RU2259401C1 - Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения пцр-анализа - Google Patents
Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения пцр-анализа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2259401C1 RU2259401C1 RU2004112594/13A RU2004112594A RU2259401C1 RU 2259401 C1 RU2259401 C1 RU 2259401C1 RU 2004112594/13 A RU2004112594/13 A RU 2004112594/13A RU 2004112594 A RU2004112594 A RU 2004112594A RU 2259401 C1 RU2259401 C1 RU 2259401C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mixture
- dna
- analysis
- pcr
- chain reaction
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 40
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 17
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 abstract description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 abstract 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 201000005019 Chlamydia pneumonia Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 3
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 208000030773 pneumonia caused by chlamydia Diseases 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 4-(bromomethyl)phenol Chemical compound OC1=CC=C(CBr)C=C1 MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 2
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 2
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010007570 Amelogenin Proteins 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000178937 Brassica oleracea var. capitata Species 0.000 description 1
- 241001249699 Capitata Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000011363 dried mixture Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000004090 human X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- -1 xylencyanol Chemical compound 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии, медицине и пищевой промышленности. Сухую смесь реагентов для полимеразной цепной реакции получают путем лиофильного высушивания водного раствора, содержащего ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, буферные компоненты, краситель для электрофореза, D-глюкозу, инулин и D-маннитол. Для проведения ПЦР-анализа указанную смесь растворяют в буферном растворе, содержащем ионы магния, добавляют в полученный раствор специфические праймеры и анализируемую ДНК и осуществляют амплификацию нуклеиновой кислоты в условиях полимеразной цепной реакции. Применение изобретения позволяет сохранить реакционную активность реагентов для полимеразной цепной реакции при длительном хранении и упрощает проведение ПЦР-анализа. 9 ил.
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии и касается сухой амплификационной смеси реагентов для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и способа проведения ПЦР-анализа и может быть использовано в ветеринарии, медицине, пищевой промышленности и других областях, связанных с исследованием ДНК.
ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся в условиях in vitro циклы синтеза определенной области ДНК (амплификацию), приводящие к экспоненциальному увеличению количества фрагмента ДНК, ограниченного двумя олигонуклеотидными праймерами. Для проведения ПЦР готовят амплификационную реакционную смесь, в которую добавляют анализируемую ДНК для ее амплификации, с последующей визуализацией амплифицированных нуклеотидных последовательностей.
Амплификационная смесь включает: ДНК-полимеразу, раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), праймеры и буферный раствор, содержащий Tris-HCl для поддержания рН среды (около 8,0), KCl и (NH4)2SO4 для стабилизации ДНК-полимеразы и dNTP, и MgCl2 для активирования ДНК-полимеразы.
Смесь готовят непосредственно перед проведением ПЦР путем смешивания компонентов, которые хранят в виде водных растворов при низкой температуре (-20°С). Длительное хранение, а также многократное замораживание и оттаивание часто приводят к потере активности реагентов, а при смешивании компонентов смеси появляется вероятность попадания экзогенной ДНК и, как следствие, ложноположительных результатов.
Для сохранения реакционной активности реагентов для ПЦР и увеличения срока хранения при температурах выше 0°С применяют лиофилизацию. Лиофильно высушивают либо отдельные реагенты, например dNTP (US 5763157, С 07 Н 021/00, 1995), либо смесь реагентов (US 6153412, С 12 Р 19/34, 2000), используя при этом специальные вещества - стабилизаторы. Так для стабилизации растворов ДНК-полимеразы и dNTP применяют желатин, бычий сывороточный альбумин (BSA), (NH4)2SO4, тезит, полиэтиленгликоль-8000 (PEG-8000), полиолы, а также неионные детергенты NP40, TritonX-100 и Tween20 (Science, 239:487-491, 1988). Для сохранения реакционной активности смеси в нее перед лиофилизацией добавляют глюцитол, глюкозу, фиколл, сахарозу (US 5861251, С 12 Р 19/34, 1999; US 6153412, С 12 Р 19/34, 2000).
