最佳的引物和探针浓度；
所述q-PCR反应体系为：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)10μl，10μmol/L的四种物种上游引物各0.7μl，10μmol/L的四种物种下游引物各0.7μl，四种探针各0.6μl，模板1μl，超纯无菌水1μl，反应总体积为20μl；
所述反应液配置在冰上完成；设定反应条件为95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
进一步，步骤三中，所述实验对照设置，包括：
(1)牛、鸡、猪、鸭4种肉制品分别经过三种提取方式的DNA为阳性对照，以灭菌超纯水作为空白对照；
(2)按照筛选得到的所述多重实时荧光PCR反应体系与条件进行检测，每个反应设置3次平行；
(3)以出现荧光典型扩增曲线且Ct值≤35为阳性反应，无荧光典型扩增曲线为阴性反应。
进一步，步骤四中，所述检出限的确定，包括：
将经过煮熟的牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉的肉泥分别提取DNA，将提取的DNA溶液进行连续10倍稀释，使DNA含量达到相当于实际样品含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％，然后进行实时荧光PCR扩增。
进一步，步骤五中，所述牛、鸡、猪、鸭源性成分的多重检测，包括：
牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉分别按1：1：1：1的比例混合进行，煮熟后提取DNA，提取后对混合样品进行检测。
进一步，步骤六中，所述定量标准曲线的制作，包括：
(1)将牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉煮熟后采用抽提法提取的原液模板DNA 100ng/μl加灭菌双蒸水进行10倍梯度稀释，共稀释6次，分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001ng/μl即108、107、106、105、104、103、102ng/L；
(2)以不同稀释浓度的样品DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应程序，进行定量检测的检测试验；
(3)以Ct值为纵坐标，lgDNA浓度为横坐标绘制牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉的标准曲线；每组重复3次，计算阳性反应的平均Ct值。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的多重荧光定量PCR检测食品中肉类种源的引物组及方法，涉及基于qPCR测定混合熟肉制品中四种特定肉类，特别是牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉成分含量的方法。本发明提供了检测混合熟肉制品中牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉成分含量的多重实时荧光定量PCR牛、猪、鸡、鸭特异性核酸的引物和探针信息。另外，本发明还提供了含有上述牛、猪、鸡、鸭特异性引物和探针的检测试剂盒。采用本发明方法能够在一个反应孔中同时快捷、准确地检测出熟肉试样中牛、猪、鸡、鸭源性DNA成分并定量。本发明一方面建立在牛、猪、鸡、鸭物种的特异性引物和探针体系上，具有较高的准确性和抗干扰能力。另外一方面定量建立在目标DNA浓度的对数值和荧光信号达到设定循环阈值时PCR循环数的线性关系。本发明具有较强的可移植性，通过更换特异性引物探针体系可在一个反应孔中同时检测混合样中四种物种成分并定量。
本发明在混合肉制品品种鉴定的研究中，将使用荧光定量PCR技术，针对不同肉制品的特异性基因采用特异性引物和探针，能够快速检出鉴定不同肉制品的种源；研究出自制的不同工艺生产的混合肉制品样本中的种源鉴定及定量方法。同时，本发明创新性地针对以煮熟为代表的肉制品中，如掺假其他肉制品能通过多重荧光定量PCR技术在一个反应孔中一次性准确快速检测出四种肉类成分并定量，节省检测时间和成本。
本发明设计出了将煮熟的牛、鸡、猪、鸭的特异性引物和探针信息，并定制生产了引物和探针的产品。将牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉按1：1：1：1的比例混合，混合肉煮熟后使用抽提法有效提取核酸。使用多重实时荧光定量PCR技术，针对混合肉制品的核酸提取物采用牛、鸡、猪、鸭的特异性引物和探针在一个反应池中准确鉴定出四种肉类种源成分。分别计算出牛、鸡、猪、鸭DNA浓度的对数值和荧光信号达到设定循环阈值时PCR循环数的实时荧光定量线性公式并制作曲线。对未知样品开展实时荧光定量PCR检测，通过循环数即可计算出DNA浓度。
