ES2623605T3 - Método para determinar ácidos nucleicos por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y un dispositivo para su implementación - Google Patents
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Abstract
El método de identificación de ácidos nucleicos por una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real incluyendo - introducción de muestras líquidas conteniendo ácido nucleico a zonas de reacción (1) sobre la superficie superior de un sustrato termoconductor (3) de un microchip (10); - aislamiento de las muestras introducidas (2) de la atmósfera; - contacto del ácido nucleico de la muestra (2) con componentes de la reacción en cadena de la polimerasa durante el ciclo térmico de las muestras (2) con extracción de calor a través de la superficie exterior del microchip (10); - detección fluorescente del cambio de la cantidad de los productos de reacción en cadena de la polimerasa durante el ciclo térmico; - identificación de la cantidad del ácido nucleico inicial en las muestras (2) por la dinámica de crecimiento de la señal fluorescente, caracterizado porque el microchip (10) se usa con el sustrato termoconductor (3) con el coeficiente de conductividad térmica superior a 1 W/cm·K y con el coeficiente de difusividad térmica superior a 0,6 cm2/s, donde las dimensiones de la zona de reacción se eligen desde el rango de 101-104 μm en longitud y anchura y 101- 103 um en profundidad, preferiblemente, 5 x 102-5 x 103 μm en longitud y anchura, y 2x102-5x102 μm en profundidad, donde las zonas de reacción (1) sobre la superficie del microchip (10) están separadas del sustrato termoconductor (3) por una capa de un material pasivante (4) que está unido de forma covalente a la superficie del sustrato termoconductor (3) mientras que las muestras introducidas (2) están aisladas separándolas de la atmósfera por una capa de líquido (5) inmiscible con agua que se retiene sobre la superficie superior del sustrato termoconductor (3) por medio de una barrera periférica (6), no excediendo de 0,04 s la relación de la masa térmica agregada del microchip (10) con muestras introducidas (2) y la capa del líquido (5) inmiscible con agua a la conductancia térmica del sustrato de microchip (3), donde un material del sustrato termoconductor (3) es aluminio.
Description
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DESCRIPCION
Metodo para determinar acidos nucleicos por reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real y un dispositivo para su implementacion
Campo de la invencion
La invencion se refiere a biologfa molecular, medicina y biotecnolog^a y esta relacionada con la realizacion de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y un dispositivo para su implementacion con registro en tiempo real de la acumulacion de productos de reaccion (PCR en tiempo real, rt-PCR). El metodo y el dispositivo propuestos pueden usarse en medicina, veterinaria, procesado de alimentos, investigaciones medioambientales y en otros campos relacionados con la deteccion, la identificacion y la evaluacion cuantitativa de acidos nucleicos en las muestras objeto de investigacion.
La PCR representa multiples ciclos repetidos de smtesis de un fragmento espedfico de ADN (amplificacion) producido por cambios dclicos de la temperatura de la mezcla de reaccion y que dan lugar a un aumento exponencial de las cantidades del fragmento de ADN limitado por dos oligonucleotidos iniciadores. El cambio dclico de la temperatura de la mezcla de reaccion que los especialistas en el campo conocen como ciclo termico pasa por las etapas consecutivas siguientes: desnaturalizacion de la molecula de ADN deseada de doble cadena (fusion), union de oligonucleotidos iniciadores a lugares complementarios de las moleculas de ADN deseada de cadena simple formadas (recocido) y elongacion de los iniciadores con la participacion de la polimerasa termoestable hasta que se forman fragmentos alargados de moleculas de ADN complementarias (elongacion). Las condiciones de realizacion de las etapas son conocidas por los especialistas en este campo.
La PCR se usa para amplificacion de acidos nucleicos y permite la deteccion y la identificacion de la presencia y cantidad de acido nucleico con la secuencia de nucleotidos deseada en la muestra de ADN/ARN.
El experimento PCR implica la preparacion de una mezcla de reaccion en una solucion tampon que contiene en general polimerasa termoestable, desoxinucleotido trifosfatos, oligonucleotidos iniciadores, y iones magnesio. La muestra de ADN bajo investigacion se anade a la mezcla para amplificacion adicional con posterior registro de las secuencias de nucleotidos amplificadas (amplicones).
Para registro en tiempo real de los resultados de reaccion, la reaccion se realiza usando un termociclador equipado con un detector fluorescente en presencia de colorantes de intercalacion fluorescentes o iniciadores o sondas etiquetados con fluorescencia.
Terminos y definiciones:
La masa termica del objeto (J/K) igual a la capacidad termica del material del que se hace y multiplicada por su masa caracteriza la capacidad del objeto bajo investigacion de cambiar su temperatura al suministro o a la extraccion de energfa calonfica. La masa termica plena de un objeto compuesto conteniendo varias partes hechas de materiales diferentes es igual a la suma de las masas termicas de todas sus partes.
El coeficiente de conductividad termica del material (W/m*K) caracteriza la capacidad del material de conducir energfa calonfica.
La conductancia termica del objeto (W/K) igual al producto del coeficiente de conductividad termica del material del que se hace y el area de la superficie de intercambio termico dividida por el grosor del material caracteriza la capacidad del objeto de conducir energfa calonfica a traves de la superficie de intercambio termico.
El coeficiente de difusividad termica (m2/s) igual a la relacion de la conductividad termica del material al producto de su capacidad termica por su densidad caracteriza la capacidad del material para intercambio termico con el medio circundante con relacion al proceso de acumulacion de calor en el material propiamente dicho.
Las caractensticas siguientes son verdaderas para un sistema conteniendo dos objetos: el primer objeto que se calienta o enfna y el segundo objeto a traves del que se intercambia el calor. La relacion de la masa termica del primer objeto a la conductancia termica del segundo objeto expresada en segundos caracteriza la capacidad del sistema para el suministro rapido de calor al primer objeto a traves del segundo y la extraccion de calor del primer objeto a traves del segundo.
Estado de la tecnica
Los metodos PCR existentes que usan equipo comercialmente disponible se basan en general en la utilizacion de tubos de polfmero que se instalan en bloques metalicos de calentamiento. La alta masa termica de los bloques de calentamiento estandar con tubos instalados en ellos y las muestras, la baja conductividad termica de las paredes de los tubos restringen las tasas de calentamiento y enfriamiento de la muestra y puede dar lugar a no uniformidad a
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temperatura a traves de la muestra en el tubo.
Al usar dispositivos de laboratorio ordinarios previstos para PCR en tubos de polfmero o placas, el tiempo recomendado de mantenimiento de la temperatura durante el ciclo termico es 2 minutos o mas. Ausubel y colaboradores, eds. (1996) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. Y John Wiley & Sons, Inc., por ejemplo, recomiendan usar una duracion de cinco minutos por ciclo excluyendo el tiempo para transiciones de temperatura. Como resultado, el analisis PCR que consta de 40 ciclos termicos tardana 3 horas o mas en completarse usando equipo PCR tfpico con un volumen de muestra de 20-50 pl.
Con el fin de disminuir el tiempo empleado en un ciclo, se han propuesto recientemente muchos metodos de analisis PCR en recipientes de reaccion en miniatura. Para aumentar el tiempo requerido para la transicion de temperatura, la masa del elemento de calentamiento, la masa de los recipientes y el volumen de las muestras en tales dispositivos se han reducido considerablemente, lo que ha permitido la reduccion de la masa termica, el uso de materiales con altos coeficientes de conductividad termica y una relacion mas alta del area superficial de la muestra a su volumen. Tambien se usan metodos de suministrar calor sin contacto a la muestra para calentamiento. Por ejemplo, RapidCycler (Idaho Technologies Inc., Estados Unidos de America) permite un cambio relativamente rapido de la temperatura de la mezcla PCR durante la transicion de temperatura y asegura una transferencia de calor relativamente efectiva del calentador a las muestras. En este dispositivo, se puede completar 30 ciclos de rt-PCR en 10 minutos.