При использовании трегалозы высушенная смесь для ПЦР сохраняет свойства до 1 года при температуре хранения +4°С и +20°С (J. Clin. Microbiol., 1998, V.36(6), p.1798-1800).
Высокая специфичность и чувствительность позволяют использовать ПЦР для анализа нуклеотидных последовательностей и секвенировании генов, для генотипирования и ДНК-маркирования, для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, для определения пола человека и идентификации личности, для обнаружения генетически модифицированных организмов и чужеродного генетического материала в продуктах питания.
Для каждого вида исследования используют специфичные олигонуклеотидные праймеры, которые ограничивают амплифицируемый участок ДНК. Как правило, готовые амплификационные смеси содержат специфичные праймеры, необходимые для каждого вида анализа (J. Clin. Microbiol., 1998, V.36(6), p.1798-1800). Так при тестировании организмов-возбудителей, относящихся к разным систематическим группам, необходимо иметь готовые ПЦР-смеси на каждый вид возбудителя, которые будут различаться только по входящим в них специфичным праймерам. Это повышает стоимость единичного анализа, затрудняет проведение серийных исследований и ограничивает использование готовых сухих ПЦР-смесей.
В качестве ближайшего аналога выбрана амплификационная смесь, описанная в патенте US 6153412, С 12 Р 19/34, 2000, представляющая собой лиофильно высушенную смесь водных растворов реагентов для ПЦР. В ее состав входят: 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 40 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP no 250 mM каждого), 0,01% водорастворимого красителя (выбранного из группы бромфеноловый синий; ксиленцианол; бромкрезол красный; крезол красный), 1 mM DTT, 50 mg/ml BSA, 100 mM фиколла или сахарозы в качестве стабилизирующих агентов и олигонуклеотидные праймеры (по 50 рМ Р1 5/-cgccacgacgatgaacagac-3/ и Р2 5/-ccacgggtaaagttgggc-3/). Смесь готовят путем смешивания водных растворов реагентов, дальнейшего быстрого замораживания при -70°С и высушивания при низкой температуре. Смесь сохраняет активность при +55°С в течение 136 и 115 часов. Для проведения ПЦР-анализа смесь растворяют деионизованной водой.
Сухие ПЦР-смеси, подобные описанной, обладают высокой гигроскопичностью и в результате поглощения влаги при длительном хранении при положительной температуре могут терять реакционную активность. Присутствующие в смеси ионы Mg2+ могут приводить к началу неспецифичной реакции. Наличие праймеров в готовых сухих ПЦР-смесях ограничивает использование таких смесей для широкого круга исследований.
Задачи изобретения - сухая амплификационная смесь реагентов для полимеразной цепной реакции, сохраняющая реакционную активность в течение длительного времени хранения при положительной температуре и позволяющая проводить специфичную ПЦР и имеющая многоцелевое назначение, а также способ проведения ПЦР-анализа.
Поставленные задачи решаются тем, что сухая амплификационная смесь реагентов для ПЦР содержит ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, буферные компоненты, водорастворимый краситель для электрофореза и композицию веществ-стабилизаторов (D-глюкозу, инулин и D-маннитол). Способ проведения ПЦР-анализа включает растворение сухой амплификационной смеси реагентов для полимеразной цепной реакции буферным раствором, содержащим ионы магния, с последующим добавлением специфичных праймеров и анализируемой ДНК.