本发明具有能对煮熟为代表的熟肉制品的牛、鸡、猪、鸭肉样品核酸准确高效提取方法，提取到了适用于实时荧光定量的DNA；通过软件设计出了牛、鸡、猪、鸭用于实时荧光定量的特征性引物和探针，并合成了引物和四种添加不同荧光标记信号的探针产品。本发明使用实时荧光定量PCR技术，采用四种引物探针组分别成功检出不同烹饪方式制成的熟肉制品中的牛、鸡、猪、鸭成分，并分别研究出了四种物种检出限、定量限和制作了定量线性曲线。本发明通过对模拟样品的实验，采用多重荧光定量PCR技术，一次性成功检测出了熟肉制品中的牛、鸡、猪、鸭成分，全过程大约2小时，和传统方法相比不但节省了检测原料及试剂成本还大大缩短了检测的时间，特别是为涉及肉制品掺假的食品安全应急执法检测提供了较为可靠并快捷的技术方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的牛源性成分定量检测标准曲线示意图。
图3是本发明实施例提供的鸡源性成分定量检测标准曲线示意图。
图4是本发明实施例提供的猪源性成分定量检测标准曲线示意图。
图5是本发明实施例提供的鸭源性成分定量检测标准曲线示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种多重荧光定量PCR检测食品中肉类种源的引物组及方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的引物组包括：牛、鸡、猪、鸭特异性引物和探针；所述牛源性引物序列如SEQ ID NO：1所示，牛源性探针序列如SEQ ID NO：2所示；所述鸡源性引物序列如SEQ ID NO：3所示，鸡源性探针序列如SEQID NO：4所示；所述猪源性引物序列如SEQ ID NO：5所示，猪源性探针序列如SEQ ID NO：6所示；所述鸭源性引物序列如SEQ ID NO：7所示，鸭源性探针序列如SEQ ID NO：8所示。
如图1所示，本发明实施例提供的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法包括以下步骤：
S101，DNA的提取及浓度、纯度的测定；
S102，多重实时荧光PCR反应体系与条件的筛选；
S103，实验对照设置；
S104，检出限的确定；
S105，牛、鸡、猪、鸭源性成分的多重检测；
S106，定量标准曲线的制作。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
(一)发明概述
本发明涉及基于qPCR测定混合熟肉制品中四种特定肉类，特别是牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉成分含量的方法。本发明提供了检测混合熟肉制品中牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉成分含量的多重实时荧光定量PCR牛、猪、鸡、鸭特异性核酸的引物和探针信息。另外，本发明还提供了含有上述牛、猪、鸡、鸭特异性引物和探针的检测试剂盒。采用本发明方法能够在一个反应孔中同时快捷、准确地检测出熟肉试样中牛、猪、鸡、鸭源性DNA成分并定量。本发明一方面建立在牛、猪、鸡、鸭物种的特异性引物和探针体系上，具有较高的准确性和抗干扰能力。另外一方面定量建立在目标DNA浓度的对数值和荧光信号达到设定循环阈值时PCR循环数的线性关系。本发明具有较强的可移植性，通过更换特异性引物探针体系可在一个反应孔中同时检测混合样中四种物种成分并定量。
1.研究对不同工艺加工的不同肉样品的DNA的准确高效提取方法，使用但不限于热裂解法、滤膜法以及磁珠法。目前在动物源性鉴定中，对不同工艺加工的肉类样品的前处理以及DNA提取较为笼统，多数仅以生鲜肉类为主，本研究将对不同工艺加工的肉制品样本进行分别研究。
2.在混合肉制品品种鉴定的研究中，将使用荧光定量PCR技术，针对不同肉制品的特异性基因采用特异性引物和探针，快速检出鉴定不同肉制品的种源。
3.研究出自制的不同工艺生产的混合肉制品样本中的种源鉴定及定量方法。
本发明的主要创新之处在于针对以煮熟为代表的肉制品中，如掺假其他肉制品能通过多重荧光定量PCR技术在一个反应孔中一次性准确快速检测出四种肉类成分并定量，节省检测时间和成本。
本发明的实施过程及结果：设计出了将煮熟的牛、鸡、猪、鸭的特异性引物和探针信息，并定制生产了引物和探针的产品。将牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉按1：1：1：1的比例混合，混合肉煮熟后使用抽提法有效提取核酸。使用多重实时荧光定量PCR技术，针对混合肉制品的核酸提取物采用牛、鸡、猪、鸭的特异性引物和探针在一个反应池中准确鉴定出四种肉类种源成分。分别计算出牛、鸡、猪、鸭DNA浓度的对数值和荧光信号达到设定循环阈值时PCR循环数的实时荧光定量线性公式并制作曲线。对未知样品开展实时荧光定量PCR检测，通过循环数即可计算出DNA浓度。