Tambien hay metodos implementados en dispositivos microflmdicos que permiten reducir el tiempo requerido para un ciclo. Kopp y colaboradores (1998) Science, 280:1046, por ejemplo, describe un dispositivo donde la mezcla PCR fluye sucesivamente a traves de un microcanal en forma de un meandro en el chip microflmdico a traves de tres zonas de temperatura, lo que da lugar a un cambio dclico de la temperatura PCR durante 20 ciclos termicos. Dado que la seccion transversal del microcanal es relativamente pequena, la temperatura de la solucion dentro del microcanal se establece de forma bastante rapida. El tiempo durante el que la mezcla esta a una cierta temperatura se regula en este caso por la tasa de flujo. Los autores demostraron la posibilidad de PCR en el dispositivo descrito con un tiempo de ciclo de 6,6 segundos.
Asf, la aplicacion de tecnologfas de microchip permite una disminucion significativa del tiempo de ciclo PCR, lo que da lugar a una disminucion del tiempo total de analisis PCR y a una mayor produccion.
Sin embargo, la implementacion de rt-PCR en tales dispositivos microflmdicos se enfrenta a algunas dificultades.
La relacion mas alta del area superficial entre el microrreactor y la muestra al volumen da lugar a una disminucion de la actividad de polimerasa e incluso a la inactivacion irreversible de la enzima. Las superficies de materiales como silicio, metales, cuarzo y vidrio muestran una sorcion irreversible de ADN y enzima, asf como otros componentes de la reaccion. Para eliminar las restricciones hay que anadir sustancias que eviten la sorcion y la desactivacion de componentes PCR, tal como aminoacidos, peptidos y surfactantes, a la mezcla de reaccion [Patente de Estados Unidos 6.660.517 “Mesoscale polinucleotide amplification devices”]. La misma patente tambien presenta algunos metodos que permiten la pasivacion de la superficie del microrreactor PCR. Tales capas de proteccion evitan la adsorcion y la inhibicion de componentes PCR, lo que permite lograr alta sensibilidad del analisis PCR.
Uno de los problemas conocidos por los especialistas en analisis PCR es la evaporacion de la muestra durante la fase de ciclo termico. Dado que la temperatura de desnaturalizacion de ADN esta proxima al punto de ebullicion del agua, la intensiva evaporacion de la mezcla PCR durante la reaccion puede inhibir el flujo PCR, que se elimina en general en los dispositivos estandar aislando la superficie de agua de mezcla de la atmosfera por medio de un lfquido inmiscible con agua, por aceite mineral, por ejemplo, o usando una tapa calentada para sellar los recipientes de reaccion.
En los canales cerrados de los chips microflmdicos, los microrreactores pueden estar sellados con valvulas en el microcanal [Patente de Estados Unidos 7.118.910 “Microfluidic device and methods of using the same”]. La implementacion de este metodo de sellado es tecnicamente complicada y aumenta el costo del analisis usando tal microchip.
La prevencion de la evaporacion durante el ciclo termico con microchips conteniendo microrreactores de cavidad abierta se logra en general mediante el aislamiento de la mezcla de reaccion de la atmosfera por aplicacion de un lfquido inmiscible con agua sobre la superficie de la solucion acuosa de la mezcla de reaccion, aceite mineral o de silicona, por ejemplo [Patente de Estados Unidos 6.664.044 “Method for conducting PCR protected from evaporation”]. Sin embargo, en el dispositivo descrito, se usa repetidas veces un sistema de inyeccion para inyectar PCR de trabajo y muestras, lo que puede dar lugar a degradacion no controlada de los reactivos PCR y a la contaminacion interna de las muestras en el proceso de aplicacion. Otro metodo y dispositivo [Solicitud de Patente de Estados Unidos 20070196237 “Apparatus for regulating the temperature of a biological and/or chemical sample and method of using the same”] usa un microchip con volumenes de reaccion sobre la superficie de sustrato que son una gotita de un lfquido inmiscible con agua, con la mezcla PCR colocada en el. Sin embargo, en este metodo, la mezcla de reaccion esta separada de la superficie calentada de sustrato por una capa del lfquido inmiscible con
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agua, lo que ralentiza el proceso de calentamiento y enfriamiento. Ademas, los volumenes de reaccion en este metodo pueden moverse de forma no controlable, dado que toda la superficie del sustrato termoconductor es hidrofoba. Puede dar lugar a discordancia espacial de la zona calentada y la muestra calentada en el proceso de la introduccion y el ciclo termico de la muestra, lo que dara lugar a resultados poco fiables del analisis PCR.
Otro inconveniente comun de los dispositivos microflmdicos conocidos es la mayor intensidad de personal al mezclar las muestras con los componentes de mezcla PCR antes de la introduccion al microchip. Ademas, este procedimiento requiere costos para consumibles adicionales (puntas de plastico, tubos) y es practicamente irrealizable en los tubos usuales, siendo el volumen de los lfquidos manejados de menos de un microlitro debido a la mayor probabilidad de evaporacion de los reactivos y las muestras durante la mezcla. Hay metodos que permiten la inmovilizacion de uno o varios componentes de la mezcla de reaccion necesarios para que la PCR en el microrreactor llene el microrreactor con una solucion acuosa conteniendo acidos nucleicos y los componentes restantes de la mezcla PCR [Patente de Estados Unidos 7.118.910 “Microfluidic device and methods of using the same”]. Sin embargo, este metodo requiere mucho personal y es diffcil de controlar durante la produccion puesto que requiere la aplicacion de reactivos biologicos directamente en el proceso de fabricacion del microchip, lo que incrementa el peligro del impacto negativo de posteriores procesos tecnologicos en los reactivos aplicados (impacto de mayor temperatura, compuestos qmmicos, emision).
Hay metodos que implican la liofilizacion de la mezcla PCR preparada conteniendo todos o casi todos los reactivos PCR y estabilizadores adicionales en los tubos [Patente RF 2259401 “Dry mixture of reagents for polymerase chain reaction and method of PCR analysis”, Patente de Estados Unidos 6.153.412 “Lyophilized reagent for polymerase chain reaction”]. Este metodo puede implementarse practicamente en cualquier sistema de microrreactor con reactores abiertos.
El documento de Zhang C y colaboradores., “Miniaturized PCR chips for nucleic acid amplification and analysis: latest advances and future trends”, Nucleic Acid Research, vol. 35, N° 13, Enero, 2007, paginas 4223-4237, resume la investigacion sobre sustratos de chip, tratamientos superficiales, volumen y velocidad de reaccion PCR, arquitectura, metodos para eliminar la contaminacion cruzada y el control y la medicion de temperatura y el flujo de lfquido. Tambien se discuten metodos de deteccion de producto, integracion de componentes funcionales, muestras biologicas usadas en chips PCR, aplicaciones potenciales y otras cuestiones practicas relacionadas con la implementacion de tecnologfas de laboratorio en chip.
A pesar del gran numero de metodos y dispositivos disponibles de implementacion de rt-PCR en formatos microflmdicos y de microchip, todavfa es grande la necesidad de desarrollar metodos y dispositivos nuevos y mejorados. Este campo tecnico necesita un metodo de costo razonable de expresar la identificacion cuantitativa de acidos nucleicos de una variedad de muestras con alta sensibilidad sin grandes costos de personal en la preparacion del analisis y tambien necesita un dispositivo para su implementacion.