Композиция D-глюкозы, инулина и D-маннитола в предлагаемой амплификационной смеси выполняет не только функцию стабилизаторов при лиофилизации, но и позволяет одновременно проводить лиофилизацию при более мягких условиях, что уменьшает гигроскопичность сухой ПЦР-смеси. Готовая смесь может храниться длительное время (от года и более) в широком диапазоне температур (от -20°С до +30°С), не теряя реакционной активности. Наличие ионов Mg2+ в буфере-растворителе, а не в составе самой смеси, позволяет контролировать начало реакции, избежать появления неспецифических продуктов и ложноположительных результатов при проведении ПЦР-анализа с использованием предлагаемой амплификационной смеси. Предлагаемая амплификационная смесь работает с любыми системами праймеров для геномной, плазмидной, митохондриальной, рекомбинантной (генетически модифицированной) ДНК и может быть использована для ПЦР-анализа ДНК любых многоклеточных и одноклеточных организмов, вирусов, продуктов питания или их компонентов, а также для количественного определения содержания ДНК в исследуемых образцах.
Предлагаемая смесь содержит ДНК-полимеразу (0,1 U/μ1), смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (по 500 mM каждого), 80 тМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 24 mM (NH4)2SO4, 0,5 mМ EDTA, D-глюкозу (0,16%), инулин (1,6%), D-маннитол (8%) и водорастворимый краситель для проведения электрофореза, например ксиленцианол (0,04%).
Предлагаемую ПЦР-смесь реагентов готовят путем смешивания водных растворов входящих компонентов, которую затем разливают по 10 мкл по пробиркам для амплификации и лиофильно высушивают при -20°С в течение 4-х часов. Лиофильно высушенную смесь используют для проведения ПЦР-анализа. Для этого смесь растворяют при помощи 10 мкл буферного раствора (буфера-растворителя), содержащего 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 5% глицерина, и добавляют олигонуклеотидные праймеры (5 мкл) и раствор анализируемой ДНК (5 мкл).
Для приготовления предлагаемой сухой ПЦР-смеси использовали следующие реагенты: в качестве ДНК-полимеразы - OligoTaq; Pfu; Vent - фирмы Promega, США; dNTP, Tris-HCl, Triton X-100, (NH4)2SO4 EDTA, D-глюкозу, инулин, D -маннитол, краситель для электрофореза - фирмы Sigma, США. В качестве красителя для электрофореза использовали водорастворимый краситель, который был выбран из группы бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромкрезол красный, крезол красный. Изобретение осуществимо и с другими препаратами используемых реагентов. В качестве олигонуклеотидных праймеров использовали готовые препараты или праймеры, синтезированные в зависимости от целей исследования. ДНК из исследуемых образцов выделяли общепринятыми методиками.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1. Приготовление сухой смеси реагентов для ПЦР.
Из стандартных водных растворов готовят амплификационную смесь следующего состава: 80 mM Tris-HCl (рН 8,0; 0,1% Triton X-100, 24 mM (NH4)2SO4, 0,5 mM EDTA, дезоксинуклеозидтрифосфаты dATP, dTTP, dGTP, dCTP по 500 mM каждого, OligoTaq ДНК-полимераза 0,1 U/μ1, 0,04% водорастворимого красителя для электрофореза ксиленцианола, 0,16% D-глюкозы, 1,6% инулина, 8% D-маннитола. Приготовленную жидкую смесь разливают по 10 мкл по пробиркам и лиофильно высушивают при температуре -20°С в течение 4-х часов. Хранят при +4°С в течение года и более.
Пример 2. ПЦР-анализ возбудителей инфекционных заболеваний.
Для анализа использовали биологический материал, инфицированный патогенной бактерией Chlamydia pneumonia, патогенным грибом Candida albicans, патогенным простейшим Toxoplasma gondii, ДНК-содержащим вирусом Bovine leukemia virus.