(二)材料和方法
1、试验材料
1.1试验肉类
牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉均为市购。熟肉制品为采用市购生肉采用煮的烹饪方式自制。
1.2仪器与试剂
dBIOZOL基因组DNA提取试剂盒，超纯水(Milli-Q级)。荧光PCR试剂Premix ExTaqTM。
主要仪器设备：全自动样品快速研磨仪(型号为JXFSTPRP-32)，由上海净信实业发展有限公司生产；冷冻离心机(型号为H2050R-1)，由湘仪离心机仪器有限公司生产；荧光定量PCR仪(型号为LightCycler96)，由瑞士罗氏公司生产；各种量程移液器，由英国吉尔森公司生产；微量分光光度计(型号为TGem Pro)，由天根生化科技(北京)有限公司生产。
1.3引物探针序列
牛、鸡、猪、鸭特异性引物和探针依据牛、鸡、猪、鸭的特异性线粒体基因利用Primer Express 5.0软件进行设计并验证。实时荧光PCR引物和探针序列见表1。
表1实时荧光定量PCR引物探针序列
2、方法
2.1 DNA的提取及浓度、纯度的测定
将牛、鸡、猪、鸭生肉材料通过煮的方式制成熟肉制品。采用以下方法提取熟肉制品的DNA，步骤如下：
1、裂解：在液氮中将组织研磨成完全粉末状，将50mg左右的组织转移到1.5ml离心管，加入0.6mldBIOZOL试剂，上下颠倒充分混匀约30秒，室温放置10分钟。2、离心：4℃离心13000g 10分钟，吸取上清转移到一个新的无菌2.0ml离心管内。3、DNA沉淀：向裂解混合物内加入0.7ml异丙醇，上下颠倒混匀5次，室温下放置5分钟后4℃离心6000g 10分钟，吸弃上清。4、DNA洗涤：向含有DNA沉淀的离心管内加入1ml浓度为75％的乙醇。通过将离心管颠倒混合10次使DNA充分悬浮。待DNA沉淀到管底后小心把上清吸出。5、DNA收集：除去管底残余乙醇后，缓慢加入去离子水将DNA沉淀溶解。用微量紫外分光光度计测量260nm和280nm处的吸光度A260和A280，以A260/A280的比值确定DNA的纯度并计算其浓度。
2.2多重实时荧光PCR反应体系与条件
通过预试验筛选出最佳的引物和探针浓度。q-PCR反应体系为：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)10μl，四种物种上游引物各(10μmol/L)0.7μl，四种物种下游引物各(10μmol/L)0.7μl，四种探针各0.6μl，模板1μl，超纯无菌水1μl，反应总体积为20μl。反应液配置在冰上完成。设定反应条件为95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
2.3实验对照
牛、鸡、猪、鸭4种肉制品分别经过三种提取方式的DNA为阳性对照，以灭菌超纯水作为空白对照。按照2.2的程序进行检测，每个反应设置3次平行。以出现荧光典型扩增曲线且Ct值≤35为阳性反应，无荧光典型扩增曲线为阴性反应。
2.4检出限的确定
将经过煮熟的牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉的肉泥分别提取DNA，将提取的DNA溶液进行连续10倍稀释，使其含量达到相当于实际样品含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％，然后进行实时荧光PCR扩增。
2.5牛、鸡、猪、鸭源性成分的多重检测
牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉分别按1：1：1：1的比例混合进行，煮熟后按2.1的方法提取DNA，提取后采用2.2所述方法对混合样品进行检测。
2.6定量标准曲线的制作
将牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉煮熟后采用抽提法提取的原液模板DNA 100ng/μl加灭菌双蒸水进行10倍梯度稀释，共稀释6次。分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001ng/μl即108、107、106、105、104、103、102ng/L，以不同稀释浓度的样品DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应程序，反应条件同2.2，进行定量检测的检测试验。以Ct值为纵坐标，lgDNA浓度为横坐标绘制牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉的标准曲线。每组重复3次，计算阳性反应的平均Ct值。
(三)结果
1、核酸纯度及浓度检测
将抽提法提取的牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉制品的DNA经微量分光光度计260nm和280nm检测，A 260/A 280的比值均在1.7～1.9范围内，详见表2。
