WO2010047619A1 - Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления - Google Patents

Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления Download PDF

Info

Publication number
WO2010047619A1
WO2010047619A1 PCT/RU2009/000531 RU2009000531W WO2010047619A1 WO 2010047619 A1 WO2010047619 A1 WO 2010047619A1 RU 2009000531 W RU2009000531 W RU 2009000531W WO 2010047619 A1 WO2010047619 A1 WO 2010047619A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microchip
samples
layer
heat
reaction
Prior art date
Application number
PCT/RU2009/000531
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Анатольевич СТРОГАНОВ
Максим Николаевич СЛЯДНЕВ
Original Assignee
Stroganov Alexander Anatolevic
Slyadnev Maxim Nikolaevich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stroganov Alexander Anatolevic, Slyadnev Maxim Nikolaevich filed Critical Stroganov Alexander Anatolevic
Priority to UAA201104030A priority Critical patent/UA101848C2/ru
Priority to ES09822256.5T priority patent/ES2623605T3/es
Priority to EA201100576A priority patent/EA018889B1/ru
Priority to EP09822256.5A priority patent/EP2348123B1/en
Priority to US13/122,484 priority patent/US9631229B2/en
Priority to CA2739886A priority patent/CA2739886C/en
Priority to CN2009801418426A priority patent/CN102203272A/zh
Publication of WO2010047619A1 publication Critical patent/WO2010047619A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the invention relates to the field of molecular biology, medicine, biotechnology, and relates to a method for conducting polymerase chain reaction (PCR) and a device for its implementation with registration of the accumulation of reaction products in real time (real-time PCR, PB PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • PB PCR real-time PCR
  • PCR is a multiple cycle of synthesis of a specific DNA region (amplification), caused by a cyclic change in the temperature of the reaction mixture, and leading to an exponential increase in the number of DNA fragment, limited by two oligonucleotide primers.
  • a cyclic change in the temperature of the reaction mixture known to specialists in this field as thermal cycling, the following stages sequentially occur: denaturation of the double-stranded DNA molecule of the target (melting), attachment of oligonucleotide primers to complementary regions of the formed single-stranded DNA molecules of the target (annealing), and completion of the primers using thermostable polymerase to the formation of extended fragments of complementary DNA molecules (elongation).
  • the conditions under which these steps are carried out are well known to those skilled in the art.
  • PCR is used to amplify nucleic acids and allows to detect and identify the presence, as well as determine the amount of nucleic acid with the desired nucleotide sequence in a DNA or RNA sample.
  • the reaction mixture is prepared in a buffer solution, which usually contains thermostable polymerase, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), direct and reverse oligonucleotide primers, magnesium ions, to which the analyzed nucleic acid is added for its amplification, followed by registration of amplified nucleotides.
  • the reaction is carried out in a thermal cycler equipped with a fluorescent detector in the presence of either fluorescent intercalating dyes or fluorescently-labeled oligonucleotide primers or probes.
  • the thermal mass of the object (J / K), equal to the heat capacity of the material from which it is made, multiplied by its mass, characterizes the ability of the object in question to change its temperature when summing or removing heat energy.
  • the total thermal mass of a composite object containing several parts from various materials is equal to the sum of the thermal masses of all its parts.
  • the coefficient of thermal conductivity of the material (W / m * K) characterizes the ability of the material to conduct thermal energy.
  • the thermal conductivity of the object (W / K), equal to the product of the thermal conductivity coefficient of the material from which it is made, by the heat exchange surface area divided by the thickness of the material, characterizes the ability of the object to conduct thermal energy through the heat exchange surface.
  • the coefficient of thermal diffusion (m 2 / s), equal to the ratio of the thermal conductivity of the material to the product of its heat capacity by its density, characterizes the ability of the material to heat exchange with the environment with respect to the process of heat accumulation in the material itself.
  • the ratio of the thermal mass of the first object to the thermal conductivity of the second object characterizes the ability of the system to quickly bring to and remove heat from the first object through the second.
  • the recommended time to maintain the temperature in the thermal cycle is 2 or more minutes.
  • Australia et al., Eds. (1996) Surprot Rothosols ip Molecular Vioglu, Surprot Rothosols, Grepe Publishing Associates, Ips. Update Johp Wileu & Sops, IPs, recommend using 5 minutes per cycle, excluding the time spent on transitions between temperature levels.
  • a PCR process of 40 cycles using conventional equipment with a sample volume of 20-50 ⁇ l can take 3 or more hours.
  • a method and device are known [US patent application 20070196237 "Apparatus for regulating the process of biological analysis of the chemical process and the use of the same process"], which uses a microchip with a mixture of dropping water and applied onto a surface. the liquid in which the PCR mixture is placed.
  • the reaction mixture is separated from the heated surface of the substrate by a layer of a liquid immiscible with water, which usually has low thermal conductivity, which slows down the heating and cooling process.
  • reaction volumes can move uncontrollably, because the entire surface of the heat-conducting substrate is isotropic, which can potentially lead to a spatial mismatch between the heated zone and the heated sample during sample injection and thermal cycling, which will lead to unreliable results of PCR analysis.
  • Another drawback common to known microfluidic devices is the increased complexity of mixing samples with PCR components of the mixture before entering the microchip.
  • this procedure requires the cost of additional consumables (plastic tips, tubes) and is practically not feasible in conventional tubes with a volume of manipulated liquids of less than one ⁇ l due to the increased probability of evaporation of reagents and samples during mixing.
  • the closest analogue of the present invention can be the method and device described in the application for US invention 20070196237 "Apparatus for Regulatiphe Totregat of ⁇ f and Biological Apd / ⁇ r Chemisal Sampl Canal Apd Metod ⁇ f Usi ⁇ g the same.”
  • the application discloses a method for carrying out biochemical reactions, including PCR PB, comprising the steps of thermal cycling and detecting a fluorescent signal using a thermal control module consisting of a heater and a temperature sensor, a substrate of heat-conducting material is placed on the specified module, and a biological sample is applied to the specified substrate for example, a mixture containing all the components for conducting PCR PB, which is isolated from the atmosphere by introducing into the virtual reaction cell formed the water-immiscible liquid such as mineral oil.
  • the main disadvantages of the protopip are: low real rates of heating and cooling of the sample, the technical complexity of the temperature control module with integrated microheater and temperature sensor, which leads to a rise in price and reduces the commercial attractiveness of the device.
  • Another disadvantage of the analogue is an uncontrolled decrease in sensitivity during possible contact of the sample with the surface of the heat-conducting material.
  • the method and device disclosed in the description of the analogue requires preliminary preparation of solutions of PCR components, mixing the PCR components with the sample and introducing the resulting mixture into the reaction zones, which leads to additional labor costs, increases the risk of operator error, and leads to an increase in the cost of analysis due to increasing amount of consumables (test tubes, dispenser tips, reagents).
  • An object of the present invention is to provide a method and apparatus for its implementation, which would allow:
  • the problem is solved using the method described in the present invention for the determination of nucleic acids using the polymerase chain reaction in real time and a device for performing PCR PB analysis containing a microchip.
  • a method for determining nucleic acids using a real-time polymerase chain reaction which includes the following steps: introducing liquid samples containing nucleic acid into the reaction zones on the upper surface of the heat-conducting microchip substrate and isolating the introduced samples from the atmosphere; interaction of the nucleic acid of the sample with the components of the polymerase chain reaction during thermal cycling of the samples, with heat removal through the outer surface of the microchip; fluorescence determination of the change in the amount of polymerase chain reaction products during thermal cycling; determination of the amount of the original nucleic acid in the samples by the dynamics of the growth of the fluorescent signal.
  • the microchip is performed with a heat-conducting substrate of a heat-conducting material with a thermal conductivity of more than 1 W / cm-K and a thermal diffusion coefficient of more than 0.6 cm 2 / s; the reaction zones on the surface of the microchip are separated from the heat-conducting substrate by a layer of passivating material, which is covalently bonded to the surface of the heat-conducting material, and the introduced samples are isolated by separating them from the atmosphere with a layer of liquid immiscible with water, which is held on the upper surface of the heat-conducting substrate using a peripheral barrier, moreover, the ratio of the total thermal mass of the microchip with the introduced samples and a layer of a liquid immiscible with water to the thermal conductivity
  • the microchip's overlay does not exceed 0.04 seconds.
  • a device for implementing this method comprises a microchip with at least one reaction zone on its surface, which is mechanically connected to the holder of the microchip, thermally coupled to a thermal cycling unit, and optically coupled to a fluorescent detector radiation; the device also contains at least one radiation source optically coupled to the radiation filtering unit of the illumination channel and a microchip, said fluorescence radiation detector is optically coupled to the microchip through a radiation filtering unit of the recording channel, and said thermal cycling unit is capable of heating, cooling and maintaining the temperature of the microchip
  • the device comprises a control system electrically connected to the specified detector, the radiation source and the thermal cycling unit vania.
  • the specified microchip contains a heat-conducting substrate made of a material with a thermal conductivity of more than 1 W / cm-K and with a thermal diffusion coefficient of more than 0.6 cm 2 / s, each of the reaction zones on the surface of the specified microchip is separated from the heat-conducting substrate by a layer of passivating material, covalently bonded to a surface of a heat conducting substrate; a peripheral barrier is made on the upper surface of the specified microchip with the ability to hold a predetermined amount of liquid immiscible with water on the upper surface of the microchip, while the ratio of the total thermal mass of the microchip with the introduced samples and the layer of liquid immiscible with water to the thermal conductivity of the microchip substrate does not exceed 0.04 seconds.
  • a microchip is used, the substrate of which is made of materials with high thermal conductivity and thermal diffusion, while the surface
  • the reaction zones on the upper surface of the microchip are coated with a passivating layer, and the evaporation of the PCR mixture is prevented by using an insulating liquid layer, and the microchip may also contain one or more components of the PCR mixture in the reaction zones.
  • Various flow charts are possible for the method described in the present invention.
  • Methods for the interaction of a nucleic acid sample with PCR components can be performed in various ways.
  • a sample containing a nucleic acid is pre-mixed with one or more components of the PCR mixture before analysis. It is possible to mix the sample with a solution containing all the components necessary for PCR. It is also possible to mix the sample with a buffer solution containing one component, for example, Mg 2+ magnesium ions , or several components, for example, Mg 2+ magnesium ions and polymerase, or for example Mg 2+ magnesium ions , oligonucleotide primers and fluorescently-labeled probes.
  • the addition of the missing PCR components can be carried out by introducing into the reaction zones liquid solutions containing these components, before or after the introduction of samples by any of the known methods.
  • the missing PCR components are introduced into the reaction zones prior to sample entry.
  • the PCR components are introduced into the reaction zones in dried form prior to the introduction of the samples.
  • PCR components such as deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), direct and reverse oligonucleotide primers, and fluorescently-labeled probes can be introduced and dried into the reaction zones.
  • deoxynucleoside triphosphates dNTPs
  • direct and reverse oligonucleotide primers fluorescently-labeled probes
  • thermostable polymerase and stabilizers are introduced into the reaction zones and dried.
  • Stabilizers can be selected from a number of substances, such as polysaccharides (mannitol, glucose, sucrose). The method assumes that the fluorescence determination of the change in the amount of polymerase chain reaction products in the samples during thermal cycling can be performed by irradiating the samples with a selected wavelength range and recording a fluorescence signal in a selected wavelength range. Usually, irradiation of the samples should be in the range of 350-700 nm, and fluorescence should be recorded in the range of 450 - 1000 nm.
  • the microchip can be made of various materials, preferably with high coefficients of thermal conductivity (more than 1 W / cm K) and thermal diffusion (more than 0.6 cm 2 / s).
  • Such materials may include metals, for example aluminum, copper, or dielectrics, such as silicon or ceramic.
  • the most preferred materials are silicon and aluminum.
  • the geometric dimensions of the microchip and its mass must be small so that its thermal mass is small.
  • the thickness of the substrate is less than 1 mm in order to ensure its high thermal conductivity.
  • the layer of passivating material is made of substances that prevent the irreversible sorption of PCR components and inhibition of the reaction.
  • the layer should be deposited by covalently bonding the passivating agent to the material of the heat-conducting substrate of the microchip in order to increase the resistance of the passivating layer to long-term storage and thermal cycling during the reaction.
  • Such substances can be selected from the series: alumina, silica, organic molecules forming monolayers or polymer coatings.
  • Organic molecules can be selected from the range: polydimethylsiloxane, polymethylmethoxysiloxane, 3-glycidoxyxypropyltrimethoxysilane, ethylene glycol diglycidyl ether.
  • the layer of passivating material in the reaction zones has hydrophilic properties in order to ensure good spreadability of the solution when the PCR mixture is introduced into the reaction zone. Moreover, it is preferable that the layer of passivating material outside the region of the reaction zones possess hydrophobic properties to prevent the spreading of the aqueous solution beyond the boundaries of the reaction zone. Most preferably, the passivating material in the reaction zones is formed by the reaction of the 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane layer with ethylene glycol diglycyl ether.
  • the passivating material outside the reaction zone is formed from a polymer layer of polymethylmethoxysiloxane.
  • Isolation of samples introduced into the reaction zones from the atmosphere can be accomplished by applying a layer of insulating liquid to the reaction zones.
  • insulating liquid it is preferable to use water-immiscible liquids having a lower density than water, and preferably having a boiling point above 100 ° C at atmospheric pressure.
  • Insulating fluids can be selected from the range: mineral oil, silicone fluids of various viscosities, and mixtures thereof.
  • the method assumes that the insulating liquid is optically transparent in the wavelength range in which excitation and registration of the luminescence of fluorescent dyes used to detect the products of PCR PB.
  • the optical transmission of the insulating liquid layer in the specified wavelength range should be at least 10%. Even more preferably, in the detection range of the dye luminescence, the layer of insulating liquid produces a fluorescence signal of not more than 10% of the signal generated by samples placed in the reaction zones.
  • the method assumes that it is possible to apply a layer of insulating liquid both once (before or after injection of samples), and in two stages: first, apply a layer of insulating liquid to unfilled reaction zones, then inject liquid samples through the specified layer of insulating liquid, and then add insulating fluid.
  • a silicon microchip with at least one reaction zone on its surface can be made by photolithography followed by liquid anisotropic or isotropic etching, well known to specialists in the field of microelectromechanical systems.
  • a microchip of metal, ceramic or plastic can be made by precise stamping, hot casting, laser ablation, liquid isotropic etching, plasma etching, well known to specialists in this field.
  • the linear dimensions of the reaction zone are selected from the range of 10 1 - 10 4 ⁇ m in length and width, and 10 1 -10 3 ⁇ m in depth.
  • the linear dimensions of the reaction zone are selected from a range of 5x10 2 - 5x10 3 ⁇ m in length and width, and 2x10 2 - 5x10 2 ⁇ m in depth.