В пробирки с лиофильно высушенной амплификационной смесью по примеру 1 добавляют по 10 мкл буфера-растворителя, содержащего 5 mM MgCl2, 10 тМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,1% Triton X-100, 5% глицерина. Затем в каждую пробирку добавляют по 5 мкл смеси олигонуклеотидных праймеров по 10 рМ каждого (для определения ДНК Chlamydia pneumonia - (F) 5'-gtggagccttatgggaatgcggttgtg-3' и (R) 5'-tagctgttgctacgccagcgtctgttg-3', для определения ДНК Candida albicans - (F)5'-gcaatccccaagacaatcacctaat-3' и (R) 5'-gactggcatcatccgacaaataaga-3', для определения ДНК Toxoplasma gondii -(F) 5'-ctccacacttcattgtgtggagt-3' и (R) 5'-gatacaagaacacgaagttcctga-3', для определения ДНК Bovine leukemia virus - (F) 5'-ggaggtggaaagatgcgaactatt-3' и (R) 5'- gtccgctctactaaccctgaactt -3'). После перемешивания в пробирки с готовой к проведению ПЦР-смесью добавляют по 5 мкл пробы ДНК из исследуемых образцов. В качестве отрицательного контроля используют буфер ТЕ, положительного контроля - геномную ДНК соответствующего возбудителя. После повторного перемешивания пробирки помещают в амплификатор и осуществляют амплификацию в следующем режиме: 1. 94°С - 60 с, 62°С - 40 с, 72°С - 90 с (1 цикл), 2. 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 60 с (1 цикл), 3. 94°С - 20 с, 58°С - 20 с, 72°С - 40 с (43 цикла), 4. 72°С - 60 с. Продукты ПЦР анализируют при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием при напряжении 100 В.
На фиг.1 приведена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК бактериального возбудителя Chlamydia pneumonia, которая показывает наличие специфической зоны размером 183 н.п., которая соответствует ожидаемой в положительном контроле и исследуемых образцах, и отсутствие таковой в отрицательном контроле.
На фиг.2 приведена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК патогенного гриба Candida albicans, которая показывает наличие специфической зоны размером 490 н.п., которая соответствует ожидаемой в положительном контроле и исследуемых образцах, и отсутствие таковой в отрицательном контроле.
На фиг.3 приведена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК патогенного простейшего Toxoplasma gondii, которая показывает наличие специфической зоны размером 523 н.п., которая соответствует ожидаемой в положительном контроле и исследуемых образцах, и отсутствие таковой в отрицательном контроле.
На фиг.4 приведена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК вируса Bovine leukemia virus, которая показывает наличие специфической зоны размером 347 н.п., которая соответствует ожидаемой в положительном контроле и исследуемых образцах, и отсутствие таковой в отрицательном контроле.
Пример 3. ПЦР-анализ геномной ДНК растения (ДНК-маркирование)
Исследования проводили на различных сортах и гибридах капусты белокачанной Brassica oleracea L. var. capitata. Использовали амплификационную смесь по примеру 1, но содержащую в качестве ДНК-полимеразы Pfu.
Геномную ДНК выделяют из 14-дневных проростков по общепринятой методике. В пробирки с лиофильно высушенной амплификационной смесью по примеру 1 добавляют буфер-растворитель, как описано в примере 2. Затем добавляют 5 мкл (20 рМ) олигонуклеотидного праймера (например, PawS16, комплиментарного концевым повторам ретротранспозона семейства R173 - Ds-элемента R173 состава 5'-acctctgcgcttggaggc-3). Далее подготовку к амплификации проводят, как описано в примере 2. В качестве отрицательного контроля используют стерильную дистиллированную воду. Амплификацию осуществляют в следующем режиме: 1. 94°С - 3 мин, 2. 94°С - 45 с, 55°С - 45 с, 72°С - 100 с (35 циклов), 3. 72°С - 3 мин. Продукты ПЦР анализируют, как описано в примере 2.
На фиг.5 приведена электрофореграмма, показывающая наличие в каждом исследуемом образце спектров уникальных фрагментов размером от 100 до 700 н.п. и отсутствие таковых в отрицательном контроле, что свидетельствует об отличимости геномов различных сортов и гибридов капусты белокачанной.
Пример 4. ПЦР-анализ генетически модифицированной ДНК в продуктах питания и пищевом сырье.
ДНК для анализа выделяли из соевой муки и продуктов, содержащих сою.