表2抽提法提取的四种肉类DNA的比较(x±s，n＝3)
2、有效性及特异性检测
将分别煮熟后的4种原料(牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉)经过抽提法所提取的DNA分别进行荧光检测，结果空白对照无扩增曲线，只有对应的相同种源的探针标记出现典型的S型扩增曲线且其Ct值都小于35，详见表3。
表3四种肉类煮后抽提法提取核酸的实时荧光PCR特异性结果
4、检出限检测
以制备好的牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉DNA样本作为模板，按2.4的方法，进行实时荧光PCR扩增。当DNA样本稀释浓度为0.01％时，Ct值大于35，并且很不稳定；当DNA样本稀释浓度为0.1％及以上时，有明显扩增曲线且Ct值均小于35，有较好的定量效果。因此，本方法对于牛源性、鸡源性、猪源性、鸭源性的最低检出限为0.1％，有较实用的检测灵敏度，可以满足日常检测要求。
5、混合样品的多重荧光检测
提取煮的烹饪方式制作的1：1：1：1牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉混合样品进行多重实时荧光PCR检测，结果均明显出现4条扩增曲线且Ct值均小于35，为阳性反应，详见表3。表明提取煮的烹饪方式制作的混合肉制品能成功采用多重荧光实时PCR方法在一个反应体系里面同时检测出牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉成分，详见表4。
表4三种方法提取的三种烹饪方式混合肉类的多重实时荧光检测结果
6、定量分析结果
通过牛、鸡、猪、鸭引物和探针对108、107、106、105、104、103、102ng/L，7个不同质量浓度梯度的牛、鸡、猪、鸭熟肉样品DNA进行实时荧光定量PCR扩增试验。结果具体数值如表5所示。由表5可知，稀释至102ng/L的牛、鸡、猪、鸭基因组DNA样本(3个平行试验)虽出现典型扩增曲线，但Ct值大于35，不能确认检出及计算。103ng/L的牛、鸡、猪、鸭基因组DNA样本(3个平行试验)出现典型扩增曲线，且扩增结果均Ct值小于35，判定为确认检出。所以上述结果表明稀释至103ng/L的牛、鸡、猪、鸭基因组DNA样本中仍能检测到其源性成分，即本研究中牛、鸡、猪、鸭特异性引物和探针定量限度可达到103ng/L。本研究使用△Ct法进行相对定量，通过对牛、鸡、猪、鸭肉样品DNA进行一系列梯度稀释，DNA浓度的对数值与其对应的Ct值呈线性关系，以Ct值为纵轴、模板DNA浓度的对数值为横轴得到回归方程，结果如图2、如图3、如图4、如图5所示。牛的实时荧光定量PCR的标准曲线方程为：y＝-3.2471x+44.1976，R2＝0.9934；鸡的实时荧光定量PCR的标准曲线方程为：y＝-3.4657x+45.0014，R2＝0.9902；猪的实时荧光定量PCR的标准曲线方程为：y＝-3.1531x+43.6656，R2＝0.9924；鸭的实时荧光定量PCR的标准曲线方程为：y＝-3.3269x+44.6277，R2＝0.9916。可通过将检测肉制品的相应源性的Ct值带入标准曲线的公式中，计算得到肉制品提取的核酸溶液中牛、鸡、猪、鸭的定量检测结果。以上研究结果表明牛、鸡、猪、鸭的引物和探针在定量检测方面具有较好的检测能力。
表5牛、鸡、猪、鸭引物探针的实时荧光定量检测结果
(四)结论
1、本发明具有能对煮熟为代表的熟肉制品的牛、鸡、猪、鸭肉样品核酸准确高效提取方法，提取到了适用于实时荧光定量的DNA。
2、通过软件设计出了牛、鸡、猪、鸭用于实时荧光定量的特征性引物和探针，并合成了引物和四种添加不同荧光标记信号的探针产品。
3、使用实时荧光定量PCR技术，采用四种引物探针组分别成功检出不同烹饪方式制成的熟肉制品中的牛、鸡、猪、鸭成分。并分别研究出了四种物种检出限、定量限和制作了定量线性曲线。
4、通过对模拟样品的实验，采用多重荧光定量PCR技术，一次性成功检测出了熟肉制品中的牛、鸡、猪、鸭成分，全过程大约2小时，和传统方法相比不但节省了检测原料及试剂成本还大大缩短了检测的时间，特别是为涉及肉制品掺假的食品安全应急执法检测提供了较为可靠并快捷的技术方法。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
本实验的步骤如下：
(1)采用本发明的方法对煮的方式制作的1：1：1：1牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉混合样品提取DNA后进行多重实时荧光定量PCR检测，结果成功检出牛、鸡、猪、鸭四种动物种源成分，Ct值分别为20.17、18.46、19.55、18.94，根据荧光定量曲线公式计算出提取的DNA溶液中牛、鸡、猪、鸭的DNA含量分别为2.5×107ng/L、4.6×107ng/L、4.5×107ng/L、5.2×107ng/L。