Puede afirmarse que el analogo mas proximo a la presente invencion es el metodo y el dispositivo descrito en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 20070196237 “Apparatus for regulating the temperature of a biological and/or chemical sample and method of using the same”. La solicitud describe el metodo de realizar reacciones bioqmmicas, incluyendo rt-PCR, conteniendo etapas de ciclo termico y deteccion fluorescente de senales usando un modulo de termorregulacion incluyendo un calentador y detector de temperatura. Un sustrato de un material termoconductor esta colocado en el modulo y se aplica una muestra biologica sobre el sustrato, por ejemplo, una mezcla conteniendo todos los componentes para analisis PCR en tiempo real que se afsla de la atmosfera introduciendola en una celula de reaccion virtual formada por un lfquido inmiscible con agua, por aceite mineral, por ejemplo.
Los principales inconvenientes del prototipo son las bajas tasas reales de calentamiento y enfriamiento de la muestra; la complejidad tecnologica del modulo de termorregulacion con microcalentadores y termosensores integrados, que da lugar a costos mas altos y reduce el atractivo comercial del dispositivo. Otro inconveniente del prototipo analogo es la reduccion de sensibilidad no controlada en el posible contacto de la muestra con la superficie del material termoconductor. Ademas, el metodo y el dispositivo descritos en la descripcion del prototipo analogo requieren la preparacion preliminar de las soluciones de componentes PCR, la mezcla de componentes PCR con la muestra y la introduccion de la mezcla resultante en zonas de reaccion, lo que da lugar a costos de personal adicionales, un riesgo mas alto de errores del operador y costos de analisis mas altos debidos a la creciente cantidad de consumibles (tubos, puntas para la unidad de dosificacion, reactivos). Otro inconveniente del prototipo analogo es la posibilidad de discordancia espacial de la zona calentada y la muestra calentada en el proceso de la introduccion de la muestra y el ciclo termico, que dara lugar a resultados poco fiables del analisis PCR.
Esencia de la invencion
El objetivo de la presente invencion es el desarrollo del metodo y dispositivo para su implementacion que permitiran:
1. Reducir el tiempo del analisis y aumentar la produccion del analisis;
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2. Aumentar la sensibilidad, la exactitud y la fiabilidad del analisis;
3. Reducir los costos de personal de la identificacion de acidos nucleicos por el metodo rt-PCR;
4. Reducir el costo del analisis PCR.
Este objetivo se logra usando el metodo de identificacion de acidos nucleicos por medio de una reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real y un dispositivo para analisis rt-PCR conteniendo un microchip, como se describe en las reivindicaciones anexas.
El metodo propuesto implica la identificacion de acidos nucleicos por medio de una reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real incluyendo las etapas siguientes:
introduccion de muestras lfquidas conteniendo acido nucleico a las zonas de reaccion sobre la superficie superior del sustrato termoconductor y el aislamiento de las muestras introducidas con respecto a la atmosfera;
interaccion del acido nucleico de la muestra con los componentes de la reaccion en cadena de la polimerasa durante el ciclo termico de las muestras con extraccion de calor a traves de la superficie externa del microchip;
identificacion fluorescente del cambio de la cantidad de los productos de reaccion en cadena de la polimerasa en el proceso de ciclo termico;
identificacion de la cantidad del acido nucleico inicial en las muestras por la dinamica de crecimiento de la senal fluorescente.
El microchip se fabrica con un sustrato termoconductor hecho de un material termoconductor con el coeficiente de conductividad termica superior a 1 W/cmK y con un coeficiente de difusividad termica superior a 0,6 cm2/s. Las zonas de reaccion sobre la superficie del microchip estan separadas del sustrato termoconductor por una capa de un material pasivante unido de forma covalente a la superficie del material termoconductor. Las muestras introducidas estan aisladas de la atmosfera por una capa de lfquido que se retiene en la superficie superior del sustrato termoconductor por medio de un bastidor; la relacion de la masa termica agregada del microchip con las muestras introducidas y la capa de un lfquido inmiscible con agua a la conductancia termica del sustrato de microchip no excede de 0,04 s.
El dispositivo para implementacion de este metodo contiene un microchip con al menos una zona de reaccion en su superficie que esta unida de forma mecanica con el soporte de microchip, unida termicamente con el bloque de ciclo termico y unida de forma optica con el detector fluorescente de emision; el dispositivo tambien contiene al menos una fuente de emision de luz unida de forma optica con el bloque de filtracion de la emision del canal de iluminacion y con el microchip; este detector de emision fluorescente esta unido de forma optica con el microchip mediante el bloque de filtracion del canal de emision mientras que este bloque de ciclo termico se realiza con la posibilidad de calentar, enfriar y mantener la temperatura del microchip; ademas, el dispositivo contiene un sistema de control unido electricamente con el detector identificado, la fuente de emision y el bloque de ciclo termico.
En tal caso, el microchip contiene un sustrato termoconductor fabricado de un material con un coeficiente de conductividad termica superior a 1 W/cm K y un coeficiente de difusividad termica superior a 0,6 cm2/s; cada zona de reaccion en la superficie del microchip esta separada del sustrato termoconductor por una capa de un material pasivante unida de forma covalente con la superficie del sustrato termoconductor; en la superficie superior de este microchip hay un bastidor con la posibilidad de retener la cantidad asignada del lfquido inmiscible con agua en la superficie superior del microchip; la relacion de la masa termica agregada del microchip con las muestras introducidas y la capa del lfquido inmiscible con agua a la conductancia termica del sustrato de microchip no excede de 0,04 s.
Las caractensticas agregadas de la invencion propuesta debidas a:
1) una tasa incrementada de ciclo termico;
2) eliminacion de inhibicion de la reaccion por medio de una capa de proteccion de la superficie de las zonas de reaccion;
3) eliminacion de desplazamiento no controlado de la muestra con relacion a la zona de reaccion;
4) creacion de un microchip conteniendo reactivos PCR secados necesarios para la identificacion de los acidos nucleicos asignados;
5) reducido consumo de reactivos y consumibles y menor intensidad de personal del analisis,
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permiten cumplir la tarea establecida. La invencion propuesta usa un microchip, su sustrato fabricado a partir de materiales con conductividad termica y difusion termica; la superficie de las zonas de reaccion en la superficie superior del microchip esta cubierta con una capa pasivante, la evaporacion de la mezcla PCR se evita por medio de una capa de lfquido aislante y el microchip tambien puede contener uno o varios componentes de mezcla PCR en las zonas de reaccion.
Hay varios posibles esquemas de implementacion del metodo descrito en la presente invencion.
Hay varias variantes de interaccion del acido nucleico de la muestra con componentes PCR. Por ejemplo, antes del analisis, la muestra conteniendo acido nucleico se mezcla con uno o varios componentes de la mezcla PCR. Tambien es posible mezclar la muestra con la solucion conteniendo todos los componentes necesarios para realizar el analisis PCR. Tambien es posible mezclar la muestra con la solucion tampon conteniendo un componente, por ejemplo, iones magnesio Mg + o varios componentes, por ejemplo, iones magnesio Mg2+ y polimerasa, o iones magnesio Mg2+, oligonucleotidos iniciadores, y sondas de fluorescencia. En tales casos, la adicion de los componentes restantes para el analisis PCR puede realizarse por la introduccion de soluciones conteniendo estos componentes antes o despues de la introduccion de las muestras por cualquier metodo conocido, se prefiere que los componentes PCR restantes sean introducidos a las zonas de reaccion antes de la introduccion de la muestra.