В пробирки с лиофильно высушенной амплификационной смесью по примеру 1 добавляют буфер-растворитель, как описано в примере 2. Затем добавляют 5 мкл смеси олигонуклеотидных праймеров (например, комплиментарных нуклеотидной последовательности 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) следующего состава: (F) 5'-ggctatcgttcaagatgcctctgc-3', (R) 5'-ggattgtgcgtcatcccttacgtc-3' по 10 рМ каждого). Далее в готовую к амплификации смесь добавляют по 5 мкл выделенного образца ДНК. В качестве отрицательного контроля используют буфер ТЕ, а положительного контроля - ДНК трансгенной сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату (Монсанто, США). Амплификацию осуществляют в следующем режиме: 1. 94°С - 3 мин, 2. 94°С - 45 с, 72°С - 30 с, 72°С - 40 с (35 циклов), 3. 72°С - 4 мин. Продукты ПЦР анализируют по примеру 2.
На фиг.6 приведена электрофореграмма, которая показывает наличие специфической зоны размером 153 н.п. в положительном контроле и исследуемых образцах, что свидетельствует о наличии в исследуемых образцах генетически модифицированной ДНК.
Пример 5. Количественный ПЦР-анализ генетически модифицированной ДНК.
ПЦР-анализ для определения количества генетически модифицированной ДНК в соевой муке, содержащей сою генетически модифицированной линии 40-3-2 (Монсанто, США), проводили с использованием амплификационной смеси по примеру 1. Для количественного определения ДНК в анализируемой пробе использовали прибор для проведения ПЦР в реальном времени Smart CyclerII (Cefeid, США). Определение проводили с использованием технологии TaqMan (Heid C.A., Stevens J., Livak K.J. and Williams P.M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994, 1996).
В пробирки с лиофильно высушенной амплификационной смесью добавляют буфер-растворитель, как описано в примере 2. Затем в пробирки добавляют 5 мкл смеси олигонуклеотидных праймеров и зондов (олигонуклеотидов, меченных флуоресцентными агентами ROX и FAM). В качестве праймеров используют олигонуклеотиды комплиментарные нуклеотидной последовательности гена ср4 устойчивости к гербициду глифосат состава (F) 5'- gtggtcccaaagaacct-3', (R) 5'-cccttgagccatgaacc-3' и комплиментарные нуклеотидной последовательности гена лектина сои lec (F) 5'-accagcaaggcaatgaa-3', (R) 5'-cgagaaagaaggcatct-3' по 10 рМ каждого. В качестве зондов - флуоресцентно меченные олигонуклеотиды состава 5'-(FAM)agcacgtaagggatgacgca(BHQ1)-3' и 5'-(ROX)ttactggaacaagttcgtgc(BHQ2)-3', комплиментарные нуклеотидным последовательностям генов ср4 и lec соответственно по 6 рМ каждого. Далее в готовую к амплификации смесь добавляют 10 мкл выделенной ДНК (концентрация 10 нг/мкл). В качестве отрицательного контроля используют ДНК, выделенную из пшеничной муки. Для проведения амплификации и детекции результатов пробирки с готовой к реакции смесью и ДНК помещают в прибор для проведения ПЦР в режиме реального времени. 7
Амплификацию осуществляют в следующем режиме: 1. 94°С - 3 мин; 2. 94°С - 20 с, 57°С - 30 с, 72°С - 30 с (45 циклов).
На фиг.7 приведен график с кривыми флуоресценции, полученными в результате ПЦР в реальном времени. На нем указано время достижения определенного порогового значения флуоресценции, выраженное в количестве циклов амплификации. Значение 33,2 пропорционально суммарной концентрации ДНК сои (рекомбинантной и нативной) в исследуемом материале при амплификации фрагмента гена lee соевого лектина (детекция по ROX). Значение 36,8 - концентрации рекомбинантной ДНК при амплификации фрагмента гена ср4 устойчивости к гербициду глифосат (детекция по FAM). Исходя из отношения этих величин (33,2/36,8) по калибровочной кривой определяют долю рекомбинантной ДНК, которая в анализируемом образце соответствует 5%.