  • the overall dimensions of the microchip should be chosen so that the thermal mass of the microchip is small, and the thickness of the heat-conducting substrate should be minimal while maintaining sufficient structural strength.
  • the ratio of the thermal mass of the microchip with the introduced samples and a layer of water-immiscible liquid to the thermal conductivity of the microchip substrate does not exceed 0.04 seconds.
  • the peripheral barrier can be performed using a structural element that rises above the upper surface of the microchip and forms a closed loop so that the insulating liquid is contained in this loop during PCR. It is possible that the peripheral barrier was made of the material of the heat-conducting substrate of the microchip. Preferably, the material for the manufacture of the peripheral barrier should be with a low coefficient of thermal conductivity and low heat capacity.
  • a peripheral barrier can be a layer of material with oleophobic properties deposited on the surface of the microchip around the reaction zones. Usually the material with oleophobic properties are alkylsilanes with saturated fluorocarbon chains. It is possible that the peripheral barrier is in the form of a combination of a structural element and a layer of oleophobic material.
  • the peripheral barrier is made with the possibility of isolating the reaction zones from the atmosphere by applying an adhesive film to it.
  • a layer of passivating material covalently bonded to the surface of the microchip can be made by conducting chemical reactions on the surface of the microchip. It is possible to carry out these reactions by reacting components from the gas phase with the surface of the microchip, for example, thermochemical oxidation of silicon to form a layer of silicon oxide. Preferably, these reactions are carried out during the interaction of components from the liquid phase with the surface of the microchip. It is preferable to separately apply a layer of passivating material on the surface of the microchip in areas outside the reaction zones and a layer of passivating material in the region of the reaction zones.
  • a layer of polymethylmethoxysilane having hydrophobic properties is applied to the surface of the microchip by contact wetting of these areas with a solution of unpolymerized polymethylmethoxysilane and subsequent thermal polymerization.
  • a layer of passivating material in the region of the reaction zones is applied by carrying out successive chemical reactions in the reaction zones, for example, by successive incubation in the reaction zones of liquid 3-glycidoxyxypropylmethoxysilane, and then liquid ethylene glycol diglycyl ether.
  • the application of one or more components of the polymerase chain reaction to the reaction zones on the surface of the microchip is preferably carried out by drying an aqueous solution of these components of the PCR mixture.
  • solutions containing the necessary components should be introduced into the reaction zones and dried in a laminar cabinet at room temperature.
  • the indicated solutions are dried in the lyophilization mode at low temperatures and pressures, for example, at a temperature in the range from minus 20 ° C to minus 50 0 C and a pressure in the range from 0.01 to 10 mm Hg.
  • the fluorescent radiation detector may include a radiation filtering unit made using absorption and interference filters, as well as dichroic mirrors.
  • a radiation source can be an LED that is optically coupled to a radiation filtering unit and a microchip by means of optical elements, for example, lenses and mirrors.
  • a detector for for detecting several PCR products in one microreactor it is possible to make a detector containing several radiation sources and several radiation filtering units configured to switch between one and the other source and the radiation filtering unit.
  • Such a multi-channel detector can be built using several LEDs, light filters and dichroic mirrors that differ in their spectral characteristics.
  • the radiation sources and radiation filtering units create a luminous flux in a selected range of wavelengths of excitation of fluorescence from the interval 350-700 nm and allowed to register a fluorescence signal in the selected range of wavelengths from the interval of 450 - 1000 nm.
  • the wavelength ranges of excitation and registration of fluorescence are selected so as to detect fluorescent dyes used in the practice of PCR PB, which are well known to specialists in this field.
  • dyes are carboxyfluorescein (FAM), b-carboxy-2 ', 4.4', 5 ', 7.7 1 -hexachlorofluorescein (HEX), 6-carboxyxodamine (R6G), carboxy-X-rhodamine (ROX), tetramethylcarboxyrodamine (TAMRA), b-carboxy ⁇ '. ⁇ '-dichloro-g'J 1 - dimethoxyfluorescein (6-JOE), carboxyrodamine (R110).
  • FAM carboxyfluorescein
  • HEX hexachlorofluorescein
  • R6G 6-carboxyxodamine
  • ROX carboxy-X-rhodamine
  • TAMRA tetramethylcarboxyrodamine
  • R110 carboxyrodamine
  • a fluorescent radiation detector may be a matrix detector, a photoelectron multiplier, or a photodiode.
  • a matrix detector is used as the radiation detector, for example, a CCD matrix (CCD - charge-coupled device) or CMOS matrix (CMOS - complementary metal - oxide - semiconductor).
  • the image of the microchip is formed on the matrix detector using optical elements, for example, using a lens, mirror-lens or mirror lens.
  • the matrix detector allows you to record the fluorescence signal in the entire wavelength range from 450 to 1000 nm.
  • the thermal cycling unit which is thermally connected with the microchip, can be made with the possibility of heating, cooling and maintaining the temperature of the microchip using resistive heaters, semiconductor thermoelectric modules (Peltier elements), induction heaters, heaters using energy transfer in in the form of radiation, heaters using the transfer of thermal energy using a stream of liquid or gas, including using condensation and evaporation.
  • resistive heaters semiconductor thermoelectric modules (Peltier elements), induction heaters, heaters using energy transfer in in the form of radiation, heaters using the transfer of thermal energy using a stream of liquid or gas, including using condensation and evaporation.
  • Peltier elements semiconductor thermoelectric modules
  • induction heaters heaters using energy transfer in in the form of radiation
  • heaters using the transfer of thermal energy using a stream of liquid or gas including using condensation and evaporation.
  • FIG. 1 is a microchip diagram for implementing a method for analyzing nucleic acids by PCR PB; figure 2 - variant of the microchip for implementing the method of analysis of nucleic acids by PCR method PB with components of the polymerase chain reaction in dried form;
  • Fig. 3 is an example of a design structure of a microchip PCR analyzer device; figure 4 - the result of DNA determination by PCR method PB using the device according to the invention when using the temperature regime recommended by the manufacturer of the reagents; figure 5 - the result of the determination of DNA by PCR method PB using the device according to the invention when using temperature conditions with reduced duration of the PCR stages.
  • FIG. 1 An example of performing a microchip for implementing a method for analyzing nucleic acids by PCR method PB in accordance with the present invention is depicted in figure 1 and figure 2.
  • reaction zone 1 located on the upper surface of the microchip, is sample 2.
  • the microchip contains a heat-conducting substrate 3 made of a heat-conducting material, the thermal conductivity of which is more than 1 W / cm-K, and the thermal diffusion coefficient is more than 0.6 cm 2 / s.
  • the reaction zone 1 is separated from the heat-conducting substrate 3 by a layer of passivating material 4, which is covalently bonded to the surface of the heat-conducting material.
  • the reaction zone 1 on the surface of the microchip is separated from the heat-conducting substrate 3 by a layer of passivating material 7, which has hydrophilic properties and is covalently bonded to the surface of the heat-conducting material.
  • the surface of the heat-conducting substrate 3 is coated with a layer of passivating material 8, which has hydrophobic properties and is covalently bonded to the surface of the heat-conducting material.
  • a layer 9 containing one or more components of the polymerase chain reaction in dried form.
  • an insulating liquid layer 5 separates the injected sample 2 from the atmosphere.
  • the peripheral barrier 6 holds the layer of insulating liquid 5 on the upper surface of the heat-conducting substrate 3.
  • the introduction of a sample 2 containing nucleic acid into the reaction zone 1 is carried out through a layer of insulating liquid 5.
  • Heating and cooling of the sample 2, placed in the reaction zone 1 is carried out from the side of the lower surface of the heat-conducting substrate 3.
  • Fluorescence determination of the amount of polymerase chain reaction products in a sample 2, placed in the reaction zone 1, in the process otsiklirovaniya operate with the upper surface side heat-conducting substrate 3 through the layer of the insulating liquid 5.
  • the device contains at least one reaction zone on the surface of the microchip 10, which is mechanically connected with the holder of the microchip 11, is thermally coupled to the thermal cycling unit 12, and is optically coupled to the fluorescence radiation detector 13.
  • the device contains at least one radiation source 14, which is optically coupled to the block filtering the radiation of the illumination channel 15, a dichroic mirror 16, a lens 17 and a microchip 10.
  • a fluorescence detector 13 is optically coupled to the microchip 10 through a lens 17, a dichroic mirror 16 a channel register 18.
  • the radiation filter 12 thermocycling unit configured to heating, cooling and maintaining the microchip temperature 10.
  • the device also contains a control system 19, electrically connected with the radiation detector 13, at least one radiation source 14 and a thermal cycling unit 12.
  • the control system 19 is configured to switch radiation sources 14 between one radiation source and another radiation source (if there are more than one source ), as well as with the possibility of changing the spectral range of the block (or blocks) filtering radiation.
  • the device operates as follows.
  • the microchip 10 is inserted into the microchip holder 11.
  • a layer of insulating liquid 5 is deposited on the upper surface of the microchip 10 and sample 2 is introduced into the reaction zone 1.
  • the microchip holder 11 with the equipped microchip 10 is then installed in the thermal cycling unit 12.
  • the radiation from the radiation source 14 is directed into the radiation filtering unit of the illumination channel 15, then it is reflected from the dichroic mirror 16, enters the lens 17 and enters the sample 2 located in the reaction zone of the microchip 1 through a layer of insulating liquid and 5.
  • the fluorescence radiation from the sample through the layer of insulating liquid 5 is collected by the lens 17 and sent through the dichroic mirror 16 and the radiation filtering unit of the recording channel 18 to the fluorescence radiation detector 13.
  • the thermal cycling unit 12 which is thermally connected to the microchip 10, supplies and removes heat for heating, cooling and maintaining the temperature of the microchip 10.
  • High heating and cooling rates are achieved due to the small total thermal mass of the microchip with the introduced samples and a layer of water-immiscible liquid (in the range from 0.5 to 4 J / K) made using a heat-conducting substrate with high thermal conductivity (in the range from 100 to 500 W / K), resulting in a small ratio of the total thermal mass microchip to the thermal conductivity of the microchip substrate (in the range from 0.001 to 0.04 s).
  • the temperature control of the thermal cycling unit 12, the selection and inclusion of the radiation source 14, as well as the collection and processing of the signals of the fluorescent detector 13 during thermal cycling of the sample, are carried out by the control system 19, which is electrically connected to the blocks 12, 13 and 14. Information confirming the possibility of carrying out the invention.
  • the microchip containing 16 reaction zones on its surface was made of polished crystalline silicon wafers with a thickness of 0.6 mm by photolithography followed by anisotropic liquid chemical etching.
  • the size of the heat-conducting substrate was 25 x 28 x 0.6 mm.
  • the reaction zones were located on the surface of the microchip in the form of a 4 x 4 matrix, each reaction zone was a truncated pyramid with the dimensions of the upper base 2 x 2 mm, the lower base 1, 7 x 1, 7 mm and a depth of 0.4 mm.
  • a silicon oxide SiO 2 layer was deposited on a silicon substrate over the entire surface by thermochemical oxidation.
  • the silicon substrate coated with a layer of SiO 2 was purified in a mixture of concentrated sulfuric acid and hydrogen peroxide (3: 1) for 20 minutes. After thorough washing with distilled and deionized water and drying, the surface of the silicon substrate in the area outside the reaction zones was treated with Penta-111 polymethylmethoxysiloxane (Penta-North, Russia). After polymerization by heat treatment, the surface of the reaction zones was first treated with 3-glycidoxyxypropyl-trimethoxysilane (Sigma, USA) for 60 minutes, and then ethylene glycol-diglycyl ether (Sigma, USA) for 60 minutes. Then, the substrate prepared in this way was attached with glue to a peripheral barrier made of 3 mm thick polyacrylamide.
  • the total thermal mass of the microchip with samples introduced into the reaction zones and an insulating liquid was 3.35 J / K.
  • the thermal conductivity of the silicon substrate was 175 W / K.
  • the ratio of the total thermal mass of the microchip to the thermal conductivity of the substrate of the microchip does not exceed 0.02 seconds.
  • the fabricated microchip was treated with UV radiation for 5 min, and then it was deposited on the upper surface of the peripheral barrier protective polymer film to prevent contamination of the surface of the reaction zones during storage and handling of the microchip.
  • the microchip could be stored at room temperature for several months.
  • XL9030 LEDs (Cree, USA) were used as radiation sources
  • a MultiiVlue CCD camera (Reckip-Elmer Orthoelcopics, USA) was used as a detector
  • a set of interference filters XF-52 was used in the radiation filtering unit ( Omega Ortisal, USA).
  • the Peltier element 40 W, Cryotherm, Russia
  • a personal computer with installed software was used as the control system.
  • sample K + a sample solution containing 10 4 DNA copies of Escherichia coli in 1 ⁇ l, strain C600, in sterile deionized water
  • sample K- sterile deionized water
  • the solution easily spread over the reaction zones and, at the same time, remained in them, not spreading over the surface of the substrate and thus prevent mutual contamination.
  • Thermocycling was carried out according to the temperature regime recommended by the manufacturer of the reagents, namely: activation of polymerase 94 0 C for 180 s (1 cycle), denaturation of DNA 94 0 C for 20 s, annealing of primers 58 0 C for 40 s, elongation of amplicons and reading of a fluorescence signal of 72 0 C for 20 s (45 cycles).
  • PCR PB curves are characterized by the fact that in the initial cycles, the fluorescence intensity is low and practically does not change. This level of fluorescence is called basic.
  • An indicator of the accumulation of the reaction product is the so-called “threshold cycle” (Ct, threshold), i.e. a cycle in which the fluorescence intensity begins to exceed the base threshold. From figure 4 it is seen that in samples containing the desired DNA, an increase in the fluorescence signal is observed, and in samples not containing DNA, the fluorescence signal remains at a basic level.
  • the maximum heating and cooling rates for the device according to the invention were 16.5 and 14.3 ° C / s, respectively, which is 4 and 8 times higher than the same parameters for conventional laboratory equipment, as well as 2 and 5 times higher than the fastest samples of commercially available equipment.
  • Thermocycling was carried out according to the temperature regime, in which the durations of the stages of denaturation, annealing of primers and elongation were reduced, namely: activation of polymerase 94 0 C for 120 s (1 cycle), denaturation of DNA 94 0 C for 3 s, annealing of primers 58 0 C for 3 s, elongation of amplicons and reading of the fluorescence signal 72 0 C for 8 s (45 cycles).
  • PCR PB The result of PCR PB is shown in Fig.5.
  • the figure shows that in samples containing the desired DNA, an increase in the fluorescence signal is observed, and in samples not containing DNA, an increase in the fluorescence signal does not occur.
  • sample solution containing: 10 4 DNA copies in 1 ⁇ l of Escherichia coli strain C600 in sterile deionized water (sample K +) or sterile deionized water (sample K-) dissolved in a solution containing 5 mM MgCI 2 , 10 mM Tgis-HCl (pH 8.0), 0.1% Tritop X-100, 5% glycerol (Sigma, USA) and sterile deionized water.
  • sample K + sterile deionized water
  • sample K- sterile deionized water
  • a solution containing 5 mM MgCI 2 , 10 mM Tgis-HCl (pH 8.0), 0.1% Tritop X-100, 5% glycerol (Sigma, USA) and sterile deionized water.
  • the mixture was dried in a laminar cabinet at room temperature for 2 to 3 hours until a dense layer was firmly held in the reaction zones.
  • a protective film with an adhesive layer was applied to the upper surface of the peripheral barrier, isolating the reaction zones from the atmosphere to prevent contamination of the surface of the reaction zones during storage and when handling the microchip.
  • the microchip could be stored at room temperature for several weeks.
  • the injection of the sample solution according to claim 2 of this example was carried out in the reaction zones of the microchip as in example 1.
  • Thermocycling was carried out according to the temperature regime recommended by the manufacturer of the reagents, namely: activation of polymerase 94 0 C for 180 s (1 cycle), denaturation of DNA 94 0 C for 20 s, annealing of primers 58 0 C for 40 s, elongation of amplicons and reading of a fluorescence signal of 72 0 C for 20 s (45 cycles).

