CN114214434B - 同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重rt-pcr预混试剂冻干球及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT‑PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用。本发明的制备多重RT‑PCR预混试剂冻干球的方法，其中，所述冻干球包括多重荧光PCR反应体系和保护剂，所述多重荧光PCR反应体系包含5对特异性引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑10所示，所述保护剂包括聚乙二醇8000、Triton X‑100、甘露醇和海藻糖。本发明方法制备的多重RT‑PCR冻干球，可常温运输和储存，能用于鉴别肉或肉制品中是否含有猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种动物源性成分。具有检测准确，操作简便快速高效的优点。

Description

同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT-PCR预混试剂冻 干球及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT-PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用。
背景技术
由于肉类掺假的情况屡见不鲜，不仅侵害了消费者利益，也会对整个肉类产业造成巨大影响，因此需要可靠的肉类快速真伪鉴别技术，作为相关部门对肉类食品安全进行监管的重要检测手段。
多重实时荧光PCR技术应用在物种鉴别领域，具有特异性强、灵敏准确、高通量和低成本的优点。但由于实时荧光PCR反应体系中的核心组分Taq酶的活性对温度较为敏感，且荧光染料需要避光等诸多因素，因此这一类试剂在保存和运输条件上的要求十分苛刻。液体状态的试剂只能低温避光保存以避免其性状发生变化从而影响使用效果。其次，目前市面上应用于物种检测的荧光PCR产品多为各个组分独立封装的液体试剂盒形式，除了运输和保存的弊端外，在使用时需要人工配制反应液，操作繁琐且增加了误差和错误率。
液体试剂经过冷冻干燥排除95%~99%的水分后，能够有效延长保存期。但由于多重PCR反应体系对酶稳定性要求极其苛刻，使用常规的冻干保护剂和通用的冷冻干燥流程对多重PCR反应体系进行冻干后依旧会导致多个扩增产物间比例发生巨大变化，致使检测方法失去原有效果。因此，为将PCR反应试剂在冻干过程中热敏性酶发生变性或失活的幅度降到最低，且保证其他组分如引物、dNTP、荧光染料在冻干前后具有相同的效力，仍需要进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有肉类鉴别技术的不足，提供一种可同步、快速鉴别肉或肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种源性成分的多重荧光PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
一种制备多重RT-PCR预混试剂冻干球的方法，所述冻干球包括多重荧光PCR反应体系和保护剂，所述多重荧光PCR反应体系包含5对特异性引物组合，其核苷酸序列如SEQID NO.1-10所示，所述保护剂包括聚乙二醇8000、Triton X-100、甘露醇和海藻糖。
本发明的冻干球含有以猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉的线粒体DNA为靶序列分别设计的5对特异性引物：羊F/羊R、牛F/牛R、狗狐貉F/狗狐貉R、猪F/猪R、鸡鸭F/鸡鸭R，其中，羊F/羊R可同时扩增绵羊和山羊源性成分；狗狐貉F/狗狐貉R可同时扩增狗源性、狐源性和貉源性成分；鸡鸭F/鸡鸭R可同时扩增鸡源性和鸭源性成分。应用本发明提供的上述引物组合，以待测肉或肉制品的DNA为模板，使用多重荧光PCR方法进行检测时，各特异性引物扩增产物的Tm值具有显著差异，可通过熔解曲线峰图谱（峰的个数和Tm值）分析进行鉴别。各特异性引物序列如下：
对绵羊、山羊源性成分扩增时所需的特异性引物为：
羊F：5'- AACAAAGCGCCTTAAACCAATT -3'（SEQ ID NO.1）
羊R：5'-CCTTTTCTAGGGCAGGTTTTGT -3'（SEQ ID NO.2）；
对牛源性成分扩增时所需的特异性引物为：
牛F：5'- GTTCTTCACGACACATACTACGTT -3'（SEQ ID NO.3）