Пример 6. ПЦР-анализ геномной ДНК человека
Для анализа генома человека (например, с цепью определение пола плода) при помощи ПЦР использовали амплификационную смесь по примеру 1, но содержащую в качестве ДНК-полимеразы Vent.
Геномную ДНК выделяют из фетальных клеток плода, находящихся в крови матери. В пробирки с лиофильно высушенной амплификационной смесью добавляют буфер-растворитель, как описано в примере 2. Затем в каждую пробирку добавляют по 5 мкл смеси олигонуклеотидных праймеров (например, комплиментарных уникальным нуклеотидным последовательностям гена amelogenin в Х- и Y-хромосомах человека состава: 5'-gatggttggcctcaagcctgtg-3' и 5'- accttgctcatattatacttgaca-3'). Далее к готовой амплификационной смеси добавляют 5 мкл выделенной ДНК. В качестве отрицательного контроля используют буфер ТЕ, в качестве положительного - векторные конструкции, содержащие нуклеотидные последовательности, идентичные определяемым. Амплификацию осуществляют в следующем режиме: 1. 94°С - 60 с, 62°С - 40 с, 72°С - 90 с (1 цикл), 2. 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 60 с (1 цикл), 3. 94°С - 20 с, 58°С - 20 с, 72°С - 40 с (43 цикла), 4. 72°С - 60 с. Продукты ПЦР анализируют, как описано в примере 2.
На фиг.8 приведена электрофореграмма, которая показывает наличие зоны размером 533 н.п., характерной для Х-хромосомы в исследуемом образце, и отсутствие зоны размером 348 н.п., характерной для Y-хромосомы, а также отсутствие зон в отрицательном контроле, что позволяет определить пол плода как женский.
Пример 7. Влияние лиофилизации на стабильность реакционной активности смеси реагентов для ПЦР
Смесь (I) готовят, лиофильно высушивают и хранят, как описано в примере 1. Смесь (II) готовят из водных растворов входящих компонентов. Смесь содержит 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 24 mM (NH4)2SO4, 1,5 mM MgCl2, ДНК-полимеразу, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP no 250 mM каждого), 0,1% Triton X-100, 5% глицерина, 0,01% водорастворимого красителя для электрофореза (например, ксиленцианола), 0,16% D-глюкозы, 1,6% инулина, 8% D-маннитола в качестве стабилизирующих агентов. Смесь (II) хранят при -20°С. Смесь (I) и смесь (II) используют для ПЦР-анализа с целью обнаружения в исследуемых образцах генетически модифицированной ДНК из трансгенной сои линии 40-3-2 (Монсанто, США).
Выделение ДНК для ПЦР-анализа проводят по общепринятой методике.
Для проведения анализа смесь (I) растворяют буфером-растворителем, как описано в примере 2, и добавляют по 5 мкл олигонуклеотидных праймеров для определения 35S промотора ВМЦК по примеру 6. К смеси (II) добавляют по 5 мкл тех же олигонуклеотидных праймеров. Содержимое обеих пробирок перемешивают и в каждую добавляют по 5 мкл ДНК трансгенной сои линии 40-3-2. Амплификацию и детекцию осуществляют, как описано в примере 6. Анализ повторяют в течение 12 месяцев с регулярностью 1 раз в месяц.
На фиг.9 приведена электрофореграмма, которая показывает снижение реакционной активности смеси (II) на 5 месяце хранения при -20°С. Реакционная активность смеси (I) не изменяется в течение 12-ти месяцев хранения при +4°С.
Claims (2)
1. Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции, полученная путем лиофильного высушивания водного раствора, содержащего ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, буферные компоненты, водорастворимый краситель для электрофореза и стабилизатор, отличающаяся тем, что использован водный раствор, содержащий в качестве стабилизатора 0,16% D-глюкозы, 1,6% инулина, 8% D-маннитола.