Es aun mas ventajoso que los componentes PCR sean introducidos a las zonas de reaccion en forma secada antes de la introduccion de las muestras. Para lograrlo, puede colocarse uno o mas componentes PCR en forma de una solucion acuosa en las zonas de reaccion en la superficie del microchip en la capa del material pasivante y la solucion debera secarse. Este metodo supone que los componentes pCr, tal como desoxinucleotido trifosfatos, oligonucleotidos iniciadores directos e inversos, sondas con etiquetas fluorescentes deberan introducirse en las zonas de reaccion y secarse. Es aun mas preferible introducir a las zonas de reaccion y secar desoxinucleotido trifosfatos, oligonucleotidos iniciadores directos e inversos, sondas con etiquetas fluorescentes, polimerasa termoestable, y estabilizadores. Los estabilizadores para esta finalidad pueden elegirse a partir de polisacaridos, tal como manitol, glucosa o sacarosa.
El metodo sugiere que la identificacion fluorescente del cambio de la cantidad de los productos de reaccion en cadena de la polimerasa en las muestras bajo ciclo termico puede realizarse exponiendo las muestras a emision con un rango seleccionado de longitudes de onda y por el registro de la senal de fluorescencia en el rango seleccionado de longitudes de onda. La emision de fluorescencia debera realizarse preferiblemente en el rango de 350-700 nm, y el registro en el rango de 450-1000 nm.
Entonces, el metodo preve que el microchip pueda fabricarse a partir de varios materiales, preferiblemente con altos coeficientes de conductividad termica (superiores a 1 W/cm K) y difusividad termica (superior a 0,6 cm2/s). Tales materiales pueden incluir metales, tales como aluminio, cobre, o dielectricos, tales como silicio o ceramica. El aluminio y el silicio pueden considerarse los mas adecuados. Para asegurar una pequena masa termica del microchip, su tamano y masa deberan ser pequenos. El grosor del sustrato debera ser preferiblemente inferior a 1 mm para asegurar alta conductividad termica.
El metodo preve que la capa del material pasivante se haga de sustancias que eviten la adsorcion irreversible de los componentes PCR y la inhibicion de reaccion. La capa debera aplicarse preferiblemente sobre la superficie por union covalente con el material del sustrato termoconductor del microchip para aumentar las propiedades resistivas de la capa pasivante en almacenamiento prolongado y al ciclo termico durante la reaccion. Las sustancias que pueden usarse para esta finalidad pueden ser oxido de aluminio, oxido de silicio, y moleculas organicas capaces de formar monocapas o pelfculas polimericas. Las moleculas organicas pueden ser polidimetilsiloxano, polimetilmetoxisiloxano, 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano, y etilenglicol diglicidil eter.
Es aun mas preferible que la capa pasivante en las zonas de reaccion posea propiedades hidrofilas para garantizar buena difusibilidad de la solucion durante la introduccion de la mezcla PCR en la zona de reaccion. Al mismo tiempo, es preferible que la capa del material pasivante fuera de las zonas de reaccion sea hidrofoba para evitar el derrame de la solucion acuosa mas alla de los bordes de la zona de reaccion.
La variante mas preferible es cuando el material pasivante en las zonas de reaccion se forme como resultado de la reaccion de una capa de 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano y etilenglicol diglicidil eter.
Tambien es preferible que los materiales pasivantes fuera del area de las zonas de reaccion se formen a partir de la capa de polfmero de polimetilmetoxisiloxano.
El aislamiento de las muestras con respecto al aire en las zonas de reaccion puede lograrse aplicando una capa de un lfquido aislante en las zonas de reaccion. El lfquido aislante debera ser preferiblemente lfquidos inmiscibles con agua con una densidad menor que el agua, y con el punto de ebullicion superior a 100°C a presion atmosferica. Los lfquidos aislantes deberan ser aceites minerales, fluidos de silicio de varias viscosidades y sus mezclas. El metodo preve que el lfquido aislante sea transparente en los rangos espectrales de emision y registro de la excitacion de fluorescencia y el registro de colorantes fluorescentes usados para la deteccion de los productos rt-PCR. Es
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preferible que la transmitancia optica del Ifquido aislante en este rango espectral no sea inferior a 10%. Es aun mas preferible que la capa aislante en el rango del registro de colorantes luminiscentes cree una senal fluorescente no superior a 10% de la senal creada por las muestras en las zonas de reaccion.
El metodo preve que la capa del lfquido aislante pueda aplicarse tanto una vez (antes o despues de la introduccion de las muestras) como dos veces: primero se aplica la capa del lfquido aislante sobre las zonas de reaccion no llenadas, a continuacion se introducen las muestras lfquidas a traves de dicha capa del lfquido aislante y luego se anade el lfquido aislante.
Son posibles varias soluciones de construccion y disposicion del dispositivo de la presente invencion.
El microchip de silicio de al menos una zona de reaccion en su superficie puede fabricarse por fotolitograffa con posterior ataque qmmico anisotropico o isotropico lfquido que es conocido por los especialistas en el campo de los sistemas microelectromecanicos. El microchip de metal, ceramica o plastico puede fabricarse con tolerancia estrecha por forja, vaciado en caliente, extirpacion por laser, ataque qmmico isotropico lfquido, ataque qmmico con plasma que son conocidos por los especialistas en este campo. Las dimensiones de la zona de reaccion deberan elegirse a partir del rango de 101-104 pm en longitud y anchura y 101-103 pm en profundidad. Es preferible que las dimensiones de la zona de reaccion sean 5 x 102-5 x 103 pm en longitud y anchura, y 2 x 102-5 x 102 pm en profundidad.
Las dimensiones del microchip deberan elegirse de modo que la masa termica del microchip sea pequena, y el grosor del sustrato conductor termico debera ser mmimo asegurando suficiente estabilidad de la construccion.
Es deseable que la relacion de la masa termica del microchip con las muestras introducidas y la capa del lfquido inmiscible con agua a la conductividad termica del sustrato sea inferior a 0,04 s. Por ejemplo, estas condiciones las cumple un microchip con dimensiones de sustrato de longitud x anchura x altura (L x An x Al) de 28 x 25 x 0,6 mm, con 16 zonas de reaccion con la longitud x anchura x profundidad (L x An x Al) de 2 x 2 x 0,4 mm cada una, con una barrera periferica de poliacrilamida en forma de un bastidor rectangular de L x An x Al de 28 x 25 x 3 mm y la anchura de borde de 4 mm.
La barrera periferica se puede hacer de un elemento de construccion que pase por encima de la superficie superior del microchip y forme un bucle cerrado de modo que el lfquido aislante se contenga en este bucle en el proceso de la PCR. La barrera periferica se puede hacer del material del sustrato termoconductor del microchip. Es preferible que el material para la barrera periferica tenga un coeficiente de conductividad termica bajo y baja capacidad termica. La barrera periferica puede ser una capa del material con propiedades oleofobicas aplicadas en la superficie del microchip alrededor de las zonas de reaccion. Los materiales preferidos con propiedades oleofobicas son alquil silanos con cadenas de fluorohidrocarbonos saturadas. La barrera periferica puede fabricarse como una combinacion del elemento constructivo y una capa de material oleofobico. Es preferible que la capa periferica se fabrique con la posibilidad de aislar las zonas de reaccion de la atmosfera aplicando una pelfcula adhesiva sobre ella.
La capa pasivante sobre la superficie del microchip unida de forma covalente a la superficie del microchip puede obtenerse por reacciones qmmicas en la superficie del microchip. Estas reacciones pueden realizarse por la interaccion de los componentes procedentes de la fase gas con la superficie del microchip, por ejemplo en oxidacion termoqmmica de silicio con formacion de una capa de dioxido de silicio. Es preferible que estas reacciones se realicen durante el contacto entre componentes de fase lfquido y la superficie del microchip. El material pasivante debera depositarse preferiblemente por separado en la superficie del microchip en las zonas de reaccion y fuera de estas zonas. Es aun mas preferible aplicar una capa de polimetilmetoxisiloxano con propiedades hidrofobas sobre la superficie del microchip fuera de las zonas de reaccion por humectacion por contacto de las zonas con la solucion de polimetilmetoxisiloxano no polimerizado y posterior polimerizacion termica. En este caso, la capa del material pasivante en las zonas de reaccion puede aplicarse por sucesivas reacciones qmmicas en las zonas de reaccion, por ejemplo, por sucesiva incubacion de 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano lfquido y luego etilenglicol diglicidil eter ifquido en las zonas de reaccion.