牛R：5'- GCAAATACAGCTCCTATTGATAAA -3'（SEQ ID NO.4）；
对狗、狐、貉源性成分扩增时所需的特异性引物为：
狗狐貉F：5'- AAGGGAATGATGAAAGACAT-3'（SEQ ID NO.5）
狗狐貉R：5'- GAGTTGATCCTTTTAGATTGTT-3'（SEQ ID NO.6）；
对猪源性成分扩增时所需的特异性引物为：
猪F：5'- TACTTCTACTATCCCTGCCAGTTC -3'（SEQ ID NO.7）
猪R：5'- TGATAAAGGATAGGGTCTCCACCA -3'（SEQ ID NO.8）；
对鸡、鸭源性成分扩增时所需的特异性引物为：
鸡鸭F：5'- GAGAACTACGAGCACAAACGCTT-3'（SEQ ID NO.9）
鸡鸭R：5'- CCCATAGGCTATACCTTGACCTGT-3'（SEQ ID NO.10）。
为了使上述引物在冻干复溶后仍能实现有效的同步检测辨别多种动物源性成分的目的，本发明对其保护剂体系进行了大量研究，发现多数保护剂在单独使用时并不能起到确保5重荧光PCR反应体系冻干前后的实验效果，这证实了多重荧光PCR反应对试剂稳定性的要求极其苛刻。最终，针对本发明的特定多重荧光PCR反应体系，本发明找到了一种特定保护剂体系，其有效保证了冻干复溶后的检测效果。
本发明的方法中，所述保护剂包括：19.92~20.28wt%聚乙二醇8000、1.74~1.86wt%Triton X-100、6.06~6.24wt%甘露醇、6.06~6.24wt%海藻糖。
在上述特定保护剂组分配比下，可保证更佳的冻干复溶效果。
本发明的方法中，每20μL所述多重荧光PCR反应体系包含：SYBR Green Ⅰ Master预混液10μL，SEQ ID NO.1-2所示的引物各2.8~3pmol、SEQ ID NO.3-4所示的引物各4.2~4.5pmol、SEQ ID NO.5-6所示的引物各6.2~6.5pmol、SEQ ID NO.7-8所示的引物各2.3~2.5pmol、SEQ ID NO.9-10所示的引物各3.3~3.5pmol，其余体积用ddH2O补足。
本发明的方法中，所述多重荧光PCR反应体系与所述保护剂的体积比为1：0.2。
多重荧光PCR反应扩增所得的产物量，主要与各个引物与模板结合难易度和扩增效率相关，更为复杂的是扩增过程当中各组产物存在竞争与抑制关系。本发明研究时发现在本发明体系下，在引物序列、酶的效率、反应所需底物原料、扩增程序等因素事先确定下来的情况下，反应体系中的引物配比影响着冻干球复溶前后的扩增结果中各个产物量是否能达到期望的检测效果。本发明经大量研究后，获得的本发明限定的上述各引物配比可进一步确保5重荧光PCR反应体系在冻干前后实验效果的一致性和有效性。
本发明的方法中，包括将所述多重荧光PCR反应体系与所述保护剂混合后，先滴入液氮再进行冷冻干燥的步骤；所述冷冻干燥的工艺顺序依次为：预冻-40℃，0.5~1h；主干燥-40℃，0.1mbar，0.5~1h；-35℃，0.1mbar，2~2.5h；-30℃，0.1mbar，10~12h；0℃，0.1mbar，2~2.5h；20℃，0.05mbar，2~2.5h；终末干燥30℃，0.01mbar，3~4h。
将上述冻干工艺，结合本发明的上述PCR反应体系引物配比和保护剂组分配方可获得最佳效果。
本发明还提供一种多重RT-PCR预混试剂冻干球，其通过上述方法制备得到。
本发明另提供一种上述冻干球在同步鉴别肉或肉制品中多种动物源性成分中的应用。
本发明的应用中，所述动物源性成分为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐和貉。
本发明的应用中，应用时，以待测肉或肉制品的DNA和复溶后的所述冻干球的混合物为待测物，使用RT-PCR方法进行检测，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解曲线峰值图，根据熔解曲线峰值图中峰的个数和位置判定结果；每一种特异性扩增产物峰代表一种特定的动物源性成分，其中，Tm值在71.1~73.7 ℃范围内出现的熔解曲线峰为绵羊或山羊源性成分检出；Tm值在74.0~75.4 ℃范围内出现的熔解曲线峰为牛源性成分检出；Tm值在76.2~78.1 ℃范围内出现的熔解曲线峰为狗或狐狸或貉源性成分检出；Tm值在80.3~81.2 ℃范围内出现的熔解曲线峰为猪源性成分检出；Tm值在84.7~87.5℃范围内出现的熔解曲线峰为鸡或鸭源性成分检出。