2. Способ проведения ПНР-анализа, предусматривающий амплификацию анализируемой ДНК с помощью специфичных праймеров в условиях полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что растворение сухой смеси реагентов для полимеразной цепной реакции по п.1 производят при помощи буферного раствора, содержащего ионы магния, с последующим добавлением специфичных праймеров и анализируемой ДНК.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004112594/13A RU2259401C1 (ru) | 2004-04-27 | 2004-04-27 | Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения пцр-анализа |
| PCT/RU2005/000043 WO2005103277A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-02-08 | Dry amplification reagent mixture for polymerase chain reaction and the technique of pcr analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004112594/13A RU2259401C1 (ru) | 2004-04-27 | 2004-04-27 | Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения пцр-анализа |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2259401C1 true RU2259401C1 (ru) | 2005-08-27 |
Family
ID=35196989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004112594/13A RU2259401C1 (ru) | 2004-04-27 | 2004-04-27 | Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения пцр-анализа |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2259401C1 (ru) |
| WO (1) | WO2005103277A1 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010047619A1 (ru) | 2008-10-23 | 2010-04-29 | Stroganov Alexander Anatolevic | Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления |
| RU2535995C2 (ru) * | 2012-06-01 | 2014-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" | Сухая смесь для приготовления реакционной смеси для амплификации нуклеиновой кислоты и способ ее получения |
| RU171152U1 (ru) * | 2016-09-07 | 2017-05-22 | Мераб Георгиевич Чикобава | Дозированная форма для полимеразной цепной реакции |
| CN114231605A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-25 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种用于核酸扩增的冻干组合物 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0701253D0 (en) * | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| US20100184059A1 (en) * | 2007-06-16 | 2010-07-22 | Enigma Diagnostics Limited | Compositions |
| GB201008125D0 (en) * | 2010-05-14 | 2010-06-30 | Biofortuna Ltd | Tissue typing assays and kits |
| US9868944B2 (en) | 2014-12-19 | 2018-01-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reaction mixtures |
| CN106755414B (zh) * | 2016-12-23 | 2020-09-01 | 宁波海尔施基因科技有限公司 | 一种检测dna遗传标记的方法 |
| CN110452956B (zh) * | 2018-05-08 | 2023-11-03 | 北京中科生仪科技有限公司 | 一种pcr反应试剂的冻干微球及其制备方法 |
| CN112481253A (zh) * | 2019-09-12 | 2021-03-12 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于pcr预混液的冻干保护处方 |
| CN111826427B (zh) * | 2020-07-24 | 2023-09-26 | 珠海丽珠试剂股份有限公司 | Pcr扩增用试剂的冻干保护剂、制品及其制备方法与应用 |
| CN113106161B (zh) * | 2021-05-14 | 2023-03-17 | 公安部物证鉴定中心 | 一种用于全集成微流控芯片的str快速个体识别扩增试剂及其应用 |
| CN114214434B (zh) * | 2022-02-22 | 2022-07-01 | 中国肉类食品综合研究中心 | 同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重rt-pcr预混试剂冻干球及其制备方法与应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2158486A1 (en) * | 1994-09-15 | 1996-03-16 | John Wesley Backus | Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent, in reaction composition, test kit and test device useful therefor |
| CA2277198A1 (en) * | 1996-11-14 | 1998-05-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilized aqueous nucleoside triphosphate solution |
| US5861251A (en) * | 1996-10-15 | 1999-01-19 | Bioneer Corporation | Lyophilized reagent for polymerase chain reaction |
| US6153412A (en) * | 1998-12-07 | 2000-11-28 | Bioneer Corporation | Lyophilized reagent for polymerase chain reaction |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5413924A (en) * | 1992-02-13 | 1995-05-09 | Kosak; Kenneth M. | Preparation of wax beads containing a reagent for release by heating |
