CN113106161B - 一种用于全集成微流控芯片的str快速个体识别扩增试剂及其应用 - Google Patents

一种用于全集成微流控芯片的str快速个体识别扩增试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于全集成微流控芯片的STR快速个体识别扩增试剂及其应用。本发明基于国内首台自主研发的全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq构建了一套包含20个CODIS STR基因座和1个Amelogenin性别基因座的微流控芯片快速扩增试剂—RTyper 21，并采用冻干方式构建了RTyper21芯片冻干扩增试剂。通过实验证明：该RTyper21芯片冻干扩增试剂可以在微流控芯片卡盒中长期储存，可对口腔拭子、血卡、唾液卡样本进行检测，并在2个小时内完成样本裂解、PCR扩增、电泳分离全部流程，满足了公安实战现场、快速检测的迫切需要。

Description

一种用于全集成微流控芯片的STR快速个体识别扩增试剂及 其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于全集成微流控芯片的STR快速个体识别扩增试剂及其应用。
背景技术
利用PCR-STR分型技术能够对犯罪现场生物物证进行个体识别，从而认定或者排除嫌疑人。常规STR分型过程包括DNA提取、PCR扩增、电泳分离和分型图谱分析。整个检测过程大致需要6～8小时，耗时长、步骤多、操作复杂，对操作人员专业技能要求较高，也容易出现样本污染风险。目前一些重大、突发性案件常常需要短时间获得检验结果，以为案件侦查提供方向。常规DNA分型检验方法已无法满足公安实战需求，亟需向着现场快速、集成便捷的方向实现革新。
微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。与传统分析方法相比，具有体积小、样品和试剂消耗少、易于实现操作流程自动化和全集成等诸多优势。目前，许多学者基于微流控芯片技术，对快速DNA检验开展了诸多研究，例如微流控芯片PCR技术、微流控芯片电泳技术、集成式芯片技术等。在此基础上，一系列DNA快速检验仪器也相继研发生产并得到应用，与仪器配套使用的STR快速检测试剂也是实现一体化快速检测不可或缺的一部分。目前国外的几款快检仪主要有：
Figure BDA0003065901520000011
200，配套使用
Figure BDA0003065901520000012
16HS试剂盒，90min内可完成包含16个基因座的整个DNA检验流程；单通道的
Figure BDA0003065901520000013
ID，配套使用
Figure BDA0003065901520000014
Express试剂盒，90min内可完成24个基因座的分型；以及ANDETM6C，使用FlexPlexTM27试剂盒，该试剂盒包含20个CODIS核心位点，90min内完成DNA检验的所有步骤。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于检测人基因组中21个基因座的引物对组；所述21个基因座分别为：D2S441、D5S818、D21S11、D16S539、D1S1656、TPOX、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D2S1338、D18S51、D19S433、D22S1045、D8S1179、vWA、TH01、D10S1248、D12S391、CSF1PO和FGA。
上述引物对组由如下(1)-(21)组成：
(1)用于检测D2S441的引物对1，由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；
(2)用于检测D5S818的引物对2，由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；
(3)用于检测D21S11的引物对3，由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；
(4)用于检测D16S539的引物对4，由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；
(5)用于检测D1S1656的引物对5，由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成；
(6)用于检测TPOX的引物对6，由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成；
(7)用于检测AMEL的引物对7，由序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成；
(8)用于检测D3S1358的引物对8，由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成；