本发明的应用中，RT-PCR反应条件为：（1）预变性：95℃，5min；（2）变性：95℃，10~15 s；退火+延伸：57℃，45~60 s，30个循环；（3）熔解曲线：95℃，1min；70℃，1min；以0.02℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度；降温至40℃，1min。
本发明的有益效果至少在于：
通过本发明方法制备的多重荧光PCR冻干球，可常温运输和储存，能用于鉴别肉或肉制品中是否含有猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种动物源性成分。具有检测准确，操作简便快速高效的优点，能够实现每个独立的冻干球均包含了一次多重荧光PCR反应所需的所有组分，使用时仅需加入去离子水溶解并加入待测样品DNA模板，即可上机检测。能满足大批量、快速鉴别的需求，可有效抵御肉制品掺假，切实保护消费者的利益，具有良好的社会效益。同时也最大程度的简化了实验操作步骤，降低了实验误差和操作失误的风险。
附图说明
图1为本发明用于同步鉴别食品中多种动物源性成分的5重荧光PCR熔解曲线峰图。其中，峰1为绵羊或山羊、峰2为牛、峰3为狗或狐狸或貉、峰4为猪、峰5为鸡或鸭。
图2为5重荧光PCR反应体系和保护剂组分混合后液氮成球并转移至预冻的8联排管示意图。图中，左侧为液氮成球照片，右侧为转移小球的照片。
图3为5重荧光PCR冻干球稳定性验证熔解曲线峰图之一。其中，（a）为冻干后1天验证结果、（b）为冻干后7天验证结果。其中，峰1为绵羊或山羊、峰2为牛、峰3为狗或狐狸或貉、峰4为猪、峰5为鸡或鸭。
图4为5重荧光PCR冻干球稳定性验证熔解曲线峰图之二。其中，（c）为冻干后15天验证结果、（d）为冻干后30天验证结果。其中，峰1为绵羊或山羊、峰2为牛、峰3为狗或狐狸或貉、峰4为猪、峰5为鸡或鸭。
图5为5重荧光PCR冻干球绝对检出限熔解曲线峰图之一。其中，（a）为绵羊梯度稀释模板检出限结果、（b）为牛梯度稀释模板检出限结果。
图6为5重荧光PCR冻干球绝对检出限熔解曲线峰图之二。其中，（c）为狐狸梯度稀释模板检出限结果、（d）为猪梯度稀释模板检出限。
图7为5重荧光PCR冻干球绝对检出限熔解曲线峰图之三。所示为鸭梯度稀释模板检出限结果。
图8为5重荧光PCR冻干球相对检出限熔解曲线峰图之一。其中，（a）为绵羊和狐狸混合模板相对检出限结果（峰1为绵羊、峰3为狐狸）、（b）为绵羊和猪混合模板相对检出限结果（峰1为绵羊、峰4为猪）。
图9为5重荧光PCR冻干球相对检出限熔解曲线峰图之二。其中，（c）为绵羊和鸭混合模板相对检出限结果（峰1为绵羊、峰5为鸭）、（d）为牛和狐狸混合模板相对检出限结果（峰2为牛、峰3为狐狸）。
图10为5重荧光PCR冻干球相对检出限熔解曲线峰图之三。其中，（e）为牛和猪混合模板相对检出限结果（峰2为牛、峰4为猪）、（f）为牛和鸭混合模板相对检出限结果（峰2为牛、峰5为鸭）。
图11为5重荧光PCR冻干球对比例熔解曲线峰图之一。其中，（a）为对比例1的实验结果、（b）为对比例2的实验结果。其中，峰1为绵羊或山羊、峰2为牛、峰3为狗或狐狸或貉、峰4为猪、峰5为鸡或鸭。
图12为5重荧光PCR冻干球对比例熔解曲线峰图之二。其中，（c）为对比例3的实验结果、（d）为对比例4的实验结果。其中，峰1为绵羊或山羊、峰2为牛、峰3为狗或狐狸或貉、峰4为猪、峰5为鸡或鸭。
图13为5重荧光PCR冻干球对比例熔解曲线峰图之三。其中，（e）为对比例5中冻干前的实验结果、（f）为对比例5中冻干后的实验结果。其中，峰1为绵羊或山羊、峰2为牛、峰3为狗或狐狸或貉、峰4为猪、峰5为鸡或鸭。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
主要仪器设备：冷冻干燥机（CHRIST，德国）、荧光PCR仪（Roche 480 Ⅱ，瑞士）、高速台式离心机（Eppendorf 5417R，德国）、微量移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL）、均质仪（Omni Prep，美国）、荧光酶标仪（Bio tek Synergy H4，美国）等。主要试剂：血液和动物组织的DNA提取试剂盒购于Qiagen公司；SYBR Green Ⅰ Master预混液购于Roche公司；引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
实施例1 5重PCR反应体系及检测结果
1 样品处理方法
分别称取适量猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐狸、貉共9种肉类样品至离心管中，将肉或肉制品与灭菌去离子双蒸水以1:4比例混合，用组织匀浆机12000 r/min均质10min，制成组织匀浆液备用。