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицины, биотехнологии и касается способа проведения полимеразной цепной реакции и устройства для его осуществления с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме реального времени. Задача изобретения решается в результате использования способа и устройства для его осуществления для определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, включающего введение жидких проб, содержащих нуклеиновую кислоту, в реакционные зоны на верхней поверхности теплопроводящей подложки микрочипа; изолирование вводимых проб от атмосферы; взаимодействие нуклеиновой кислоты пробы с компонентами полимеразно-цепной реакции при термоциклировании проб с отводом тепла через внешнюю поверхность микрочипа; флуоресцентное определение изменения количества продуктов полимеразно-цепной реакции в процессе термоциклирования; определение количества исходной нуклеиновой кислоты в пробах по динамике роста флуоресцентного сигнала, который отличается тем, что используют микрочип с теплопроводящей подложкой из теплопроводящего материала с коэффициентом теплопроводности больше 1 Вт/см К и с коэффициентом тепловой диффузии больше 0.6 cм2/c, при этом реакционные зоны на поверхности микрочипа отделяют от теплопроводящей подложки слоем пассивирующего материала, который ковалентно связан с поверхностью теплопроводящего материала, а изолирование вводимых проб выполняют путем отделения их от атмосферы слоем жидкости, несмешивающейся с водой, которую удерживают на верхней поверхности теплопроводящей подложки с помощью периферийного барьера, причем отношение суммарной термической массы микрочипа с введенными пробами и слоем несмешивающейся с водой жидкости к тепловой проводимости подложки микрочипа не превышает 0.04 секунды. Технический результат - сокращение времени анализа, повышение надежности, достоверности, производительности и экономичности анализа.