(9)用于检测D13S317的引物对9，由序列表中序列17和序列18所示的两条单链DNA组成；
(10)用于检测D7S820的引物对10，由序列表中序列19和序列20所示的两条单链DNA组成；
(11)用于检测D2S1338的引物对11，由序列表中序列21和序列22所示的两条单链DNA组成；
(12)用于检测D18S51的引物对12，由序列表中序列23和序列24所示的两条单链DNA组成；
(13)用于检测D19S433的引物对13，由序列表中序列25和序列26所示的两条单链DNA组成；
(14)用于检测D22S1045的引物对14，由序列表中序列27和序列28所示的两条单链DNA组成；
(15)用于检测D8S1179的引物对15，由序列表中序列29和序列30所示的两条单链DNA组成；
(16)用于检测vWA的引物对16，由序列表中序列31和序列32所示的两条单链DNA组成；
(17)用于检测TH01的引物对17，由序列表中序列33和序列34所示的两条单链DNA组成；
(18)用于检测D10S1248的引物对18，由序列表中序列35和序列36所示的两条单链DNA组成；
(19)用于检测D12S391的引物对19，由序列表中序列37和序列38所示的两条单链DNA组成；
(20)用于检测CSF1PO的引物对20，由序列表中序列39和序列40所示的两条单链DNA组成；
(21)用于检测FGA的引物对21，由序列表中序列41和序列42所示的两条单链DNA组成。
进一步的，所述引物对组中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21的摩尔比为0.44：0.48：1.31：0.99：1.57：8.41：0.45：0.43：0.64：1.15：1.44：2.53：1.55：0.49：1.71：1.04：2.15：0.8：0.78：0.68：0.87；每个引物对中两条引物的摩尔比均为1：1。
本发明的另一个目的是提供用于检测人基因组中上述21个基因座的扩增试剂。
所述扩增试剂包括引物混合液和扩增预混液；
所述引物混合液包括上述引物对组；
所述扩增预混液包括扩增所需的酶、原料和缓冲液。
进一步的，所述扩增试剂为冻干扩增试剂；
所述冻干扩增试剂的制备方法包括如下步骤：
1)将含有海藻糖和葡聚糖的溶液作为冻干辅料与所述扩增预混液混匀，得到液体试剂甲；
将甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液作为冻干辅料与所述引物混合液混匀，得到液体试剂乙；
2)将所述液体试剂甲和所述液体试剂乙均进行冷冻干燥，分别得到冻干小球，即为冻干扩增试剂；
所述冻干扩增试剂可储存于全集成芯片卡盒中。
更进一步的，所述1)中，所述含有海藻糖和葡聚糖的溶液由海藻糖、葡聚糖和水(如去离子水)混匀得到，所述海藻糖在所述溶液中的质量分数为20％，所述葡聚糖在所述溶液中的质量分数为10％；
所述含有海藻糖和葡聚糖的溶液与所述扩增预混液按照体积比为1：1的比例混匀；
所述甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液由质量分数为15％的甘露醇溶液与质量分数为15％的海藻糖溶液按照体积比为8：1的比例混匀得到；
所述甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液与所述引物混合液按照体积比为1：1的比例混匀。
所述2)中，所述冷冻干燥的程序如下：预冻：-55℃30min；升华干燥：-45℃240min，-35℃360min，-25℃240min；解析干燥：20℃360min；保温：4℃。
在本发明的具体实施例中，所述扩增预混液为RTyper21 PCR Mix，是苏州新海生物科技股份有限公司的产品。
所述引物混合液由上述21个引物对和TE组成，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21在所述引物混合液中的终浓度分别为0.44μM、0.48μM、1.31μM、0.99μM、1.57μM、8.41μM、0.45μM、0.43μM、0.64μM、1.15μM、1.44μM、2.53μM、1.55μM、0.49μM、1.71μM、1.04μM、2.15μM、0.8μM、0.78μM、0.68μM和0.87μM；每个引物对中的两条引物在所述引物混合液中的终浓度相同。
本发明又有一个目的是提供用于检测人基因组中上述21个基因座的试剂盒，所述试剂盒含有上述引物对组或上述扩增试剂。
进一步的，所述试剂盒还可包括如下试剂：直扩处理液Ⅰ和直扩处理液Ⅱ。
更进一步的，所述试剂盒还可包括甲酰胺与AS 250内标混合液(二者体积比2：1)。
本发明还有一个目的是提供用于检测人基因组中上述21个基因座的成套系统，所述成套系统包括全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq和与其配套使用的扩增试剂；所述扩增试剂为上述扩增试剂。