2 DNA提取方法
使用DNeasy动物组织的DNA提取试剂盒提取各物种DNA，按照试剂盒说明书进行操作，或者公认的、具有相同效力的其他提取方法。提取出的DNA采用荧光酶标仪测定260 nm和280 nm处的吸光值，计算DNA浓度和纯度。
3 引物序列
根据本发明5对特异性引物组合的核苷酸序列SEQ ID NO.1-10合成引物。
4 5重PCR反应
4.1 5重PCR反应体系，如下表1所示：
表1 5重PCR反应体系组分及配比（总体积20 μL）
Figure 562261DEST_PATH_IMAGE001
4.2 PCR反应条件
（1）预变性：95℃，5min；（2）变性：95℃，15s；退火+延伸：57℃，45s，30个循环；（3）熔解曲线：95℃，1min；70℃，1min；以0.02℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度（465-510nm）；降温至40℃，1min；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解曲线峰值图。
5 检测结果
检测结果如图1所示，每一种特异性扩增产物峰代表一种特定的动物源性成分，图1中所示为5种动物源性成分混合模板检测结果，从左至右的峰依次代表绵羊或山羊、牛、狗或狐狸或貉、猪、鸡或鸭。
由于检测模板组成成分不同，产物所对应的熔解曲线峰Tm值会有不同程度的偏移。Tm值在71.1~73.7 ℃范围内出现的熔解曲线峰为绵羊或山羊源性成分检出；Tm值在74.0~75.4 ℃范围内出现的熔解曲线峰为牛源性成分检出；Tm值在76.2~78.1 ℃范围内出现的熔解曲线峰为狗或狐狸或貉源性成分检出；Tm值在80.3~81.2 ℃范围内出现的熔解曲线峰为猪源性成分检出；Tm值在84.7~87.5 ℃范围内出现的熔解曲线峰为鸡或鸭源性成分检出。
实施例2 冻干球制备方法及检验结果
1 冻干球制备
1.1 冻干保护剂
配方：20.1wt%聚乙二醇8000、1.8wt% Triton X-100、6.15wt%甘露醇、6.15%海藻糖。
按配方配置各组分终浓度为上述质量百分比的水溶液作为保护剂组分。
1.2 液氮成球
将多重荧光PCR反应体系（与上述表1中的5重荧光PCR反应体系记载相同，区别仅在于不含模板）和保护剂组分以1:0.2的体积比例混合均匀后，以每24μL体积滴入液氮中凝结成圆形小球；待液氮挥发后迅速转移小球至8连排反应管中，每管1个小球。参见图2所示，左侧为液氮成球照片，右侧为转移小球的照片，从中可见每个小球形状规则、独立且饱满。
1.2 冷冻干燥
将所述8联排反应管放入已预冷的冻干机中，冷冻干燥工艺顺序依次为：预冻-40℃，0.5h；主干燥-40℃，0.1mbar，0.5h；-35℃，0.1mbar，2h；-30℃，0.1mbar，10h；0℃，0.1mbar，2h；20℃，0.05mbar，2h；终末干燥30℃，0.01mbar，3h。
2 冻干球有效性与稳定性验证
向放置冻干球的8联排每个反应管中加入18μL去离子水至冻干球完全溶解（约30~60s），并加入上述实施例1步骤2制备的DNA模板2μL（5ng/μL），按照实施例1中所述PCR反应条件上机检测。
5重荧光PCR冻干球稳定性验证结果如图3至图4所示，利用本发明方法制备的冻干球在冻干后常温真空保存1天、7天、15天、30天均可保持所有熔解曲线峰可以识别，且峰型无明显幅度变化。证明冻干球在室温下保存仍然可以实验效果稳定，可以有效鉴别样品所含动物源性成分。
实施例3 冻干球检出限
1 模板制备方法
1.1 绝对检出限模板
参照实施例1中的DNA提取方法，将绵羊、牛、狐狸、猪、鸭的DNA模板分别稀释成5ng/μL作为初始模板，然后将初始模板10倍梯度稀释至10-3备用。检测时模板添加量为2μL。
1.2 相对检出限模板
参照实施例1中的DNA提取方法，将绵羊、牛、狐狸、猪、鸭的DNA模板稀释成5ng/μL作为初始模板，然后按照单一物种百分比含量为1%，10%，30%，50%，70%，90%，99%的两两混合初始模板备用。检测时模板添加量为2μL。
2 检出限结果
向放置冻干球的8联排每个反应管中加入18μL去离子水至冻干球完全溶解（约30~60s），并分别加入上述制备的DNA模板2μL，按照实施例1中所述PCR反应条件上机检测。
绝对检出限结果如图5至图7所示，所有物种均能够在模板浓度为0.05ng/μL即DNA总量0.1ng时，有可以辨识的熔解曲线峰，证明本发明方法制备的冻干球在检测样品中目标物种时较为灵敏。