Es preferible que la deposicion de uno o varios componentes de la reaccion en cadena de la polimerasa en las zonas de reaccion sobre la superficie del microchip se realice secando las soluciones acuosas de dichos componentes de la mezcla PCR. Las soluciones conteniendo los componentes necesarios deberan introducirse a las zonas de reaccion y secarse en una campana de seguridad laminar a temperatura ambiente. Es aun mas ventajoso secar estas soluciones usando una tecnica de liofilizacion, a baja temperatura (de -20°C a -50°C) y presion (de 0,01 a 10 mm Hg).
El detector de fluorescencia puede incluir un bloque de filtracion de emision usando filtros de luz de absorcion e interferencia asf como espejos dicroicos. La fuente de emision puede ser un diodo fotoemisor unido de forma optica con el bloque de filtracion de emision y el microchip por medio de elementos opticos, lentes y espejos, por ejemplo. Segun la invencion, para detectar varios componentes PCR en el mismo microrreactor en el dispositivo es posible utilizar un detector multicanal conteniendo varias fuentes de emision y varios filtros de filtracion de emision con la
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posibilidad de conmutacion entre las fuentes y el bloque de filtracion de emision. Este detector multicanal se puede construir usando varios diodos fotoemisores, filtros y espejos dicroicos, con diferentes caractensticas espectrales. Es preferible que las fuentes de emision y los bloques de filtracion de emision creen un flujo de luz en el rango espectral elegido de excitacion de fluorescencia en el rango de 350-700 nm y permitan el registro de la senal fluorescente en el rango espectral seleccionado de 450-1000 nm. Los rangos espectrales de excitacion de fluorescencia y registro deberan ser capaces de detectar colorantes fluorescente comunes en la practica de la deteccion PCR que son conocidos por los especialistas en este campo. Ejemplos de tales colorantes son: carboxifluorescema (FAM), 6-carboxi-2’,4,4’,5’,7,7’-hexafluorescema (HEX), 6-carboxirodamina (R6G), carboxi-X- rodamina (ROX), tetrametilcarboxirodamina (TAMRA), 6-carboxi-4’,5’-dicloro-2’,7’-dimetoxifluorescema (6-JOE), carboxirodamina (R110).
Un detector de fluorescencia puede ser un detector de matriz, un tubo fotomultiplicador o un fotodiodo. Segun la invencion, es preferible que el detector de radiacion en el dispositivo sea un detector de matriz, por ejemplo, una matriz CCD (CCD es un dispositivo de acoplamiento de carga) o una matriz CMOS (CMOS es Metal-Oxido- Semiconductor complementario). En este caso, es preferible que la imagen del microchip se forme en el detector de matriz por medio de elementos opticos, por ejemplo, por medio de una lente, espejo-lente u objetivo reflector. Es preferible que el detector de matriz permita el registro de la senal de fluorescencia en todo el rango espectral de 450-1000 nm.
El bloque de ciclo termico unido termicamente al microchip puede fabricarse con la posibilidad de calentar, enfriar y mantener la temperatura del microchip usando calefactores de resistencia, modulos termoelectricos semiconductores (dispositivos Peltier), calefactores inductivos usando transferencia de energfa en forma de emision, calefactores usando transferencia de energfa termica por medio de un flujo de lfquido o gas, incluyendo los que usan condensacion y evaporacion. Segun la invencion, es preferible que el bloque de ciclo termico en el dispositivo se fabrique usando el dispositivo Peltier puesto que en este caso hay calentamiento activo y enfriamiento activo del microchip.
Lista de las figuras
La presente invencion se ilustra con las figuras siguientes donde:
La figura 1 muestra el esquema del microchip para analisis PCR en tiempo real de acidos nucleicos.
La figura 2 muestra una variante del esquema para implementacion del metodo de analisis PCR en tiempo real de acidos nucleicos con componentes secados de la reaccion en cadena de la polimerasa.
La figura 3 muestra un ejemplo del esquema de diseno del analizador PCR de microchip.
La figura 4 muestra el resultado de identificacion de ADN por analisis PCR en tiempo real usando el dispositivo segun la invencion usando las condiciones de temperatura recomendadas por el fabricante de los reactivos.
La figura 5 muestra el resultado de identificacion de ADN por analisis PCR en tiempo real usando el dispositivo segun la invencion usando las condiciones de temperatura con duracion acortada de las etapas PCR.
Descripcion detallada de la invencion
Un ejemplo de realizacion de microchip para implementacion del metodo de analisis PCR en tiempo real de acidos nucleicos segun la presente invencion se representa en las figuras 1 y 2. La muestra 2 esta situada en la zona de reaccion 1 sobre la superficie superior del microchip. El microchip contiene un sustrato termoconductor 3 hecho de un material termoconductor con el coeficiente de conductividad termica superior a 1 W/cmK y el coeficiente de difusion termica superior a 0,6 cm2/s.
Segun la variante de la realizacion representada en la figura 1, la zona de reaccion 1 esta separada del sustrato termoconductor 3 por una capa de un material pasivante 4 unido de forma covalente a la superficie del material termoconductor.
En otra realizacion representada en la figura 2, la zona de reaccion 1 sobre la superficie del microchip esta separada del sustrato termoconductor 3 por una capa de un material pasivante 7 con propiedades hidrofilas que esta unido de forma covalente a la superficie del material termoconductor. Fuera de la zona de reaccion 1, la superficie del sustrato termoconductor 3 esta cubierta con una capa de un material pasivante 8 con propiedades hidrofobas que esta unido de forma covalente a la superficie del material termoconductor. En la capa del material pasivante 8 en la zona de reaccion 1 hay una capa 9 conteniendo uno o varios componentes secados de la reaccion en cadena de la polimerasa.
Segun las variantes de la realizacion representada en las figuras 1 y 2, la capa del lfquido aislante 5 separa la muestra introducida 2 de la atmosfera. La barrera periferica 6 retiene la capa del lfquido aislante 5 sobre la superficie
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superior del sustrato termoconductor 3. Para implementar el metodo segun la invencion, la muestra 2 conteniendo acido nucleico se introduce a la zona de reaccion 1 a traves de la capa del Kquido aislante 5. El calentamiento y el enfriamiento de la muestra 2 colocada en la zona de reaccion se llevan a cabo en el lado de la superficie inferior del sustrato termoconductor 3. La evaluacion fluorescente de la cantidad de productos de reaccion en cadena de la polimerasa en la muestra 2 colocada en la zona de reaccion 1 en el proceso de ciclo termico se realiza en el lado de la superficie superior del sustrato termoconductor 3 a traves de la capa del lfquido aislante 5.
Un ejemplo del diseno del dispositivo segun la presente invencion se representa en la figura 3. El dispositivo contiene al menos una zona de reaccion sobre la superficie del microchip 10 que esta unida de forma mecanica al soporte de microchip 11, unida termicamente al bloque de ciclo termico 12 y unida de forma optica al detector de fluorescencia 13. El dispositivo contiene al menos una fuente de emision 14 unida de forma optica al bloque de filtracion de la emision del canal de iluminacion 15, el espejo dicroico 16, la lente 17 y el microchip 10. El detector de fluorescencia 13 esta unido de forma optica al microchip 10 mediante la lente 17, el espejo dicroico 16 y el bloque de filtracion de emision del canal de registro 18. El bloque de ciclo termico 12 se fabrica con la posibilidad de calentar, enfriar y mantener la temperatura del microchip 10. El dispositivo tambien contiene el sistema de control 19 unido electricamente al detector de emision 13, al menos con una fuente de emision 14 y el bloque de ciclo termico 12. El sistema de control 19 se realiza con la posibilidad de conmutacion entre fuentes de emision 14 (si hay mas de una fuente) asf como con la posibilidad de cambiar el rango espectral del bloque (o bloques) de filtracion de emision.