-
2004
- 2004-04-27 RU RU2004112594/13A patent/RU2259401C1/ru not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-02-08 WO PCT/RU2005/000043 patent/WO2005103277A1/en active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2158486A1 (en) * | 1994-09-15 | 1996-03-16 | John Wesley Backus | Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent, in reaction composition, test kit and test device useful therefor |
| US5861251A (en) * | 1996-10-15 | 1999-01-19 | Bioneer Corporation | Lyophilized reagent for polymerase chain reaction |
| CA2277198A1 (en) * | 1996-11-14 | 1998-05-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilized aqueous nucleoside triphosphate solution |
| US6153412A (en) * | 1998-12-07 | 2000-11-28 | Bioneer Corporation | Lyophilized reagent for polymerase chain reaction |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010047619A1 (ru) | 2008-10-23 | 2010-04-29 | Stroganov Alexander Anatolevic | Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления |
| US9631229B2 (en) | 2008-10-23 | 2017-04-25 | Lumex Instruments Limited | Method of nucleic acids analysis by real-time polymerase chain reaction and device for performing the same |
| RU2535995C2 (ru) * | 2012-06-01 | 2014-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" | Сухая смесь для приготовления реакционной смеси для амплификации нуклеиновой кислоты и способ ее получения |
| RU171152U1 (ru) * | 2016-09-07 | 2017-05-22 | Мераб Георгиевич Чикобава | Дозированная форма для полимеразной цепной реакции |
| CN114231605A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-25 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种用于核酸扩增的冻干组合物 |
| CN114231605B (zh) * | 2021-12-27 | 2022-08-26 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种用于核酸扩增的冻干组合物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005103277A1 (en) | 2005-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2259401C1 (ru) | Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения пцр-анализа | |
| JP4683922B2 (ja) | 遺伝子発現の定量方法 | |
| US6153412A (en) | Lyophilized reagent for polymerase chain reaction | |
| KR101378214B1 (ko) | 검체 해석 방법 및 그것에 사용하는 분석 키트 | |
| US20050208549A1 (en) | Testing endosymbiont cellular organelles and compounds identifiable therewith | |
| WO2004072230A2 (en) | Real-time polymerase chain reaction using large target amplicons | |
| US20100068716A1 (en) | Disposable articles for analysis and diagnostics for a laboratory | |
| US20130115601A1 (en) | Tissue typing assays and kits | |
| CN107988427A (zh) | 对虾肝胰腺细小病毒（hpv）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN107217100A (zh) | 基于dna酶嵌合引物的核酸筛查生物传感器 | |
| Liu et al. | Use of chicken microsatellite markers in turkey: a pessimistic view | |
| CN119506408A (zh) | 一种定量检测核酸样品的特异性探针、引物、试剂盒和方法 | |
| CN119433095A (zh) | 检测核酸样品的特异性探针、引物、试剂盒和方法 | |
| CN101871016B (zh) | 基于环介导等温扩增技术的鸭肠炎病毒检测试剂盒及方法 | |
| US20040053230A1 (en) | Real time quantitative pcr with intercalating dye for single and multiplex target dna | |
| JP3494509B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| CN114317835B (zh) | 一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重pcr检测引物组、试剂盒和检测方法 | |
| WO2014137093A1 (ko) | 교차오염 억제용 ｕｄｇ를 함유한 중합효소연쇄반응액의 동결건조물 | |
| KR0162270B1 (ko) | Dna 중합효소 반응혼합물의 제조방법 | |
| CN101871015B (zh) | 基于环介导等温扩增技术的鹅细小病毒检测试剂盒及方法 | |
| KR101334072B1 (ko) | 핵산 정량 방법 및 키트 | |
| KR20100042464A (ko) | 시료 중의 살모넬라 풀로룸 및 살모넬라 갈리나룸 중 하나 이상의 존재를 검출하는 방법 및 키트 | |
| CN112029892A (zh) | 一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆zh10-6转化体特异性的方法 | |
| JP6853523B2 (ja) | ヘリカーゼを用いたｐｃｒ | |
| CN112226521B (zh) | 鉴定牙周膜干细胞的试剂盒及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180428 |