Description

Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицины, биотехнологии и касается способа проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и устройства для его осуществления с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме реального времени (ПЦР в реальном времени, ПЦР PB). Предложенный способ и устройство могут быть использованы в медицине, ветеринарии, пищевой промышленности, при исследовании окружающей среды и в других областях, связанных с выявлением, идентификацией и количественной оценкой нуклеиновых кислот в исследуемых образцах.
ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза определенной области ДНК (амплификацию), вызванные циклической сменой температуры реакционной смеси, и приводящие к экспоненциальному увеличению количества фрагмента ДНК, ограниченного двумя олигонуклеотидными праймерами. При циклическом изменении температуры реакционной смеси, известном специалистам в данной области как термоциклирование, последовательно происходят следующие стадии: денатурация двухцепочечной молекулы ДНК мишени (плавление), присоединение олигонуклеотидных праймеров к комплементарным участкам образовавшихся одноцепочечных молекул ДНК мишени (отжиг), и достройка праймеров с помощью термостабильной полимеразы до образования протяженных фрагментов комплементарных ДНК молекул (элонгация). Условия, при которых выполняются указанные стадии, хорошо известны специалистам в данной области.
ПЦР применяется для амплификации нуклеиновых кислот и позволяет выявить и идентифицировать присутствие, а также определить количество нуклеиновой кислоты с искомой последовательностью нуклеотидов в ДНК- или РНК-образце. Для проведения ПЦР готовят реакционную смесь в буферном растворе, содержащую как правило, термостабильную полимеразу, дезоксинуклеозид- трифосфаты (дНТФ), прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры, ионы магния, в которую добавляют анализируемую нуклеиновую кислоту для ее амплификации, с последующей регистрацией амплифицированных нуклеотидных последовательностей.
Для регистрации результатов реакции в режиме реального времени реакцию проводят в термоциклере, снабженном флуоресцентным детектором в присутствии либо флуоресцентных интеркалирующих красителей, либо флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных праймеров или зондов.
Термины и определения:
Термическая масса объекта (Дж/К), равная теплоемкости материала, из которого он изготовлен, умноженной на его массу, характеризует способность рассматриваемого объекта изменять свою температуру при подведении или отведении тепловой энергии. Полная термическая масса составного объекта, содержащего несколько частей из различных материалов, равна сумме термических масс всех его частей.
Коэффициент теплопроводности материала (Bт/м*K) характеризует способность материала проводить тепловую энергию.
Тепловая проводимость объекта (Вт/К), равная произведению коэффициента теплопроводности материала, из которого он сделан, на площадь поверхности теплообмена, деленному на толщину материала, характеризует способность объекта проводить тепловую энергию через поверхность теплообмена.
Коэффициент тепловой диффузии (м2/c), равный отношению теплопроводности материала к произведению его теплоемкости на его плотность, характеризует способность материала к тепловому обмену с окружающей средой по отношению к процессу накопления тепла в самом материале.
Для системы, содержащей два объекта: первый, нагреваемый или охлаждаемый, и второй, через который происходит теплообмен, справедлива следующая характеристика. Отношение термической массы первого объекта к тепловой проводимости второго объекта, выражаемое в секундах, характеризует способность системы быстро подводить к и отводить тепло от первого объекта через второй.
Уровень техники. Существующие методы проведения ПЦР с использованием коммерчески доступного оборудования, как правило, основаны на применении полимерных пробирок, которые устанавливаются в металлические нагревательные блоки. Высокая термическая масса стандартных нагревательных блоков с установленными в них пробирками и образцами, невысокая теплопроводность материала стенок пробирок ограничивает скорость нагрева и охлаждения образца, а также может приводить к высокой неоднородности температурного поля в образце, находящемся в пробирке.
При использовании обычных лабораторных приборов, предназначенных для выполнения ПЦР в полимерных пробирках или планшетах, рекомендуемое время поддержания температуры в термоцикле, составляет 2 или более минут. Например, Аusubеl еt аl., еds. (1996) Сurrепt Рrоtосоls iп Моlесulаr Вiоlоgу, Сurrепt Рrоtосоls, Grеепе Рublishiпg Аssосiаtеs, Iпс. апd Jоhп Wilеу & Sопs, Iпс, рекомендуют использовать 5 минут на цикл, без учета времени, которое тратится на переходы между температурными уровнями. В результате, ПЦР процесс из 40 циклов с использованием обычного оборудования при объеме пробы 20-50 мкл может занять 3 или более часов.
В последние годы для сокращения времени, затрачиваемого на один цикл, было предложено много методов проведения ПЦР в миниатюрных реакционных контейнерах. Для ускорения времени, требуемого на переход между температурными уровнями, в подобных устройствах существенно уменьшена масса нагревательного элемента, масса контейнеров и объем образцов, что позволило сократить термическую массу, применяются материалы с высокими коэффициентами теплопроводности и повышается соотношение площади поверхности образца к его объему, а также для нагревания используются способы бесконтактного подвода тепла к образцам. Например, прибор RарidСусlеr, (Idаhо Тесhпоlоgiеs, Iпс, США) позволяет относительно быстро изменять температуру ПЦР смеси при переходе между температурными уровнями и обеспечивает относительно эффективный перенос тепла от нагревателя к образцам. В этом устройстве 30 циклов ПЦР PB могут быть завершены за 10 минут.
Известны также методы, реализованные в микрофлюидных устройствах, позволяющие сократить время, требуемое на один цикл. Например, Корр еt аl. (1998) Sсiепсе, 280:1046. описывает устройство в котором ПЦР смесь последовательно протекает по микроканалу в виде меандра, выполненному в микрофлюидном чипе, через три температурные зоны, что приводит к циклической смене температуры ПЦР смеси в течение 20 термоциклов. Так как поперечное сечение микроканала относительно мало, то температура раствора внутри микроканала устанавливается достаточно быстро. Время, в течение которого смесь находится при определенной температуре, в этом случае регулируется при помощи скорости потока. Авторами показана возможность выполнения ПЦР в описанном устройстве при времени цикла равном 6,6 секунд. Таким образом, применение микрочиповых технологий позволяет существенно сократить время цикла ПЦР, и соответственно сократить время ПЦР анализа и увеличить производительность.
Однако, реализация ПЦР PB в подобных микрофлюидных устройствах сталкивается с определенными трудностями. Увеличение соотношения площади поверхности между микрореактором и образцом к объему вызывает снижение активности и даже необратимую деактивацию фермента полимеразы. На поверхностях таких материалов как кремний, металлы, кварц, стекло, наблюдается необратимая сорбция ДНК и фермента, других компонентов реакции. Для устранения указанных ограничений требуется добавление в реакционную смесь дополнительных веществ, предотвращающих сорбцию и деактивацию компонентов ПЦР, например введение аминокислот, белков и поверхностно-активных веществ [патент США 6,660,517 "Меsоsсаlе роlупuсlеоtidе аmрlifiсаtiоп dеviсеs"]. В этом же патенте раскрываются также способы, позволяющие создавать защитное покрытие поверхностей микрореакторов, в которых проводится ПЦР. Подобные покрытия предотвращают адсорбцию и ингибирование компонентов ПЦР, что позволяет достичь высокой чувствительности ПЦР анализа.
Одной из известных для специалистов проблем при проведении ПЦР является испарение образцов при термоциклировании. Так как температура денатурации ДНК близка к температуре кипения водных растворов, интенсивное испарение ПЦР смеси во время реакции может препятствовать протеканию ПЦР, что в стандартных устройствах как правило устраняется либо путем изолирования водной поверхности смеси от атмосферы при помощи жидкости, несмешивающейся с водой, например, минерального масла, либо путем герметизации реакционных сосудов при помощи нагреваемой крышки.
В закрытых каналах микрофлюидных чипов возможно герметизировать микрореакторы при помощи клапанов в микроканале [патент США 7,118,910 «Microfluidic dеviсе апd mеthоds оf usiпg sanлe»]. Реализация подобного способа герметизации технически сложна, и увеличивает стоимость анализа с использованием такого микрочипа.
Для микрочипов, содержащих открытые реакционные ячейки, известны способы изоляции реакционной смеси от атмосферы, заключающиеся в нанесении на поверхность водного раствора реакционной смеси несмешивающейся с водой жидкости, например минерального или силиконового масла [патент США 6,664,044 «Method fоr conducting PCR ргоtесtеd frоm evaporation»] для предотвращения испарения образцов при термоциклировании. Однако в описанном устройстве для ввода рабочей ПЦР смеси и образцов многократно задействована система струйной печати, что может привести к неконтролируемой деградации ПЦР реактивов и взаимному загрязнению образцов в процессе нанесения. Известен способ и устройство [патентная заявка США 20070196237 «Apparatus fоr rеgulаtiпg thе tеmреrаtuге оf а biоlоgiсаl апd/ог сhеmiсаl sаmрlе апd mеthоd оf usiпg thе same»], в котором используется микрочип с нанесенными на поверхность подложки реакционными объемами, представляющими собой каплю несмешивающейся с водой жидкости, в которую помещена ПЦР смесь. Однако в этом способе, реакционная смесь отделена от нагреваемой поверхности подложки слоем несмешивающейся с водой жидкости, как правило обладающей невысокой теплопроводностью, что замедляет процесс нагрева и охлаждения. Кроме того, в этом способе реакционные объемы могут неконтролируемо перемещаться, т.к. вся поверхность теплопроводящей подложки изотропна, что потенциально может приводить к пространственному несовпадению нагреваемой зоны и нагреваемого образца в процессе ввода пробы и термоциклирования, что приведёт к недостоверным результатам ПЦР анализа. Еще одним недостатком, общим для известных микрофлюидных устройств является повышенная трудоемкость смешивания образцов с компонентами ПЦР смеси до ввода в микрочип. Кроме того, эта процедура требует затрат на дополнительные расходные материалы (пластиковые наконечники, пробирки) и практически нереализуема в обычных пробирках при объеме манипулируемых жидкостей меньше одного мкл из-за повышенной вероятности испарения реактивов и образцов во время смешивания. Известны способы, позволяющие иммобилизовать в микрореакторе один или несколько компонентов реакционной смеси, необходимые для проведения ПЦР, для того, чтобы затем заполнить микрореактор водным раствором, содержащим нуклеиновые кислоты и недостающие компоненты ПЦР смеси [патент США 7,118,910 «Microfluidic dеviсе апd mеthоds оf usiпg same»]. Однако, указанный способ трудоемок и нелегко поддается контролю при производстве, так как требует нанесения биологических реагентов непосредственно в процессе изготовления микрочипа, что повышает опасность негативного воздействия последующих технологических процессов на нанесенные реактивы (воздействие повышенной температуры, химических соединений, излучения).
Известны способы лиофильного высушивания подготовленной ПЦР смеси, содержащей все или почти все компоненты реакции, а также дополнительные стабилизаторы, в пробирках [патент РФ 2259401 «Cyxaя смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения ПЦР- aнaлизa», патент США 6,153,412 «Lyophilized rеаgепt fоr роlуmеrаsе сhаiп гeaction»]. Этот метод может быть реализован практически в любой микрореакторной системе с открытыми реакторами. Несмотря на наличие большого числа способов и устройств реализации ПЦР PB в микрофлюидном и микрочиповом форматах, потребность в разработке новых, более совершенных способов и устройств сохраняется. В данной области техники существует потребность в экономически эффективном способе экспрессного количественного определения нуклеиновых кислот множества образцов, обладающем высокой чувствительностью, и не требующем больших трудозатрат при подготовке к анализу, а также потребность в устройстве для его осуществления.
Наиболее близким аналогом настоящего изобретения может служить способ и устройство, описанные в заявке на изобретение США 20070196237 «Apparatus fоr rеgulаtiпg thе tеmрегаturе оf а biоlоgiсаl апd/оr сhеmiсаl sаmрlе апd mеthоd оf usiпg thе same». В заявке раскрыт способ осуществления биохимических реакций, в том числе ПЦР PB, содержащий стадии термоциклирования и детектирования флуоресцентного сигнала, с использованием модуля терморегулирования, состоящего из нагревателя и датчика температуры, на указанный модуль помещается подложка из теплопроводящего материала, а на указанную подложку наносится биологический образец, например смесь, содержащая все компоненты для проведения ПЦР PB, которая изолируется от атмосферы путем внесения в виртуальную реакционную ячейку, образованную несмешивающейся с водой жидкостью, например минеральным маслом.
Основными недостатками протопипа являются: невысокие реальные скорости нагрева и охлаждения образца, техническая сложность модуля терморегулирования с интегрированными микронагревателем и термодатчиком, что приводит к удорожанию и снижает коммерческую привлекательность устройства. Еще одним недостатком аналога является неконтролируемое снижение чувствительности при возможном контакте образца с поверхностью теплопроводящего материала. Кроме того, раскрытые в описании аналога способ и устройство, требуют предварительного приготовления растворов ПЦР компонентов, смешивания ПЦР компонентов с пробой и введения получившейся смеси в реакционные зоны, что приводит к дополнительным трудозатратам, повышает риск ошибки оператора, и приводит к удорожанию анализа из-за возрастающего количества расходных материалов (пробирки, наконечники для дозатора, реактивы). Еще одним недостатком аналога является возможность пространственного несовпадения нагреваемой зоны и нагреваемого образца в процессе ввода пробы и термоциклирования, что приведёт к недостоверным результатам ПЦР анализа. Сущность изобретения Задачей настоящего изобретения является разработка способа и устройства для его осуществления, которые бы позволили:
1. сократить время анализа и повысить производительность анализа;
2. увеличить чувствительность, достоверность и надежность анализа;
3. сократить трудозатраты на проведение определения нуклеиновых кислот методом ПЦР PB; 4. снизить стоимость проведения ПЦР анализа.
Поставленная задача решается использованием описанного в настоящем изобретении способа определения нуклеиновых кислот при помощи полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройства для выполнения ПЦР PB анализа, содержащего микрочип.
Предлагается способ определения нуклеиновых кислот при помощи полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени, включающий в себя следующие стадии: введение жидких проб, содержащих нуклеиновую кислоту, в реакционные зоны на верхней поверхности теплопроводящей подложки микрочипа, и изолирование вводимых проб от атмосферы; взаимодействие нуклеиновой кислоты пробы с компонентами полимеразно- цепной реакции при термоциклировании проб, с отводом тепла через внешнюю поверхность микрочипа; флуоресцентное определение изменения количества продуктов полимеразно- цепной реакции в процессе термоциклирования; определение количества исходной нуклеиновой кислоты в пробах по динамике роста флуоресцентного сигнала.
При этом микрочип выполняют с теплопроводящей подложкой из теплопроводящего материала с коэффициентом теплопроводности больше 1 Вт/см- К и с коэффициентом тепловой диффузии больше 0.6 cм2/c; реакционные зоны на поверхности микрочипа отделяют от теплопроводящей подложки слоем пассивирующего материала, который ковалентно связан с поверхностью теплопроводящего материала, а изолирование вводимых проб выполняют путем отделения их от атмосферы слоем жидкости, несмешивающейся с водой, которую удерживают на верхней поверхности теплопроводящей подложки с помощью периферийного барьера, причем отношение суммарной термической массы микрочипа с введенными пробами и слоем несмешивающейся с водой жидкости к тепловой проводимости подложки микрочипа не превышает 0.04 секунды.