El dispositivo opera de la forma siguiente. Se inserta el microchip 10 en el soporte de microchip 11. La superficie superior del microchip 10 se cubre con una capa del lfquido aislante 5 y se introduce la muestra 2 a traves de la zona de reaccion 1. El soporte de microchip 11 con el microchip equipado 10 se instala despues en el bloque de ciclo termico 12. La radiacion procedente de la fuente de radiacion 14 es dirigida al bloque de filtracion de la radiacion del canal de iluminacion 15, luego es reflejada por el espejo dicroico 16, llega a la lente 17 y a continuacion a la muestra 2 situada en la zona de reaccion del microchip 1 a traves de la capa del lfquido aislante 5. La radiacion fluorescente de la muestra a traves de la capa del lfquido aislante 5 es recogida por la lente 17 y dirigida a traves del espejo dicroico 16 y el bloque de filtracion de la radiacion del canal de registro 18 al detector de fluorescencia 13. El bloque de ciclo termico 12 unido termicamente al microchip 10 suministra y quita calor para calentar, enfriar y mantener la temperatura del microchip 10. Las altas tasas de calentamiento y enfriamiento se logran debido a la pequena masa termica agregada del microchip con muestras introducidas y la capa del lfquido inmiscible con agua (en el rango de 0,5 a 4 J/K) realizado con la posibilidad de usar el sustrato termoconductor con alta conductancia termica (en el rango de 100-500 W/K), que da lugar a una pequena relacion de la masa termica agregada del microchip a conductancia termica del sustrato del microchip (en el rango de 0,001-0,04 s). Las condiciones de temperatura del bloque de ciclo termico 12, la seleccion y activacion de la fuente de radiacion 14 asf como la recogida y el procesado de las senales del detector de fluorescencia 13 durante el ciclo termico de la muestra son controlados por un sistema de control 19 unido electricamente a los bloques 12, 13 y 14.
Informacion que confirma la posibilidad de implementacion de la invencion. La invencion se ilustra con los ejemplos siguientes.
La descripcion de estos ejemplos no debera ser usada para restringir las reivindicaciones de esta patente; ilustra simplemente la posibilidad de que los especialistas en este campo implementen la invencion.
Ejemplo 1
El microchip conteniendo 16 zonas de reaccion en su superficie se fabrico a partir de pastillas de silicio pulidas de 0,6 mm de grosor usando el metodo de fotolitrograffa con posterior ataque qmmico anisotropico en humedo. Las dimensiones del sustrato termoconductor eran 25 x 28 x 0,6 mm. Las zonas de reaccion estaban situadas sobre la superficie del microchip como una matriz de 4 x 4. Cada zona de reaccion tema la forma de tronco de piramide, con las dimensiones de la base superior de 2 x 2, la base inferior de 1,7 x 1,7 mm y la profundidad de 0,4 mm. Toda la zona del sustrato de silicio se cubrio con dioxido de silicio SiO2 por oxidacion termoqmmica. El sustrato de silicio cubierto con el dioxido de silicio se limpio en una mezcla de acido sulfurico concentrado y peroxido de hidrogeno (3:1) durante 20 minutos. Despues de un lavado profundo con agua semidesionizada y de secado, la superficie del sustrato de silicio fuera de las zonas de reaccion se trato con polimetilmetoxisiloxano “Penta-111” (Penta-North, Rusia). Despues de la polimerizacion en el tratamiento termico, la superficie de las zonas de reaccion se trato primero con 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (Sigma, Estados Unidos de America) durante 60 minutos y luego con etilenglicol diglicidil eter (Sigma, Estados Unidos de America) durante 60 minutos. Este sustrato se encolo despues a la barrera periferica de poliacrilato de 3 mm de grosor.
Segun los calculos, la masa termica total del microchip con las muestras de las zonas de reaccion y el lfquido aislante se estimo en 3,35 J/K. La conductancia termica del sustrato de silicio se estimo en 175 W/K. Al mismo tiempo, la relacion de la masa termica total del microchip a la conductividad termica del sustrato de microchip no excedfa de 0,02 s.
El microchip fue tratado por radiacion UV durante 5 minutos con posterior cobertura de la superficie superior de la barrera periferica con una pelfcula polimerica protectora para evitar la contaminacion de la superficie de las zonas de
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reaccion durante el almacenamiento y el manejo del microchip. De esta forma, el microchip podfa almacenarse a temperatura ambiente durante varios meses.
Segun la presente invencion, los diodos fotoemisores XL9030 (Cree, Estados Unidos de America) sirvieron como las fuentes de emision en el dispositivo, camara CCD MultiBlue (Perkin-Elmer Optoelectronics, Estados Unidos de America) como un detector, filtros de luz de interferencia XF-52 (Omega Optical, Estados Unidos de America)- en el bloque de filtracion de emision. El dispositivo Peltier (40W, Cryotherm, Rusia) se uso en el bloque de ciclo termico, y se utilizo un ordenador personal con software instalado como el sistema de control.
Se prepararon las soluciones siguientes para PCR en tiempo real:
1) Mezcla de amplificacion conteniendo:
80 mM Tris-HCl (pH=8,0), 0,1% Triton X-100, 5% glicerol (Sigma, Estados Unidos de America), 5 mM MgCh, 24 mM (NH4)2SO4, 0,5 mM EDTA, desoxinucleotido trifosfatos dATP, dTTP, dGTP, dCTP de 500 pM cada uno, OligoTaq DNA-polimerasa 0,1 U/d (Promega, Estados Unidos de America); oligonucleotidos iniciadores directos e inversos en la concentracion de 0,5 pM, sonda de oligonucleotido etiquetada con fluorescencia en la concentracion de 0,2 pM para deteccion de Escherichia coli, cepa C600, fragmento de gen 16S pRNA, agua desionizada esteril.
2) Solucion de muestra conteniendo 104 ADN de copias de Escherichia coli a 1 pl, cepa C600, en agua desionizada esteril (muestra K+). Se uso agua desionizada esteril (muestra K-) como la muestra no conteniendo ADN espedfico.
Las soluciones recien preparadas se mezclaron en la relacion de 1:1, mezclaron con una mezcladora de vibracion y pipeteado y luego se centrifugaron. La mezcla PCR de trabajo obtenida se utilizo para introduccion a las zonas de reaccion del microchip.
La capa aislante de cobertura compuesta de 100 pl de silicio lfquido PMS-200 (Penta-North, Rusia) se introdujo sobre la superficie superior del microchip limitada por la barrera periferica por medio de una micropipeta. El lfquido sirvio como el lfquido aislante. A traves de esta capa de aislamiento se introdujeron 2 pl de la mezcla PCR de trabajo por medio de una micropipeta. La mezcla se disperso facilmente a las zonas de reaccion, no se difundio sobre la superficie de sustrato evitando asf la contaminacion mutua debido a las propiedades de la superficie hidrofila en las zonas de reaccion y las propiedades hidrofobas de la superficie fuera de las zonas de reaccion.