相对检出限结果如图8至图10所示，分别使用两种高值肉DNA（绵羊、牛）与三种低值肉DNA（狐、猪、鸭）按不同比例混合（1%，10%，30%，50%，70%，90%，99%）。含绵羊模板中，除绵羊-猪混合模板中绵羊比例在1%时无法清晰辨别，其余两种混合模板绵羊的相对检出含量均可低至1%，且作为掺假成分混合的狐、猪、鸭均可在含量为1%时辨别；含牛模板中，除牛-猪混合模板中牛比例在1%时无法清晰辨别，其余两种混合模板羊的相对检出含量可低至1%，且作为掺假成分混合的狐、猪、鸭中，猪、鸭可以在含量为1%时辨别，狐在10%时可以辨别。上述结果证明本发明制备的冻干球在检测混合样品时较为灵敏，可有效用于高值牛羊肉类的掺假检测。
对比例1
本对比例提供一种冻干球及其制备方法，其与实施例2基本相同，区别仅在于，在保护剂配方中，以蔗糖替代海藻糖。
将上述方法制备的冻干球常温真空保存1天，以实施例2记载的方法对其有效性进行验证，结果如图11中的（a）所示。对比实施例2的实验结果可发现，同样作为糖类常用冻干保护剂，海藻糖相较于蔗糖更能维持5重荧光PCR反应体系的稳定性、5种扩增产物的熔解曲线峰间相互比例更佳且拥有更好的辨识度。
对比例2
本对比例提供一种冻干球及其制备方法，其与实施例2基本相同，区别仅在于，在保护剂配方中，以甘油替代甘露醇。
将上述方法制备的冻干球常温真空保存1天，以实施例2记载的方法对其有效性进行验证，结果如图11中的（b）所示。对比实施例2的实验结果可发现，同样为多羟基化合物，保护剂组分中添加甘油的5重荧光PCR反应扩增产物无法保持其对应的熔解曲线峰型，基本缺失羊峰，且猪峰和鸡/鸭峰荧光信号过低不易辨识。
对比例3
本对比例提供一种冻干球及其制备方法，其与实施例2基本相同，区别仅在于，在冷冻干燥中，具体工艺顺序依次为：预冻-40℃，0.5h；主干燥-40℃，0.1mbar，0.5h；-35℃，0.1mbar，1.5h；-30℃，0.1mbar，6h；0℃，0.1mbar，2h；20℃，0.05mbar，2h；终末干燥30℃，0.01mbar，3h。
将上述方法制备的冻干球常温真空保存15天，以实施例2记载的方法对其有效性进行验证，结果如图12中的（c）所示。可见整体缩短主干燥过程时长至12h时，在常温真空保存15天测试时，羊峰、猪峰、鸡/鸭峰荧光信号值下降幅度较大，无法长期维持稳定的5物种熔解曲线峰型。
对比例4
本对比例提供一种冻干球及其制备方法，其与实施例2基本相同，区别仅在于，在冷冻干燥中，具体工艺顺序依次为预冻-40℃，0.5h；主干燥-40℃，0.1mbar，0.5h；-35℃，0.1mbar，2h；-10℃，0.1mbar，10h；0℃，0.1mbar，2h；20℃，0.05mbar，2h；终末干燥30℃，0.01mbar，3h。
将上述方法制备的冻干球常温真空保存15天，以实施例2记载的方法对其有效性进行验证，结果如图12中的（d）所示。可见在主干燥前期升温速率提升后，在常温真空保存15天测试时，羊峰、猪峰、鸡/鸭峰荧光信号值下降幅度较大，无法长期维持稳定的5物种熔解曲线峰型。
对比例5
本对比例提供一种冻干球及其制备方法，其与实施例2基本相同，区别仅在于，多重PCR反应体系组分及配比如表2所示。
表2 多重PCR反应体系组分及配比（总体积20 μL）
Figure 534634DEST_PATH_IMAGE002
本对比例中，先以实施例1的样品和方法对上述表2中的多重PCR反应体系的检测效果进行验证。检测时在上述表2的反应体系中加入10ng模板DNA后再以ddH2O补足至20 μL用于上机测试。获得的检测结果（冻干前）如图13中的（e）所示。
此外，本对比例还将上述方法制备的冻干球常温真空保存1天，以实施例2记载的方法对其有效性进行验证，获得的检测结果（冻干后）如图13中的（f）所示。对比冻干前后的实验结果可见，冻干后基本缺失狗/狐/貉峰，且鸡/鸭峰荧光信号大幅下降。说明该方案中多重PCR反应体系与保护剂和冻干条件的配合效果不如本发明方案。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国肉类食品综合研究中心
<120> 同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT-PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用
<130> KHP221110740.8YS