Устройство для осуществления указанного способа содержит микрочип по меньшей мере с одной реакционной зоной на его поверхности, который механически связан с держателем микрочипа, термически связан с блоком термоциклирования и оптически связан с детектором флуоресцентного излучения; устройство также содержит по меньшей мере один источник излучения, оптически связанный с блоком фильтрации излучения канала освещения и микрочипом, указанный детектор флуоресцентного излучения оптически связан с микрочипом через блок фильтрации излучения канала регистрации, а указанный блок термоциклирования выполнен с возможностью нагревания, охлаждения и поддержания температуры микрочипа, кроме того устройство содержит систему управления, электрически связанную с указанным детектором, источником излучения и блоком термоциклирования.
При этом указанный микрочип содержит теплопроводящую подложку, выполненную из материала с коэффициентом теплопроводности больше 1 Вт/см- К и с коэффициентом тепловой диффузии больше 0.6 cм2/c, каждая из реакционных зон на поверхности указанного микрочипа отделена от теплопроводящей подложки слоем пассивирующего материала, ковалентно связанного с поверхностью теплопроводящей подложки; на верхней поверхности указанного микрочипа выполнен периферический барьер с возможностью удержания заданного количества несмешивающейся с водой жидкости на верхней поверхности микрочипа, при этом отношение суммарной термической массы микрочипа с введенными пробами и слоем несмешивающейся с водой жидкости к тепловой проводимости подложки микрочипа не превышает 0.04 секунды.
Приведенная совокупность признаков предлагаемого изобретения за счет:
1) увеличения скорости термоциклирования;
2) устранения ингибирования реакции при помощи защитного покрытия поверхности реакционных зон;
3) устранения неконтролируемого перемещения пробы относительно реакционной зоны;
4) создания микрочипа, содержащего высушенные ПЦР реагенты, необходимые для определения заданных нуклеиновых кислот; 5) сокращения расхода реагентов и расходных материалов, и сокращения трудоемкости анализа, позволяет решить поставленную задачу. В предлагаемом изобретении используется микрочип, подложка которого выполнена из материалов с высокой теплопроводностью и тепловой диффузией, при этом поверхность реакционных зон на верхней поверхности микрочипа покрыта пассивирующим слоем, причем испарение ПЦР смеси предотвращается при помощи слоя изолирующей жидкости, а микрочип также может содержать в реакционных зонах один или несколько компонентов ПЦР смеси. Возможны различные схемы выполнения способа, описанного в настоящем изобретении.
Способы осуществления взаимодействия нуклеиновой кислоты пробы с компонентами ПЦР могут выполняться в различных вариантах. Например, проба, содержащая нуклеиновую кислоту, перед проведением анализа предварительно смешивается с одним или несколькими компонентами ПЦР смеси. Возможно смешивание пробы с раствором, содержащим все компоненты, необходимые для проведения ПЦР. Также возможно смешивание пробы с буферным раствором, содержащим один компонент, например ионы магния Mg2+, или несколько компонентов, например, ионы магния Mg2+ и полимеразу, или например, ионы магния Mg2+, олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченные зонды. В подобных случаях добавление недостающих компонентов ПЦР может быть осуществлено путём введения в реакционные зоны жидких растворов, содержащих эти компоненты, до или после ввода проб любым из известных способов. Предпочтительно, чтобы недостающие компоненты ПЦР были внесены в реакционные зоны до ввода проб.
Еще более предпочтительно, чтобы до ввода проб компоненты ПЦР были внесены в реакционные зоны в высушенном виде. Для этого в реакционные зоны на поверхности микрочипа на слой пассивирующего материала предпочтительно нанести один или несколько компонентов ПЦР в виде водного раствора и высушить указанный раствор. Способ предполагает, что в реакционные зоны могут быть внесены и высушены ПЦР компоненты, такие как дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ), прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентно-меченные зонды. Ещё более предпочтительно нанести в реакционные зоны и высушить дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ), прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентно-меченные зонды, термостабильную полимеразу и стабилизаторы. Стабилизаторы могут быть выбраны из ряда веществ, таких как полисахара (маннитол, глюкоза, сахароза). Способ предполагает, что флуоресцентное определение изменения количества продуктов полимеразно-цепной реакции в пробах в процессе термоциклирования может быть выполнено путем облучения проб выбранным диапазоном длин волн и регистрации сигнала флуоресценции в выбранном диапазоне длин волн. Преимущественно, облучение проб должно проводиться в интервале 350-700 нм, а флуоресценция должна регистрироваться в интервале 450 - 1000 нм.
Далее, способ предполагает, что микрочип может быть выполнен из различных материалов, предпочтительно обладающих высокими коэффициентами теплопроводности (больше 1 Вт/см К) и тепловой диффузии (больше 0.6 cм2/c). Таким материалом могут служить металлы, например алюминий, медь, или диэлектрики, такие как кремний или керамика. Наиболее предпочтительными материалами являются кремний и алюминий. Геометрические размеры микрочипа и его масса должны быть невелики, чтобы его термическая масса была малой. Предпочтительно, чтобы толщина подложки была менее 1 мм, чтобы обеспечить её высокую тепловую проводимость.
Способ предполагает, что слой пассивирующего материала выполнен из веществ, предотвращающих необратимую сорбцию компонентов ПЦР и ингибирование реакции. Преимущественно слой должен быть нанесен путем ковалентного связывания пассивирующего вещества с материалом теплопроводящей подложки микрочипа, чтобы повысить стойкость пассивирующего слоя к длительному хранению и к термоциклированию во время проведения реакции. Такие вещества могут быть выбраны из ряда: оксид алюминия, оксид кремния, органические молекулы, образующие монослои или полимерные покрытия. Органические молекулы могут быть выбраны из ряда: полидиметилсилоксан, полиметилметоксисилоксан, 3-глицидoкcипpoпилтpи- метоксисилан, этиленгликольдиглициловый эфир.
Еще более предпочтительно, чтобы слой пассивирующего материала в реакционных зонах обладал гидрофильными свойствами, чтобы обеспечить хорошую растекаемость раствора при вводе ПЦР смеси в реакционную зону. При этом предпочтительно, чтобы слой пассивирующего материала вне области реакционных зон обладал гидрофобными свойствами для предотвращения растекания водного раствора за границы реакционной зоны. Наиболее предпочтительно, чтобы пассивирующий материал в реакционных зонах был образован в результате реакции слоя 3- глицидоксипропилтриметоксисилана с этиленгликольдиглициловым эфиром.
Также предпочтительно, чтобы пассивирующий материал вне области реакционных зон был образован из полимерного слоя полиметилметоксисилоксана.
Изолирование от атмосферы проб, введенных в реакционные зоны, может осуществляться путем нанесения слоя изолирующей жидкости на реакционные зоны. В качестве изолирующей жидкости предпочтительно использовать несмешивающиеся с водой жидкости, обладающие меньшей плотностью чем вода, и предпочтительно имеющих температуру кипения выше 100 °C при атмосферном давлении. Изолирующие жидкости могут быть выбраны из ряда: минеральное масло, силиконовые жидкости различной вязкости, и их смеси. Способ предполагает, что изолирующая жидкость оптически прозрачна в диапазоне длин волн, в котором ведется возбуждение и регистрация люминесценции флуоресцентных красителей, использующихся для детектирования продуктов ПЦР PB. Предпочтительно, оптическое пропускание слоя изолирующей жидкости в указанном диапазоне длин волн должно быть не меньше 10%. Ещё более предпочтительно, чтобы в диапазоне регистрации люминесценции красителей слой изолирующей жидкости создавал сигнал флуоресценции не выше 10% от сигнала, создаваемого пробами, помещенными в реакционные зоны.
Способ предполагает, что возможно наносить слой изолирующей жидкости как однократно (до или после ввода проб), так и в два этапа: сначала слой изолирующей жидкости наносить на незаполненные реакционные зоны, затем производить ввод жидких проб сквозь указанный слой изолирующей жидкости, а затем дополнительно добавлять изолирующую жидкость.
Возможны различные конструктивные и компоновочные решения устройства настоящего изобретения. Микрочип из кремния по меньшей мере одной реакционной зоной на его поверхности может быть изготовлен методом фотолитографии с последующим жидкостным анизотропным или изотропным травлением, хорошо известным специалистам в области микроэлектромеханических систем. Микрочип из металла, керамики или пластика может быть изготовлен путем точной штамповки, горячего литья, лазерной абляции, жидкостного изотропного травления, плазменного травления, хорошо известным специалистам в данной области. Линейные размеры реакционной зоны выбираются из диапазона 101 - 104 мкм в длину и ширину, и 101 -103 мкм в глубину. Предпочтительно, линейные размеры реакционной зоны выбираются из диапазона 5x102 - 5x103 мкм в длину и ширину, и 2x102 - 5x102 мкм в глубину.
Габаритные размеры микрочипа должны быть выбраны такими, чтобы термическая масса микрочипа была мала, а толщина теплопроводящей подложки должна быть минимальной при сохранении достаточной прочности конструкции.
Предпочтительно, чтобы отношение термической массы микрочипа с введенными пробами и слоем несмешивающейся с водой жидкости к тепловой проводимости подложки микрочипа не превышало 0.04 секунды. Например, этим условиям удовлетворяет микрочип с подложкой, выполненной из кремния с размерами (Д х Ш х В) 28 х 25 х 0.6 мм, с 16 реакционными зонами размером (Д х Ш х Г) 2 х 2 х 0.4 мм каждая, с периферическим барьером, выполненным из полиакриламида в виде прямоугольной рамки с габаритными размерами (Д х Ш х В) 28 х 25 х 3 мм и шириной бортов 4 мм.
Периферический барьер может быть выполнен с помощью конструктивного элемента, возвышающегося над верхней поверхностью микрочипа и образующего замкнутый контур так, чтобы изолирующая жидкость заключалась в этом контуре в процессе проведения ПЦР. Возможно, чтобы периферический барьер был изготовлен из материала теплопроводящей подложки микрочипа. Предпочтительно, материал для изготовления периферического барьера должен быть с невысоким коэффициентом теплопроводности и малой теплоемкостью. Периферическим барьером может служить слой материала с олеофобными свойствами, нанесенный на поверхность микрочипа вокруг реакционных зон. Преимущественно материалом с олеофобными свойствами являются алкилсиланы с насыщенными фторуглеводородными цепями. Возможно, что периферический барьер выполняется в виде комбинации конструктивного элемента и слоя олеофобного материала. Предпочтительно, чтобы периферический барьер был изготовлен с возможностью изолирования реакционных зон от атмосферы путем нанесения на него клейкой пленки. Слой пассивирующего материала, ковалентно связанный с поверхностью микрочипа, может быть выполнен путем проведения химических реакций на поверхности микрочипа. Возможно проводить указанные реакции путем взаимодействия компонентов из газовой фазы с поверхностью микрочипа, например термохимическое окисление кремния с образованием слоя оксида кремния. Предпочтительно, чтобы указанные реакции выполнялись при взаимодействии компонентов из жидкой фазы с поверхностью микрочипа. Предпочтительно раздельно нанести слой пассивирующего материала на поверхность микрочипа в областях вне реакционных зон и слой пассивирующего материала в области реакционных зон. Ещё более предпочтительно нанести на поверхность микрочипа в областях вне реакционных зон слой полиметилметоксисилана, обладающего гидрофобными свойствами, путем контактного смачивания указанных областей раствором неполимеризованного полиметилметоксисилана и последующей термической полимеризацией. При этом слой пассивирующего материала в области реакционных зон нанести путем проведения последовательных химических реакций в реакционных зонах, например путем последовательной инкубации в реакционных зонах жидкого 3-глицидoкcипpoпилтpимeтoкcиcилaнa, а затем жидкого этиленгликольдиглицилового эфира. Нанесение одного или нескольких компонентов полимеразно-цепной реакции в реакционные зоны на поверхности микрочипа предпочтительно выполнять путем высушивания водного раствора указанных компонентов ПЦР смеси. При этом растворы, содержащие необходимые компоненты, должны быть внесены в реакционные зоны и высушены в ламинарном шкафу при комнатной температуре. Ещё более предпочтительно, чтобы высушивание указанных растворов производилось в режиме лиофилизации, при пониженных температурах и давлениях, например при температуре в диапазоне от минус 20 °C до минус 50 0C и давлении в диапазоне от 0.01 до 10 мм.рт.ст.
Детектор флуоресцентного излучения может включать в себя блок фильтрации излучения, выполненный с использованием абсорбционных и интерференционных светофильтров, а также дихроичных зеркал. Источником излучения может служить светодиод, оптически связанный с блоком фильтрации излучения и микрочипом посредством оптических элементов, например линз и зеркал. В устройстве, согласно изобретению, для детектирования нескольких продуктов ПЦР в одном микрореакторе возможно выполнить детектор, содержащий несколько источников излучения и несколько блоков фильтрации излучения, выполненных с возможностью переключения между одним и другим источником и блоком фильтрации излучения. Такой многоканальный детектор может быть построен с использованием нескольких светодиодов, светофильтров и дихроичных зеркал, отличающихся по своим спектральным характеристикам. Предпочтительно, чтобы источники излучения и блоки фильтрации излучения создавали световой поток в выбранном диапазоне длин волн возбуждения флуоресценции из интервала 350-700 нм и позволяли регистрировать сигнал флуоресценции в выбранном диапазоне длин волн из интервала 450 - 1000 нм. Диапазоны длин волн возбуждения и регистрации флуоресценции выбираются так, чтобы детектировать флуоресцентные красители, использующиеся в практике ПЦР PB, которые хорошо знакомы специалистам в данной области. Примерами красителей являются, карбоксифлуоресцеин (FAM), б-кapбoкcи-2',4,4',5',7,71- гексахлорфлуоресцеин (HEX), 6-кapбoкcиpoдaмин (R6G), карбокси-Х-родамин (ROX), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), б-карбокси^'.δ'-дихлор-г'J1- диметоксифлуоресцеин (6-JOE), карбоксиродамин (R110).
Детектором флуоресцентного излучения может служить матричный детектор, фотоэлектронный умножитель или фотодиод. В устройстве, согласно изобретению, предпочтительно, чтобы в качестве детектора излучения использовался матричный детектор, например ПЗС-матрица (ПЗС - прибор с зарядовой связью) или КМОП-матрица (КМОП - комплементарный металл - оксид - полупроводник). В этом случае предпочтительно, чтобы на матричном детекторе формировалось изображение микрочипа при помощи оптических элементов, например, при помощи линзового, зеркально-линзового или зеркального объектива. Предпочтительно, чтобы матричный детектор позволял регистрировать сигнал флуоресценции во всем диапазоне длин волн из интервала 450 - 1000 нм. Блок термоциклирования, который термически связан с микрочипом, может быть выполнен с возможностью нагревания, охлаждения и поддержания температуры микрочипа с использованием резистивных нагревателей, полупроводниковых термоэлектрических модулей (элементов Пельтье), индукционных нагревателей, нагревателей, использующих перенос энергии в виде излучения, нагревателей, использующих перенос тепловой энергии с помощью потока жидкости или газа, в том числе с использованием конденсации и испарения. В устройстве, согласно изобретению, предпочтительно, чтобы блок термоциклирования был выполнен с использованием элемента Пельтье, т.к. в этом случае осуществляется и активный нагрев, и активное охлаждение микрочипа.
Перечень рисунков.
Настоящее изобретение поясняется следующими рисунками, на которых представлены: на фиг.1 - схема микрочипа для осуществления способа анализа нуклеиновых кислот методом ПЦР PB; на фиг.2 - вариант схемы микрочипа для осуществления способа анализа нуклеиновых кислот методом ПЦР PB с компонентами полимеразно- цепной реакции в высушенном виде; на фиг.З - пример схемы конструкции устройства микрочипового ПЦР- анализатора; на фиг.4 - результат определения ДНК методом ПЦР PB с использованием устройства, согласно изобретению при использовании температурного режима, рекомендованного производителем реактивов; на фиг.5 - результат определения ДНК методом ПЦР PB с использованием устройства, согласно изобретению при использовании температурного режима с сокращенными длительностями стадий ПЦР.
Подробное раскрытие изобретения.
Пример выполнения микрочипа для осуществления способа анализа нуклеиновых кислот методом ПЦР PB в соответствии с настоящим изобретением изображен на фиг.1 и фиг.2. В реакционной зоне 1 , расположенной на верхней поверхности микрочипа, находится проба 2.