(2)对市购的牛肉粒、烤鸡翅、猪肉脯、烤鸭分别采用本发明的方法提取DNA后进行多重实时荧光定量PCR检测。结果：牛肉粒只检出牛的成分，Ct值为20.89，根据荧光定量曲线公式计算出提取的DNA溶液中牛的DNA含量为1.5×107ng/L；烤鸡翅只检出鸡的成分，Ct值为19.67，根据荧光定量曲线公式计算出提取的DNA溶液中鸡的DNA含量为2.0×107ng/L；猪肉脯只检出猪的成分，Ct值为21.08，根据荧光定量曲线公式计算出提取的DNA溶液中猪的DNA含量为1.4×107ng/L；烤鸭只检出鸭的成分，Ct值为19.35，根据荧光定量曲线公式计算出提取的DNA溶液中鸭的DNA含量为4.0×107ng/L。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 自贡检验检测院
<120> 多重荧光定量PCR检测食品中肉类种源的引物组及方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttagcaggca acctagccca cgaacagagg ggtttggtat tg 42
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttcagtaga tctaaccatt 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagccggcaa cctagcccaa cgaatagggg tgtttggtat tg 42
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctttatcact accatcatc 19
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctttagctg gaaacttagc ccaacaaaca ggggtgtttg gtattg 46
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caatcctagg ggctatt 17
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctagcaggca acctagccca cgaaaagtgg ggtttggtat tg 42
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acctggctat cttctcactt ca 22
Claims (8)
1.一种多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的引物组，其特征在于，所述多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的引物组包括：牛、鸡、猪、鸭特异性引物和探针；
所述牛源性引物序列如SEQ ID NO：1所示，所述牛源性探针序列如SEQ ID NO：2所示；所述鸡源性引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述鸡源性探针序列如SEQ ID NO：4所示；所述猪源性引物序列如SEQ ID NO：5所示，所述猪源性探针序列如SEQ ID NO：6所示；所述鸭源性引物序列如SEQ ID NO：7所示，所述鸭源性探针序列如SEQ ID NO：8所示。
2.一种应用如权利要求1所述的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的引物组的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法，其特征在于，所述多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法包括以下步骤：
步骤一，DNA的提取及浓度、纯度的测定；
步骤二，多重实时荧光PCR反应体系与条件的筛选；
步骤三，实验对照设置；
步骤四，检出限的确定；
步骤五，牛、鸡、猪、鸭源性成分的多重检测；
步骤六，定量标准曲线的制作。
3.如权利要求2所述的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法，其特征在于，步骤一中，所述DNA的提取及浓度、纯度的测定，包括：
将牛、鸡、猪、鸭生肉材料通过煮的方式制成熟肉制品，采用如下方法提取熟肉制品的DNA：
(1)裂解：在液氮中将组织研磨成完全粉末状，将50mg的组织转移到1.5ml离心管，加入0.6mldBIOZOL试剂，上下颠倒充分混匀约30秒，室温放置10min；
(2)离心：4℃离心13000g 10min，吸取上清转移到一个新的无菌2.0ml离心管内；