El ciclo termico se realizo en las condiciones de temperatura recomendadas por el fabricante de los reactivos: activacion de polimerasa a 94°C durante 180 segundos (1 ciclo), desnaturalizacion de ADN a 94°C durante 20 segundos, recocido de iniciador a 58°C durante 40 segundos, elongacion de amplicones y captador de senal de fluorescencia a 72°C durante 20 segundos (45 ciclos).
El resultado del analisis rt-PCR se representa en la figura 4. Es tfpico de las curvas rt-PCR que en las etapas iniciales la intensidad de fluorescencia es pequena y practicamente no cambia. Este nivel de fluorescencia se denomina el nivel base. El indicador de la acumulacion del producto de reaccion es el denominado “ciclo umbral”, es decir, el ciclo en el que la intensidad de la fluorescencia empieza a superar el nivel base. La figura 4 muestra que las muestras conteniendo el ADN de interes exhiben un aumento de la senal de fluorescencia mientras que la fluorescencia de las muestras que no contienen este ADN permanece en el nivel base.
La comparacion del valor medio de los ciclos umbral (Ct) obtenido en las soluciones del ejemplo presente usando el dispositivo segun la invencion (Ct = 31,3) y los ciclos umbral obtenidos usando la instrumentacion comercialmente disponible SmartCycler II (Cepheid, Estados Unidos de America) con condiciones de ciclo termico completamente analogas (Ct = 31,0) muestra que las caractensticas analfticas del dispositivo segun la invencion y el equipo comercialmente disponible son comparables.
Al mismo tiempo, las tasas maximas de calentamiento y enfriamiento para el dispositivo segun la invencion eran 16,5 y 14,3°C/s, correspondientemente, que eran 4 y 8 veces mas altas, respectivamente, en comparacion con la instrumentacion comercialmente disponible, y 2 y 5 veces mas altas en comparacion con las muestras mas rapidas del equipo comercialmente disponible.
El tiempo empleado en el ejemplo presente para lograr el ciclo umbral usando el dispositivo segun la invencion fue 53,1 min.
Ejemplo 2
El microchip y el dispositivo segun la invencion eran similares a los descritos en el ejemplo 1.
Las soluciones preparadas para rt-PCR eran similares al ejemplo 1. La preparacion de la mezcla PCR de trabajo y su introduccion en las zonas de reaccion del microchip se realizaron de forma similar al ejemplo 1.
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El ciclo termico se realizo en las condiciones de temperatura con duracion reducida de las etapas de desnaturalizacion, recocido de iniciador y elongacion: activacion de polimerasa a 94°C durante 120 s (1 ciclo), desnaturalizacion de ADN a 94°C durante 3 s, recocido de iniciador a 58°C durante 3 s, elongacion de amplicones y captador de senal de fluorescencia a 72°C durante 8 s (45 ciclos).
El resultado del ejemplo se muestra en la figura 5. La figura representa que las muestras conteniendo el ADN bajo investigacion exhiben un aumento de las senales de fluorescencia mientras que las muestras que no contienen este tipo de ADN no muestran el aumento de la senal de fluorescencia. La comparacion entre los ciclos umbral (Ct) obtenidos usando el dispositivo segun la invencion con las condiciones de temperatura recomendadas por los fabricantes de los sistemas de prueba Ct = 31,3 y usando las condiciones de temperatura con duracion acortada de las etapas PCR Ct = 31,9 muestra que la efectividad de la reaccion PCR en las condiciones acortadas de temperatura cambia de forma insignificante.
El tiempo para llegar al ciclo umbral en el ejemplo presente fue solamente 18 min usando el dispositivo segun la invencion, que es 3 veces mas rapido en comparacion con el uso de uno de los analizadores PCR mas rapidos comercialmente disponible, Smart Cycler II (54,7 min).
Ejemplo 3
El microchip y el dispositivo segun la invencion eran similares a los descritos en el ejemplo 1.
Se prepararon las soluciones siguientes para la rt-PCR:
1) Mezcla de amplificacion conteniendo 80 mM Tris-HCl (pH=8,0), 0,1% Triton X-100, 24 mM (NH^SO4, 0,5 mM EDTA, desoxinucleotido trifosfatos dATP, dTTP, dGTP, dCTP de 500 pM cada uno, 0,16% D-glucosa, 1,6 % inulina, 8% D-manitol (Sigma, Estados Unidos de America), OligoTaq DNA-polimerasa 0,1 U/d (Promega, Estados Unidos de America); iniciadores directos e inversos en la concentracion de 0,5 pM, sonda de oligonucleotido etiquetada con fluorescencia en la concentracion de 0,2 pM para deteccion del ADN de Escherichia coli, cepa C600, fragmento de gen 16S pRNA, agua desionizada esteril.
2) Solucion de muestra conteniendo 104 ADN de copias de Escherichia coli en 1 pl, cepa C600, en agua desionizada esteril (muestra K+) o agua desionizada esteril (muestra K-) en la solucion conteniendo 5 mM MgCh, 10 mM Tris- HCl (pH=8,0), 0,1% Triton X-100, 5% glicerol (Sigma, Estados Unidos de America) y agua desionizada esteril.
Se introdujo 1 pl de mezcla de amplificacion preparada segun el punto 1 del ejemplo presente a cada una de las 16 zonas de reaccion del microchip. La mezcla se seco en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 2-3 horas hasta que se formo una capa densa firmemente retenida en las zonas de reaccion. La superficie superior de la barrera periferica se recubrio con una pelfcula polimerica protectora con una capa adhesiva que aislaba las zonas de reaccion de la atmosfera para evitar la contaminacion de la superficie de las zonas de reaccion durante el almacenamiento y el manejo del microchip. De esta forma, el microchip podfa almacenarse a temperatura ambiente durante varias semanas.
Para el analisis PCR, la solucion de la muestra segun el punto 2 del ejemplo presente se introdujo en las zonas de reaccion del microchip de forma similar al ejemplo 1.
El ciclo termico se realizo en las condiciones de temperatura recomendadas por el fabricante de los reactivos: activacion de polimerasa a 94°C durante 180 s (1 ciclo), desnaturalizacion de ADN a 94°C durante 20 s, recocido de iniciador a 58°C durante 40 s, elongacion de amplicones y captador de senal de fluorescencia a 72°C durante 20 s (45 ciclos).
Como resultado se obtuvieron curvas rt-PCR (datos no disponibles) que muestran que las muestras conteniendo el ADN deseado exhiben senal de fluorescencia incrementada mientras que en las muestras que no contienen el ADN deseado la senal de fluorescencia no aumenta. El experimento identifico que la cantidad de los consumibles, costos de personal y tiempo empleado en la realizacion de las operaciones preparatorias para la preparacion de la muestra y la introduccion de las mezclas obtenidas a las zonas de reaccion disminrna considerablemente con el uso del metodo y el dispositivo segun la presente invencion en comparacion con equipo convencional. Por ejemplo, la cantidad de reactivos PCR se redujo 12 veces, la cantidad de las puntas de dosfmetro disminuyo 6 veces, la cantidad de etapas de pipeteado disminuyo dos veces, el tiempo requerido para operaciones preparatorias se redujo 4 veces.
Puede afirmarse que las ventajas importantes de la presente invencion que dan lugar a la realizacion de la tarea establecida son:
1. Mayor tasa del ciclo termico de la muestra debido al uso de materiales con alta conductividad termica asf como debido al contacto de la muestra con la superficie de la zona de reaccion;
2. Eliminacion de inhibicion de PCR debido a la capa pasivante de la superficie de las zonas de reaccion, que incrementa la sensibilidad, la exactitud y la fiabilidad del analisis;
3. Reducida intensidad de personal y costo del analisis PCR debido al uso del microchip conteniendo reactivos PCR
5 secados.