Микрочип содержит теплопроводящую подложку 3, выполненную из теплопроводящего материала, коэффициент теплопроводности которого больше 1 Вт/см- К, а коэффициент тепловой диффузии больше 0.6 cм2/c.
Согласно варианту исполнения, изображенному на фиг. 1, реакционная зона 1 отделена от теплопроводящей подложки 3 слоем пассивирующего материала 4, который ковалентно связан с поверхностью теплопроводящего материала. В другом исполнении, изображенном на фиг. 2, реакционная зона 1 на поверхности микрочипа отделена от теплопроводящей подложки 3 слоем пассивирующего материала 7, который обладает гидрофильными свойствами и ковалентно связан с поверхностью теплопроводящего материала. В области вне реакционной зоны 1 поверхность теплопроводящей подложки 3 покрыта слоем пассивирующего материала 8, который обладает гидрофобными свойствами и ковалентно связан с поверхностью теплопроводящего материала. В реакционной зоне 1 на слое пассивирующего материала 8 расположен слой 9, содержащий один или несколько компонентов полимеразно-цепной реакции в высушенном виде.
Согласно вариантам исполнения, изображенным на фиг. 1 и фиг. 2, слой изолирующей жидкости 5 отделяет вводимую пробу 2 от атмосферы. Периферический барьер 6 удерживает слой изолирующей жидкости 5 на верхней поверхности теплопроводящей подложки 3. Для осуществления способа согласно изобретению, ввод пробы 2, содержащей нуклеиновую кислоту, в реакционную зону 1 осуществляют сквозь слой изолирующей жидкости 5. Нагрев и охлаждение пробы 2, помещенной в реакционную зону 1 , осуществляют со стороны нижней поверхности теплопроводящей подложки 3. Флуоресцентное определение количества продуктов полимеразно-цепной реакции в пробе 2, помещенной в реакционную зону 1 , в процессе термоциклирования выполняют со стороны верхней поверхности теплопроводящей подложки 3, сквозь слой изолирующей жидкости 5.
Пример конструкции устройства в соответствии с настоящим изобретением изображен на фиг.З. Устройство содержит по меньшей мере одну реакционную зону на поверхности микрочипа 10, который механически связан с держателем микрочипа 11 , термически связан с блоком термоциклирования 12 и оптически связан с детектором флуоресцентного излучения 13. Устройство содержит по меньшей мере один источник излучения 14, оптически связанный с блоком фильтрации излучения канала освещения 15, дихроичным зеркалом 16, объективом 17 и микрочипом 10. Детектор флуоресцентного излучения 13 оптически связан с микрочипом 10 через объектив 17, дихроичное зеркало 16 и блок фильтрации излучения канала регистрации 18. Блок термоциклирования 12 выполнен с возможностью нагревания, охлаждения и поддержания температуры микрочипа 10. Устройство содержит также систему управления 19, электрически связанную с детектором излучения 13, по крайней мере с одним источником излучения 14 и блоком термоциклирования 12. Система управления 19 выполнена с возможностью переключения источников излучения 14 между одним источником излучения и другим источником излучения (если источников больше одного), а также с возможностью изменения спектрального диапазона блока (или блоков) фильтрации излучения.
Устройство работает следующим образом. Микрочип 10 вставляется в держатель микрочипа 11. На верхнюю поверхность микрочипа 10 наносится слой изолирующей жидкости 5 и сквозь него осуществляется ввод пробы 2 в реакционную зону 1. Держатель микрочипа 11 со снаряженным микрочипом 10 затем устанавливается в блок термоциклирования 12. Излучение от источника излучения 14 направляется в блок фильтрации излучения канала освещения 15, затем отражается от дихроичного зеркала 16, попадает в объектив 17 и попадает на пробу 2, расположенную в реакционной зоне микрочипа 1 сквозь слой изолирующей жидкости 5. Флуоресцентное излучение от пробы сквозь слой изолирующей жидкости 5 собирается объективом 17 и направляется через дихроичное зеркало 16 и блок фильтрации излучения канала регистрации 18 на детектор флуоресцентного излучения 13. Блок термоциклирования 12, который термически связан с микрочипом 10, осуществляет подвод и отвод тепла для осуществления нагревания, охлаждения и поддержания температуры микрочипа 10. Высокие скорости нагрева и охлаждения достигаются благодаря малой суммарной термической массе микрочипа с введенными пробами и слоем несмешивающейся с водой жидкости (в диапазоне от 0,5 до 4 Дж/К), выполненного с использованием теплопроводящей подложки с высокой тепловой проводимостью (в диапазоне от 100 до 500 Вт/К), что приводит в результате к малому отношению суммарной термической массы микрочипа к тепловой проводимости подложки микрочипа (в диапазоне от 0.001 до 0.04 с). Управление температурным режимом блока термоциклирования 12, выбор и включение источника излучения 14, а также сбор и обработку сигналов флуоресцентного детектора 13 во время термоциклирования пробы, осуществляет система управления 19, электрически связанная с блоками 12, 13 и 14. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Описание данных примеров не должно быть использовано для ограничения притязаний данного патента, оно лишь иллюстрирует возможность для специалистов в данной области осуществить изобретение. Пример 1
Микрочип, содержащий 16 реакционных зон на его поверхности, был изготовлен из полированных кристаллических кремниевых пластин толщиной 0,6 мм методом фотолитографии с последующим анизотропным жидкостным химическим травлением. Размер теплопроводящей подложки составлял 25 х 28 х 0,6 мм. Реакционные зоны были расположены на поверхности микрочипа в виде матрицы 4 x 4, каждая реакционная зона представляла собой усеченную пирамиду с размерами верхнего основания 2 x 2 мм, нижнего основания 1 ,7 х 1 ,7 мм и глубиной 0,4 мм. На кремниевую подложку по всей поверхности был нанесен слой оксида кремния SiO2 методом термохимического окисления. Кремниевая подложка с нанесенным слоем SiO2 была очищена в смеси концентрированной серной кислоты и пероксида водорода (3:1) в течение 20 минут. После тщательной промывки дистиллированной и деионизованной водой и высушивания, поверхность кремниевой подложки в области вне реакционных зон была обработана полиметилметоксисилоксаном «Пeнтa-111 » (Пента-Север, Россия). После полимеризации при термической обработке поверхность реакционных зон была обработана сначала 3-глицидoкcипpoпил- триметоксисиланом (Sigmа, США) в течение 60 мин, а затем этиленгликоль- диглициловым эфиром (Sigmа, США) в течение 60 мин. Затем подготовленная таким образом подложка присоединялась при помощи клея к периферическому барьеру, выполненному из полиакриламида толщиной 3 мм.
Согласно проведенным расчетам, полная термическая масса микрочипа с введенными в реакционные зоны пробами и изолирующей жидкостью составила 3.35 Дж/К. Тепловая проводимость кремниевой подложки составила 175 Вт/К. При этом отношение полной термической массы микрочипа к тепловой проводимости подложки микрочипа не превышает 0.02 секунды.
Изготовленный микрочип проходил обработку УФ излучением в течении 5 мин, а затем на верхнюю поверхность периферического барьера наносилась защитная полимерная пленка для предотвращения загрязнения поверхности реакционных зон при хранении и при обращении с микрочипом. В таком виде микрочип мог храниться при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. В устройстве, согласно настоящему изобретению, в качестве источников излучения были использованы светодиоды XL9030 (Сrее, США), в качестве детектора - ПЗС камера МultiВluе (Реrkiп-Еlmеr Орtоеlесtrопiсs, США), а в блоке фильтрации излучения использовался набор интерференционных светофильтров XF-52 (Оmеgа Орtiсаl, США). В блоке термоциклирования был использован элемент Пельтье (40 Вт, Криотерм, Россия), а в качестве системы управления использовался персональный компьютер с установленным программным обеспечением.
Для проведения ПЦР PB были приготовлены следующие растворы:
1) амплификационная смесь, содержащая: 80 мМ Тris-НСI (pH=8,0), 0,1% Тritоп X-100, 5% глицерин (Sigmа, США),
5 мМ MgCI2, 24 мМ (NH4J2SO4, 0,5 мМ EDTA, дезоксинуклеозидтрифосфаты dАТР, dТТР, dGТР, dСТР по 500 мкМ каждого, ОligоТаq ДНК-полимераза 0,1 U/μl (Ргоmеgа, США); прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры в концентрации 0,5 мкМ, флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд в концентрации 0,2 мкМ для определения Еsсhеriсhiа соli, штамм C600, фрагмент гена 16S рРНК, стерильная деионизованная вода.
2) раствор образца, содержащий 104 ДНК копий Еsсhеriсhiа соli в 1 мкл, штамм C600, в стерильной деионизованной воде (образец K+). В качестве образца, не содержащего специфичную ДНК, использовалась стерильная деионизованная вода (образец K-).
Растворы готовились непосредственно перед проведением анализа, смешивались между собой в соотношении 1 :1 , перемешивались путем вортексирования и пипетирования, а затем центрифугировались. Полученную рабочую ПЦР смесь использовали для ввода в реакционные зоны микрочипа. На верхнюю поверхность микрочипа, ограниченную периферическим барьером, при помощи микродозатора вносилось 100 мкл силиконовой жидкости ПMC-200 (Пента-Север, Россия), которая служила изолирующей жидкостью. Введение рабочей ПЦР смеси объемом 2 мкл осуществлялось при помощи микродозатора сквозь слой изолирующей жидкости. Благодаря тому, что поверхность реакционных зон обладала гидрофильными свойствами, а поверхность вне области реакционных зон обладала гидрофобными свойствами, раствор легко растекался по реакционным зонам и при этом удерживался в них, не растекаясь по поверхности подложки и предотвращая таким образом взаимную контаминацию.
Термоциклирование осуществлялось по температурному режиму, рекомендованному производителем реактивов, а именно: активация полимеразы 94 0C в течение 180 с (1 цикл), денатурация ДНК 94 0C в течение 20 с, отжиг праймеров 58 0C в течение 40 с, элонгация ампликонов и считывание сигнала флуоресценции 72 0C в течение 20 с (45 циклов).
Результат ПЦР PB приведен на фиг.4. Для ПЦР PB кривых характерно то, что на начальных циклах интенсивность флюоресценции мала и практически не изменяется. Этот уровень флюоресценции называется базовым. Показателем накопления продукта реакции является так называемый "пороговый цикл" (Ct, thrеshоld сусlе), т.е. цикл, на котором интенсивность флюоресценции начинает превышать базовый порог. Из фиг.4 видно, что в пробах, содержащих искомую ДНК, наблюдается увеличение сигнала флуоресценции, а в пробах, не содержащих ДНК, сигнал флуоресценции остается на базовом уровне. Сравнение средней величины пороговых циклов (Ct), полученных для описанных в настоящем примере растворов с использованием устройства согласно изобретению (Ct = 31.3), и пороговых циклов, полученных на коммерчески доступном оборудовании SmаrtСусlеr Il (Серhеid, США) с использование полностью аналогичного режима термоциклирования (Ct = 31.0), показывает, что аналитические характеристики устройства согласно изобретению и коммерческого оборудования сравнимы.
При этом максимальные скорости нагрева и охлаждения для устройства согласно изобретению составили 16,5 и 14,3 °C/c, соответственно, что в 4 и 8 раз выше, чем аналогичные параметры у обычного лабораторного оборудования, а также в 2 и 5 раз выше, чем у наиболее быстрых образцов коммерчески доступного оборудования.
Время, затрачиваемое в настоящем примере на достижение порогового цикла при использовании устройства согласно изобретению, составило 53.1 мин. Пример 2
Использовался микрочип и устройство согласно настоящему изобретению, аналогичные описанным в примере 1.
Для проведения ПЦР PB были приготовлены растворы, аналогичные примеру 1. Приготовление рабочей ПЦР смеси и её ввод в реакционные зоны микрочипа осуществлялся аналогично примеру 1.
Термоциклирование осуществлялось по температурному режиму, в котором были сокращены длительности стадий денатурации, отжига праймеров и элонгации, а именно: активация полимеразы 94 0C в течение 120 с (1 цикл), денатурация ДНК 94 0C в течение 3 с, отжиг праймеров 58 0C в течение 3 с, элонгация ампликонов и считывание сигнала флуоресценции 72 0C в течение 8 с (45 циклов).
Результат ПЦР PB приведен на фиг.5. Из рисунка видно, что в пробах, содержащих искомую ДНК, наблюдается увеличение сигнала флуоресценции, а в пробах, не содержащих ДНК, увеличения сигнала флуоресценции не происходит. Сравнение пороговых циклов (Ct), полученных с использованием устройства согласно изобретению при температурном режиме, рекомендованном производителем тест-систем Ct = 31.3, и при температурном режиме, в котором были сокращены длительности стадий ПЦР Ct = 31.9, показывает, что эффективность ПЦР реакции при использовании сокращенного температурного режима изменилась незначительно.
При этом время, затрачиваемое в настоящем примере на достижение порогового цикла, при использовании устройства согласно изобретению составило 18.0 мин, что более чем в 3 раза быстрее, чем при использовании одного из самых быстрых коммерчески доступных ПЦР анализаторов Smаrt Сусlеr Il (54.7 мин). Пример 3
Использовался микрочип и устройство согласно настоящему изобретению, аналогичные описанным в примере 1. Для проведения ПЦР PB были приготовлены следующие растворы:
1) амплификационная смесь, содержащая: 80 мМ Тris-НСI (pH=8,0), 0,1% Тritоп X-100, 24 мМ (NH4)2SO4, 0,5 мМ EDTA, дезоксинуклеозидтрифосфаты dАТР, dТТР, dGТР, dСТР по 500 мкМ каждого, 0,16% D-глюкоза, 1 ,6 % инулин, 8% D-маннитол (Sigmа, США), ОligоТаq ДНК-полимераза 0,1 U/μl (Ргоmеgа, США); прямой и обратный праймеры в концентрации 0,5 мкМ, флуоресцентно- меченый олигонуклеотидный зонд в концентрации 0,2 мкМ для определения ДНК Еsсhеriсhiа соli, штамм C600, фрагмент гена 16S рРНК, стерильная деионизованная вода. 2) раствор образца, содержащий: 104 ДНК копий в 1 мкл Еsсhеriсhiа соli, штамм C600, в стерильной деионизованной воде (образец K+) или стерильная деионизованная вода (образец K-), растворенные в растворе, содержащим 5 мМ MgCI2, 10 мМ Тгis-НСI (pH=8,0), 0,1% Тritоп X-100, 5% глицерин (Sigmа, США) и стерильную деионизованную воду. В каждую из 16 реакционных зон микрочипа вносилось по 1 мкл амплификационной смеси, приготовленной согласно п.1 настоящего примера. Смесь высушивалась в ламинарном шкафу при комнатной температуре в течение 2 - 3 часов до образования плотного слоя, прочно удерживаемого в реакционных зонах. На верхнюю поверхность периферического барьера наносилась защитная пленка с клеевым слоем, изолирующая реакционные зоны от атмосферы, для предотвращения загрязнения поверхности реакционных зон при хранении и при обращении с микрочипом. В таком виде микрочип мог храниться при комнатной температуре в течение нескольких недель. Для проведения ПЦР анализа ввод раствора образца согласно п.2 настоящего примера, осуществлялся в реакционные зоны микрочипа аналогично примеру 1.
Термоциклирование осуществлялось по температурному режиму, рекомендованному производителем реактивов, а именно: активация полимеразы 94 0C в течение 180 с (1 цикл), денатурация ДНК 94 0C в течение 20 с, отжиг праймеров 58 0C в течение 40 с, элонгация ампликонов и считывание сигнала флуоресценции 72 0C в течение 20 с (45 циклов).
В результате были получены ПЦР PB кривые (данные не приведены), из которых было видно, что в пробах, содержащих искомую ДНК, наблюдается увеличение сигнала флуоресценции, а в пробах, не содержащих ДНК, увеличения сигнала флуоресценции не происходит. В эксперименте было установлено, что количество расходных материалов, трудозатрат и времени, затрачиваемых на выполнение подготовительных операций по приготовлению образцов и введению полученных смесей в реакционные зоны, значительно сокращается при использовании способа и устройства согласно настоящему изобретению, по сравнению с обычным оборудованием. Например, количество ПЦР реагентов сократилось в 12 раз, количество наконечников для дозатора сократилось в 6 раз, количество стадий пипетирования сократилось в 2 раза, время, требуемое на проведение подготовительных операций, сократилось в 4 раза.
К важным достоинствам настоящего изобретения, приводящим к достижению поставленной задачи, можно отнести:
1. увеличение скорости термоциклирования образца за счет использования материалов с высокой теплопроводностью, а также за счет обеспечения контакта образца с поверхностью реакционной зоны;
2. устранение ингибирования ПЦР при помощи пассивирующего покрытия поверхности реакционных зон, что увеличивает чувствительность, достоверность и надежность анализа;
3. сокращение трудозатрат и стоимости проведения ПЦР анализа за счет использования микрочипа, содержащего высушенные ПЦР реагенты.
Выше приведены предпочтительные примеры осуществления изобретения, не ограничивающие существо и объем изобретения, а лишь иллюстрирующие его. Специалисты в данной области без затруднений смогут найти различные изменения и усовершенствования предложенного изобретения, которые тоже подпадают под его объем, отраженный в формуле изобретения.