(3)DNA沉淀：向裂解混合物内加入0.7ml异丙醇，上下颠倒混匀5次，室温下放置5min后4℃离心6000g 10min，吸弃上清；
(4)DNA洗涤：向含有DNA沉淀的离心管内加入1ml浓度为75％的乙醇；通过将离心管颠倒混合10次使DNA充分悬浮，待DNA沉淀到管底后小心把上清吸出；
(5)DNA收集：除去管底残余乙醇后，缓慢加入去离子水将DNA沉淀溶解；用微量紫外分光光度计测量260nm和280nm处的吸光度A260和A280，以A260/A280的比值确定DNA的纯度并计算DNA浓度。
4.如权利要求2所述的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法，其特征在于，步骤二中，所述多重实时荧光PCR反应体系与条件的筛选，包括：
通过预试验筛选出最佳的引物和探针浓度；
所述q-PCR反应体系为：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)10μl，10μmol/L的四种物种上游引物各0.7μl，10μmol/L的四种物种下游引物各0.7μl，四种探针各0.6μl，模板1μl，超纯无菌水1μl，反应总体积为20μl；
所述反应液配置在冰上完成；设定反应条件为95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
5.如权利要求2所述的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法，其特征在于，步骤三中，所述实验对照设置，包括：
(1)牛、鸡、猪、鸭4种肉制品分别经过三种提取方式的DNA为阳性对照，以灭菌超纯水作为空白对照；
(2)按照筛选得到的所述多重实时荧光PCR反应体系与条件进行检测，每个反应设置3次平行；
(3)以出现荧光典型扩增曲线且Ct值≤35为阳性反应，无荧光典型扩增曲线为阴性反应。
6.如权利要求2所述的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法，其特征在于，步骤四中，所述检出限的确定，包括：将经过煮熟的牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉的肉泥分别提取DNA，将提取的DNA溶液进行连续10倍稀释，使DNA含量达到相当于实际样品含量分别为100％、10％、1％、0.1％、0.01％，然后进行实时荧光PCR扩增。
7.如权利要求2所述的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法，其特征在于，步骤五中，所述牛、鸡、猪、鸭源性成分的多重检测，包括：牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉分别按1：1：1：1的比例混合进行，煮熟后提取DNA，提取后对混合样品进行检测。
8.如权利要求2所述的多重荧光定量PCR检测熟制食品中肉类种源的方法，其特征在于，步骤六中，所述定量标准曲线的制作，包括：
(1)将牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉煮熟后采用抽提法提取的原液模板DNA100ng/μl加灭菌双蒸水进行10倍梯度稀释，共稀释6次，分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001ng/μl即108、107、106、105、104、103、102ng/L；
(2)以不同稀释浓度的样品DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应程序，进行定量检测的检测试验；
(3)以Ct值为纵坐标，lgDNA浓度为横坐标绘制牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉的标准曲线；每组重复3次，计算阳性反应的平均Ct值。
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| CN114214434A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-03-22 | 中国肉类食品综合研究中心 | 同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重rt-pcr预混试剂冻干球及其制备方法与应用 |
| CN114214434B (zh) * | 2022-02-22 | 2022-07-01 | 中国肉类食品综合研究中心 | 同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重rt-pcr预混试剂冻干球及其制备方法与应用 |
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