Anteriormente se han presentado ejemplos preferidos de la implementacion de la invencion que no limitan la esencia ni los lfmites de la invencion, sino que solamente la ilustran. Los especialistas en este campo hallaran facilmente varias modificaciones y mejoras de la invencion propuesta que tambien caen dentro de su alcance reflejado en la 10 reivindicacion de la invencion.
Claims (18)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. El metodo de identificacion de acidos nucleicos por una reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real incluyendo- introduccion de muestras Kquidas conteniendo acido nucleico a zonas de reaccion (1) sobre la superficie superior de un sustrato termoconductor (3) de un microchip (10);- aislamiento de las muestras introducidas (2) de la atmosfera;- contacto del acido nucleico de la muestra (2) con componentes de la reaccion en cadena de la polimerasa durante el ciclo termico de las muestras (2) con extraccion de calor a traves de la superficie exterior del microchip (10);- deteccion fluorescente del cambio de la cantidad de los productos de reaccion en cadena de la polimerasa durante el ciclo termico;- identificacion de la cantidad del acido nucleico inicial en las muestras (2) por la dinamica de crecimiento de la senal fluorescente,caracterizado porqueel microchip (10) se usa con el sustrato termoconductor (3) con el coeficiente de conductividad termica superior a 1 W/cmK y con el coeficiente de difusividad termica superior a 0,6 cm2/s,donde las dimensiones de la zona de reaccion se eligen desde el rango de 101-104 urn en longitud y anchura y 1013 2 3 2 210 um en profundidad, preferiblemente, 5x10-5x10 um en longitud y anchura, y 2x10 -5x10 um en profundidad,donde las zonas de reaccion (1) sobre la superficie del microchip (10) estan separadas del sustrato termoconductor (3) por una capa de un material pasivante (4) que esta unido de forma covalente a la superficie del sustrato termoconductor (3) mientras que las muestras introducidas (2) estan aisladas separandolas de la atmosfera por una capa de lfquido (5) inmiscible con agua que se retiene sobre la superficie superior del sustrato termoconductor (3) por medio de una barrera periferica (6), no excediendo de 0,04 s la relacion de la masa termica agregada del microchip (10) con muestras introducidas (2) y la capa del lfquido (5) inmiscible con agua a la conductancia termica del sustrato de microchip (3), donde un material del sustrato termoconductor (3) es aluminio.
- 2. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la identificacion fluorescente del cambio de la cantidad de los productos de reaccion en cadena de la polimerasa en las muestras (2) durante el ciclo termico se realiza exponiendo las muestras (2) a radiacion con un rango espectral seleccionado de 350-700 nm y registro de la senal de fluorescencia en el rango espectral seleccionado de 450-1000 nm.
- 3. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el material pasivante (4) es oxido de silicio u oxido metalico o polimetilmetoxisiloxano o 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano con etilenglicol diglicidil eter.
- 4. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la introduccion de muestras lfquidas (2) a las zonas de reaccion (1) se lleva a cabo a traves de un lfquido (5) inmiscible con agua.
- 5. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el material pasivante sobre la superficie del microchip (10) en las zonas de reaccion (1) es un material hidrofilo (7) mientras que el material pasivante sobre la superficie del microchip (10) entre las zonas de reaccion (1) es un material hidrofobo (8).
- 6. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el material pasivante (7) sobre la superficie del microchip en las zonas de reaccion es 3-glicidoxi-propil-trimetoxisilano con etilenglicol diglicidil eter y el material pasivante (8) sobre la superficie del microchip entre las zonas de reaccion es polimetilmetoxisiloxano.
- 7. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque se utiliza una capa de un lfquido (5) inmiscible con agua, siendo al menos 10% la tasa de transmision en el rango espectral seleccionado de radiacion y en el rango espectral seleccionado de fluorescencia y no superando su senal de fluorescencia 10% de la senal creada por las muestras (2) colocadas en las zonas de reaccion (1).
- 8. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el lfquido (5) inmiscible con agua es un lfquido de polimetilmetoxisiloxano con una densidad inferior a la densidad de agua.
- 9. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque uno o varios componentes de la reaccion en cadena de la polimerasa en forma de una solucion acuosa es aplicado sobre la capa del material pasivante (4) sobre la superficie del microchip (10) en las zonas de reaccion (1) y la solucion se seca, por ejemplo, por medio de5101520253035404550liofilizacion.
- 10. El dispositivo para identificacion de acidos nucleicos por el metodo de reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real conteniendo un microchip (10) con al menos una zona de reaccion (1) en su superficie que esta unida de forma mecanica al soporte de microchip (11) y unida de forma optica al detector de fluorescencia (13) mediante el bloque de filtracion del canal de radiacion (18) incluyendo al menos una fuente de radiacion (14) unida de forma optica al bloque de filtracion de la radiacion del canal de iluminacion (15) y el microchip (10) asf como un sistema de control (19) unido electricamente al bloque de ciclo termico (12) que esta unido termicamente al microchip (10) y se fabrica con la posibilidad de calentar, enfriar y mantener la temperatura del microchip (10), caracterizado porque el microchip (10) contiene un sustrato termoconductor (3) unido termicamente al bloque de ciclo termico (12) y hecho de un material con el coeficiente de conductividad termica superior a 1 W/cmK y el coeficiente de difusividad termica superior a 0,6 cm2/s,donde las dimensiones de la zona de reaccion se elige desde el rango de 101-104 pm en longitud y anchura y 101103 pm en profundidad, preferiblemente, 5 x 102-5 x 103 pm en longitud y anchura, y 2x102-5x102 pm en profundidad, mientras que cada zona de reaccion (1) esta separada del sustrato termoconductor (3) por una capa del material pasivante (4) unido de forma covalente a la superficie del sustrato termoconductor (3), teniendo la superficie superior del microchip (10) una barrera periferica (6) con la posibilidad de retener la cantidad asignada del lfquido (5) inmiscible con agua sobre la superficie superior del microchip (10) y no superando 0,04 s la relacion de la masa termica agregada del microchip (10) con las muestras introducidas (2) y la capa del lfquido (5) inmiscible con agua a la conductancia termica del sustrato de microchip (3), donde un material del sustrato termoconductor (3) es aluminio.
- 11. El dispositivo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque la fuente de radiacion (14) es al menos un diodo fotoemisor o una matriz de diodos fotoemisores.
- 12. El dispositivo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque el sistema de control (19) se realiza con la posibilidad de conmutar fuentes de radiacion (14) entre sf y con la posibilidad de cambiar el rango espectral del bloque (o bloques) de filtracion de radiacion (15, 18).
- 13. El dispositivo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque el detector de fluorescencia (13) es un detector de matriz o un multiplicador de fotoelectrones, o un fotodiodo.
- 14. El dispositivo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque el bloque de ciclo termico (12) incluye el dispositivo Peltier.
- 15. El dispositivo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque el microchip (10) se realiza de modo que la superficie del microchip (10) en las zonas de reaccion (1) se cubra con una capa de un material pasivante hidrofilo (7) y la superficie del microchip (10) entre las zonas de reaccion (1) se cubra con un material pasivante hidrofobo (8).
- 16. El dispositivo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque el microchip (10) se realiza de modo que las zonas de reaccion (1) sobre la superficie del microchip (10) sobre la capa del material pasivante (4, 7) contengan uno o varios componentes secados de la reaccion en cadena de la polimerasa.
- 17. El dispositivo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque la barrera periferica (6) se realiza con la posibilidad de aislamiento de las zonas de reaccion (1) de la atmosfera por medio de una pelfcula adhesiva.
- 18. El dispositivo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque el sistema de control (19) se realiza con la posibilidad de conmutacion automatica de las fuentes de radiacion (14) y los bloques de filtracion de radiacion de luz (15) y recogida (18) de senales del detector de radiacion (13) sincronizado con estos conmutadores.
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