Claims

Формула изобретения
1. Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно- цепной реакции в режиме реального времени, включающий введение жидких проб, содержащих нуклеиновую кислоту, в реакционные зоны на верхней поверхности теплопроводящей подложки микрочипа; изолирование вводимых проб от атмосферы; взаимодействие нуклеиновой кислоты пробы с компонентами полимеразно-цепной реакции при термоциклировании проб с отводом тепла через внешнюю поверхность микрочипа; флуоресцентное определение изменения количества продуктов полимеразно-цепной реакции в процессе термоциклирования; определение количества исходной нуклеиновой кислоты в пробах по динамике роста флуоресцентного сигнала, отличающийся тем, что используют микрочип с теплопроводящей подложкой из теплопроводящего материала с коэффициентом теплопроводности больше 1 Вт/см К и с коэффициентом тепловой диффузии больше 0.6 cм2/c, при этом реакционные зоны на поверхности микрочипа отделяют от теплопроводящей подложки слоем пассивирующего материала, который ковалентно связан с поверхностью теплопроводящего материала, а изолирование вводимых проб выполняют путем отделения их от атмосферы слоем жидкости, несмешивающейся с водой, которую удерживают на верхней поверхности теплопроводящей подложки с помощью периферийного барьера, причем отношение суммарной термической массы микрочипа с введенными пробами и слоем несмешивающейся с водой жидкости к тепловой проводимости подложки микрочипа не превышает 0.04 секунды.
2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что флуоресцентное определение изменения количества продуктов полимеразно-цепной реакции в пробах в процессе термоциклирования выполняют путем облучения проб выбранным диапазоном длин волн из интервала 350-700 нм и регистрации сигнала флуоресценции в выбранном диапазоне длин волн из интервала 450 - 1000 нм.
3. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве теплопроводящего материала используют кремний.
4. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве теплопроводящего материала используют металл.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве металла используют алюминий или медь.
6. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве пассивирующего материала используют оксид кремния, или оксид металла, или полиметилметоксисилоксан, или 3-глицидoкcипpoпил- триметоксисилан с этиленгликольдиглициловым эфиром.
7. Способ по п.1 , отличающийся тем, что введение жидких проб в реакционные зоны осуществляют сквозь слой несмешивающейся с водой жидкости.
8. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве пассивирующего материала на поверхности микрочипа в реакционных зонах используют гидрофильный материал, а в качестве пассивирующего материала на поверхности микрочипа между реакционными зонами используют гидрофобный материал.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что в качестве пассивирующего материала на поверхности микрочипа в реакционных зонах используют 3-глицидoкcипpoпилтpимeтoкcиcилaн с этиленгликольдиглициловым эфиром, а в качестве пассивирующего материала на поверхности микрочипа между реакционными зонами используют полиметилметоксисилоксан.
10. Способ по п.1 , отличающийся тем, что используют слой несмешивающейся с водой жидкости, пропускание которого в выбранном спектральном диапазоне облучения и в выбранном спектральном диапазоне флуоресценции не менее 10%.
11. Способ по п.1 отличающийся тем, что используют слой несмешивающейся с водой жидкости, сигнал флуоресценции от которой не превышает 10% от сигнала, создаваемого пробами, помещенными в реакционные зоны.
12. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в качестве несмешивающейся с водой жидкости используют полиметилсилоксановую жидкость, плотность которой меньше, чем плотность воды.
13. Способ по п.1 , отличающийся тем, что в реакционные зоны на поверхности микрочипа на слой пассивирующего материала наносят один или несколько компонентов полимеразно-цепной реакции в виде водного раствора и высушивают указанный раствор.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что водный раствор, содержащий один или несколько компонентов полимеразно-цепной реакции, высушивают путем лиофильного высушивания.
15. Устройство для определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени содержащее микрочип по меньшей мере с одной реакционной зоной на его поверхности, который механически связан с держателем микрочипа и оптически связан с детектором флуоресцентного излучения через блок фильтрации излучения канала регистрации, включающее по меньшей мере один источник излучения, оптически связанный с блоком фильтрации излучения канала освещения и микрочипом, а также систему управления, электрически связанную с блоком термоциклирования, который термически связан с микрочипом и выполнен с возможностью нагревания, охлаждения и поддержания температуры микрочипа, отличающееся тем, что микрочип содержит термически связанную с блоком термоциклирования теплопроводящую подложку, выполненную из материала с коэффициентом теплопроводности больше 1 Вт/см К и с коэффициентом тепловой диффузии больше 0.6 cм2/c, а каждая из реакционных зон отделена от теплопроводящей подложки слоем пассивирующего материала, ковалентно связанного с поверхностью теплопроводящей подложки, причем на верхней поверхности микрочипа выполнен периферический барьер с возможностью удержания заданного количества несмешивающейся с водой жидкости на верхней поверхности микрочипа, причем отношение суммарной термической массы микрочипа с введенными пробами и слоем несмешивающейся с водой жидкости к тепловой проводимости подложки микрочипа не превышает 0.04 секунды.
16. Устройство по п.15, отличающееся тем, что в качестве источника излучения используется по крайней мере один светодиод.
17. Устройство по п.15, отличающееся тем, что в качестве источника излучения используется матрица светодиодов.
18. Устройство по п.15, отличающееся тем, что система управления выполнена с возможностью переключения источников излучения между одним источником излучения и другим источником излучения.
19. Устройство по п.15, отличающееся тем, что система управления выполнена с возможностью изменения спектрального диапазона блока (или блоков) фильтрации излучения.
20. Устройство по п.15, отличающееся тем, что детектором флуоресцентного излучения служит матричный детектор.
21. Устройство по п.17, отличающийся тем, что в качестве детектора флуоресцентного излучения используется фотоэлектронный умножитель.
22. Устройство по п.17, отличающийся тем, что в качестве детектора флуоресцентного излучения используется фотодиод.
23. Устройство по п.15, отличающийся тем, что блок термоциклирования включает в себя Пельтье элемент.
24. Устройство по п.15, отличающееся тем, что микрочип выполняют таким образом, что поверхность микрочипа в реакционных зонах покрыта слоем гидрофильного пассивирующего материала, а поверхность микрочипа между реакционными зонами покрыта гидрофобным пассивирующим материалом.
25. Устройство по п.15, отличающееся тем, что микрочип выполняют таким образом, что реакционные зоны на поверхности микрочипа сверху слоя пассивирующего материала содержат один или несколько компонентов полимеразно-цепной реакции в высушенном виде.
26. Устройство по п. 15, отличающееся тем, что периферический барьер выполняют с возможностью изоляции реакционных зон от атмосферы при помощи клеевой пленки.
27. Устройство по п. 15, отличающееся тем, что система управления выполнена с возможностью автоматического переключения источников излучения и блоков фильтрации светового излучения, и синхронизованного с этими переключениями сбора сигналов от детектора излучения.
PCT/RU2009/000531 2008-10-23 2009-10-08 Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления WO2010047619A1 (ru)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAA201104030A UA101848C2 (ru) 2008-10-23 2009-10-08 Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления
ES09822256.5T ES2623605T3 (es) 2008-10-23 2009-10-08 Método para determinar ácidos nucleicos por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y un dispositivo para su implementación
EA201100576A EA018889B1 (ru) 2008-10-23 2009-10-08 Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления
EP09822256.5A EP2348123B1 (en) 2008-10-23 2009-10-08 Method for determining nucleic acids by real-time polymerase chain reaction and a device for the implementation thereof
US13/122,484 US9631229B2 (en) 2008-10-23 2009-10-08 Method of nucleic acids analysis by real-time polymerase chain reaction and device for performing the same
CA2739886A CA2739886C (en) 2008-10-23 2009-10-08 Method of nucleic acids analysis by real-time polymerase chain reaction and device for performing the same
CN2009801418426A CN102203272A (zh) 2008-10-23 2009-10-08 通过实时聚合酶链反应的核酸分析方法及实施该方法的装置