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacaaagcgc cttaaaccaa tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttttctag ggcaggtttt gt 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttcttcacg acacatacta cgtt 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaaatacag ctcctattga taaa 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagggaatga tgaaagacat 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagttgatcc ttttagattg tt 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacttctact atccctgcca gttc 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgataaagga tagggtctcc acca 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagaactacg agcacaaacg ctt 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccataggct ataccttgac ctgt 24

Claims (5)

1.一种制备多重RT-PCR预混试剂冻干球的方法，其特征在于，所述冻干球包括多重荧光PCR反应体系和保护剂，所述多重荧光PCR反应体系包含5对特异性引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-10所示；
所述保护剂由如下组分组成：20.1wt%聚乙二醇8000、1.8wt% Triton X-100、6.15wt%甘露醇、6.15wt%海藻糖，余量为水；
每20μL所述多重荧光PCR反应体系包含：SYBR Green Ⅰ Master预混液10μL，SEQ IDNO.1-2所示的引物各2.9pmol、SEQ ID NO.3-4所示的引物各4.35pmol、SEQ ID NO.5-6所示的引物各6.35pmol、SEQ ID NO.7-8所示的引物各2.4pmol、SEQ ID NO.9-10所示的引物各3.4pmol，其余体积用ddH2O补足；
所述方法包括将所述多重荧光PCR反应体系与所述保护剂混合后，先滴入液氮再进行冷冻干燥的步骤；所述冷冻干燥的工艺顺序依次为：预冻-40℃，0.5h；主干燥-40℃，0.1mbar，0.5h；-35℃，0.1mbar，2h；-30℃，0.1mbar，10h；0℃，0.1mbar，2h；20℃，0.05mbar，2h；终末干燥30℃，0.01mbar，3h；
所述多重荧光PCR反应体系与所述保护剂的体积比为1：0.2。
2.一种多重RT-PCR预混试剂冻干球，其特征在于，通过权利要求1所述的方法制备得到。
3.权利要求2所述的冻干球在同步鉴别肉或肉制品中多种动物源性成分中的应用，所述动物源性成分为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐和貉。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用时，以待测肉或肉制品的DNA和复溶后的所述冻干球的混合物为待测物，使用RT-PCR方法进行检测，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解曲线峰值图，根据熔解曲线峰值图中峰的个数和位置判定结果；
每一种特异性扩增产物峰代表一种特定的动物源性成分，其中，Tm值在71.1~73.7 ℃范围内出现的熔解曲线峰为绵羊或山羊源性成分检出；Tm值在74.0~75.4 ℃范围内出现的熔解曲线峰为牛源性成分检出；Tm值在76.2~78.1 ℃范围内出现的熔解曲线峰为狗或狐狸或貉源性成分检出；Tm值在80.3~81.2 ℃范围内出现的熔解曲线峰为猪源性成分检出；Tm值在84.7~87.5 ℃范围内出现的熔解曲线峰为鸡或鸭源性成分检出。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，RT-PCR反应条件为：（1）预变性：95℃，5min；（2）变性：95℃，15 s； 退火+延伸：57℃，45 s，30个循环；（3）熔解曲线：95℃，1min；70℃，1min；以0.02℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度；降温至40℃，1min。
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