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008143309 2008-10-23
RU2008143309/13A RU2385940C1 (ru) 2008-10-23 2008-10-23 Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010047619A1 true WO2010047619A1 (ru) 2010-04-29

Family

ID=42119498

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2009/000531 WO2010047619A1 (ru) 2008-10-23 2009-10-08 Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9631229B2 (ru)
EP (1) EP2348123B1 (ru)
CN (1) CN102203272A (ru)
CA (1) CA2739886C (ru)
EA (1) EA018889B1 (ru)
ES (1) ES2623605T3 (ru)
RU (1) RU2385940C1 (ru)
UA (1) UA101848C2 (ru)
WO (1) WO2010047619A1 (ru)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5867668B2 (ja) * 2010-12-01 2016-02-24 セイコーエプソン株式会社 熱サイクル装置及び熱サイクル方法
US8586387B2 (en) * 2011-08-30 2013-11-19 Supernova Diagnostics, Inc. Methods of triggering activation of encapsulated signal-generating substances and apparatus utilising activated signal-generating substances
CN102643742B (zh) * 2012-04-18 2013-06-05 西安建筑科技大学 一种自养菌动力学参数测量装置及测量方法
KR101618113B1 (ko) 2014-02-10 2016-05-09 나노바이오시스 주식회사 일 방향 슬라이딩 구동 수단을 구비하는 pcr 장치 및 이를 이용하는 pcr 방법
EP3168287A4 (en) 2014-07-08 2018-01-24 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Nucleic acid amplification device, nucleic acid amplification method, and chip for nucleic acid amplification
CN104293662B (zh) * 2014-09-10 2016-08-17 瑞基海洋生物科技股份有限公司 生化反应器
CN104293649B (zh) * 2014-10-09 2016-07-06 中国科学院合肥物质科学研究院 一种适用于pcr或hrm检测分析的微流控芯片及检测装置
DE102015001998B3 (de) * 2015-02-20 2016-02-04 Friz Biochem Gesellschaft Für Bioanalytik Mbh Mikrofluidische Kartusche für den Nachweis von Biomolekülen
US20190032114A1 (en) * 2016-01-20 2019-01-31 Triv Tech, Llc Point-of-care nucleic acid amplification and detection
US11285478B2 (en) 2016-04-04 2022-03-29 Combinati Incorporated Microfluidic siphoning array for nucleic acid quantification
EP3426793A4 (en) * 2016-07-22 2019-03-27 Hewlett-Packard Development Company, L.P. METHOD FOR PREPARING TEST SAMPLES
BR112019008753A2 (pt) * 2016-11-01 2019-07-16 Nippon Sheet Glass Co Ltd recipiente de tratamento de reação e dispositivo de tratamento de reação
CN108060075A (zh) * 2018-01-30 2018-05-22 福州大学 微流控单细胞基因表达检测芯片及其工作方法与制备方法
CN110885904B (zh) * 2018-09-10 2023-07-28 北京亿森宝生物科技有限公司 用于鉴别16种猪病病原冻干微芯片、试剂盒及方法
KR102256757B1 (ko) * 2019-04-11 2021-05-27 (주)바이오니아 중합효소 연쇄반응 시스템
US11465143B2 (en) 2019-06-07 2022-10-11 Nippon Sheet Glass Company, Limited Reaction processing vessel
JP6652673B1 (ja) * 2019-06-07 2020-02-26 日本板硝子株式会社 反応処理容器
CN111304072B (zh) * 2020-02-28 2023-05-02 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 一种用于数字pcr芯片的油封装置
WO2023042859A1 (ja) * 2021-09-15 2023-03-23 株式会社幹細胞＆デバイス研究所 細胞群運動特性測定方法、細胞群測定デバイス

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6153412A (en) 1998-12-07 2000-11-28 Bioneer Corporation Lyophilized reagent for polymerase chain reaction
US6660517B1 (en) 1992-05-01 2003-12-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
US6664044B1 (en) 1997-06-19 2003-12-16 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Method for conducting PCR protected from evaporation
RU2259401C1 (ru) 2004-04-27 2005-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "Компания "Биоком" (ООО "Компания "Биоком") Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения пцр-анализа
WO2006085948A2 (en) * 2004-07-01 2006-08-17 Cornell Research Foundation, Inc. Real-time pcr detection of microorganisms using an integrated microfluidics platform
US7118910B2 (en) 2001-11-30 2006-10-10 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
US20070196237A1 (en) 2006-02-17 2007-08-23 Agency For Science, Technology And Research Apparatus for regulating the temperature of a biological and/or chemical sample and method of using the same
US20080214412A1 (en) * 1998-08-28 2008-09-04 Stahler Cord F Method and device for preparing and/or analyzing biochemical reaction carriers

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303343B1 (en) * 1999-04-06 2001-10-16 Caliper Technologies Corp. Inefficient fast PCR
GB9922971D0 (en) * 1999-09-29 1999-12-01 Secr Defence Reaction system
US7122799B2 (en) * 2003-12-18 2006-10-17 Palo Alto Research Center Incorporated LED or laser enabled real-time PCR system and spectrophotometer
JP4592060B2 (ja) * 2004-04-26 2010-12-01 キヤノン株式会社 Ｐｃｒ増幅反応装置、ならびに、該装置を利用するｐｃｒ増幅反応方法
US20070254284A1 (en) * 2006-05-01 2007-11-01 Biwei Zhao A nucleic acid detection method

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6660517B1 (en) 1992-05-01 2003-12-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
US6664044B1 (en) 1997-06-19 2003-12-16 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Method for conducting PCR protected from evaporation
US20080214412A1 (en) * 1998-08-28 2008-09-04 Stahler Cord F Method and device for preparing and/or analyzing biochemical reaction carriers
US6153412A (en) 1998-12-07 2000-11-28 Bioneer Corporation Lyophilized reagent for polymerase chain reaction
US7118910B2 (en) 2001-11-30 2006-10-10 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
RU2259401C1 (ru) 2004-04-27 2005-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "Компания "Биоком" (ООО "Компания "Биоком") Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения пцр-анализа
WO2006085948A2 (en) * 2004-07-01 2006-08-17 Cornell Research Foundation, Inc. Real-time pcr detection of microorganisms using an integrated microfluidics platform
US20070196237A1 (en) 2006-02-17 2007-08-23 Agency For Science, Technology And Research Apparatus for regulating the temperature of a biological and/or chemical sample and method of using the same

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols", 1996, GREENE PUBLISHING ASSOCIATES, INC. AND JOHN WILEY & SONS, INC.
CHIEN CHAO-HENG ET AL.: "The design and fabrication of polymerase chain reaction platform", MICROSYST TECHNOL, vol. 13, 2007, pages 1523 - 1527, XP019518804 *
HIGGINS A. JAMES ET AL.: "A handheld real time thermal cycler for bacterial pathogen detection", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 18, 2003, pages 1115 - 1123, XP002316924 *
KRICKA L.J. ET AL.: "Microchip PCR", ANAL BIOANAL CHEM, vol. 377, 2003, pages 820 - 825, XP002447850 *
LEE DA-SHENG ET AL.: "Development of a CCD-based fluorimeter for real-time PCR machine", SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL, vol. 107, 2005, pages 872 - 881, XP004899926 *
MATSUBARA YASUTAKA ET AL.: "Application of a Microchamber Array for DNA Amplification Using a Novel Dispensing Method", ARCH. HISTOL. CYTOL., vol. 65, 2002, pages 481 - 488, XP008146857 *
MATSUBARA YASUTAKA ET AL.: "Microchamber array based DNA quantification and specific sequence detection from a single copy via PCR in nanoliter volumes", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 20, 2005, pages 1482 - 1490, XP027619503 *
MORRISON TOM ET AL.: "Nanoliter high throughput quantitative PCR", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 34, 2006, pages 1 - 9, XP009117685 *
See also references of EP2348123A4 *
SLYADNEV M.N. ET AL.: "A Detection Systemfor Microfluidic Chips Based on Epifluores cence Videomicroscopy and Its Analytical Potentials", JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 60, 2005, pages 317 - 324, XP019297876 *
ZHANG CHUNSUN ET AL.: "Miniaturized PCR chips for nucleic acid amplification and analysis: latest advances and future trends", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 35, 2007, pages 4223 - 4237, XP002542373 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2348123A1 (en) 2011-07-27
ES2623605T3 (es) 2017-07-11
US9631229B2 (en) 2017-04-25
UA101848C2 (ru) 2013-05-13
CA2739886C (en) 2016-11-29
US20110189683A1 (en) 2011-08-04
RU2385940C1 (ru) 2010-04-10
CN102203272A (zh) 2011-09-28
CA2739886A1 (en) 2010-04-29
EA201100576A1 (ru) 2011-10-31
EA018889B1 (ru) 2013-11-29
EP2348123B1 (en) 2017-02-01
EP2348123A4 (en) 2012-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2385940C1 (ru) Способ определения нуклеиновых кислот методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени и устройство для его осуществления
US9170060B2 (en) Rapid microfluidic thermal cycler for nucleic acid amplification
JP2019198328A (ja) 自動インキュベーションのためのシステム、方法、および装置
US20140179566A1 (en) Thermal Cycling Apparatus and Method
CA2565679A1 (en) Device and method for detecting molecular interactions
US9957559B2 (en) Solid gel amplification method and apparatus for platform molecular diagnostics
EP2443256A1 (en) Nucleic acid detection
EP2732053A2 (en) Systems, apparatus and methods for biochemical analysis
KR101456646B1 (ko) 식중독균 검출용 키트 및 이를 이용한 식중독균 검출 방법
JP2005204592A (ja) 全自動遺伝子解析システム
US20130078616A1 (en) Method and system for amplification of nucleic acids in microfluidic volume hydrogels
CN111560310B (zh) 一种随机访问式数字核酸检测装置及使用方法
KR102028381B1 (ko) 식중독 검출용 프라이머 세트를 이용한 pcr 장치, 및 이를 이용한 식중독 검출 방법
EP3899401A1 (en) Method and system for heating and temperature measurement using patterned thin films

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980141842.6

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09822256

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13122484

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2739886

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201100576

Country of ref document: EA

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2009822256

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009822256

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3775/DELNP/2011

Country of ref document: IN