本发明的最后一个目的是提供用于检测人基因组中上述21个基因座的物质的新用途。
本发明提供了用于检测人基因组中上述21个基因座的物质在如下任一种中的应用：
(a)STR分型；
(b)个体识别。
上述应用中，所述用于检测人基因组中上述21个基因座的物质包括上述引物对组或上述扩增试剂或上述试剂盒或上述成套系统。
在上述个体识别的应用中，基于全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq使用上述引物对组或上述扩增试剂或上述试剂盒对待测样本进行全集成检测，得到InDel分型，根据InDel分型结果即可进行个体识别。所述待测样本包括口腔拭子样本、血卡样本和唾液卡样本。
本发明中的基因座记载于文献“Selection and implementation of expandedCODIS core loci in the United States,D.R.Hares,Forensic Sci.Int.Genetics 17:33-34(2015)”中，在美国FBI网站(网址：https://www.fbi.gov/services/laboratory/biometric-analysis/codis)中也可查询相关信息。
本发明的冻干扩增试剂具有如下优点：首先，方便保存与运输，可以4℃保存，冰袋运输(短期甚至可以常温运输)，简化了运输方式；如果是相应的液体试剂，则需要-20℃保存。其次，性能稳定，不需低温保存盒或冰盒；常规做液体PCR时，DNA聚合酶是最后加入，且需要-20℃保存，对温度比较敏感，而本发明中的冻干小球就不存在这一问题，即使温度波动，性质也稳定，不需冰盒，操作时直接拿出，并可稳定存储在全集成芯片卡盒内。
本发明基于国内首台自主研发的全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq构建了一套包含21个STR位点的微流控芯片快速扩增试剂—RTyper 21，并采用冻干方式构建了RTyper21芯片冻干扩增试剂。通过实验证明：该RTyper21芯片冻干扩增试剂可以在微流控芯片卡盒中长期储存，可对口腔拭子、血卡、唾液卡样本进行检测，并在2个小时内完成样本裂解、PCR扩增、电泳分离全部流程，满足了公安实战现场、快速检测的迫切需要。
附图说明
图1为RTyper21芯片扩增试剂。A：冻干前，左侧为RTyper21 PCR Mix，右侧为RTyper21 Primer；B：冻干后，白色为RTyper21 PCR Mix，红色为RTyper21 Primer。
图2为RTyper21芯片冻干扩增试剂和液体扩增试剂的分型图比较。
图3为不同刮取次数口腔拭子样本的灵敏度测试结果。
图4为不同刮取次数口腔拭子样本的全集成检测结果。A：等位基因检出率；B：杂合子峰高比值。
图5为某一口腔拭子样本的全集成检测结果。
图6为某一血卡样本的全集成检测结果。
图7为某一唾液卡样本的全集成检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、引物的设计及RTyper 21芯片检测体系的构建
一、引物设计与合成
本发明的RTyper 21芯片检测体系包含20个CODIS STR基因座和1个Amelogenin性别基因座。根据每个基因座设计和优化扩增引物(扩增片段长度范围为84～422bp)，并采用FAM、HEX、TAMRA、ROX进行荧光标记，所有荧光标记均在每个位点的正向引物F的5’端进行标记。最终针对每个基因座设计的引物序列和荧光标记具体信息见表1所示。所有引物均由苏州新海生物科技股份有限公司合成。
表1、引物信息表
Figure BDA0003065901520000061
Figure BDA0003065901520000071
二、RTyper21芯片扩增检测体系的构建
本发明基于国内首台自主研发的全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq，构建了一套包含21个STR位点的微流控芯片快速扩增检测试剂—RTyper21(简称RTyper21扩增试剂)。RTyper21扩增试剂分为RTyper21液体扩增试剂和RTyper21冻干扩增试剂。
1、RTyper21液体扩增试剂
RTyper21液体扩增试剂由RTyper21 PCR Mix(苏州新海生物科技股份有限公司，货号为NH9352)和RTyper21 Primer组成。RTyper21 Primer由表1中的21个引物对和TE(溶剂为TE)组成，每个引物对在RTyper21 Primer中的终浓度分别为D2S441(0.44μM)、D5S818(0.48μM)、D21S11(1.31μM)、D16S539(0.99μM)、D1S1656(1.57μM)、TPOX(8.41μM)、AMEL(0.45μM)、D3S1358(0.43μM)、D13S317(0.64μM)、D7S820(1.15μM)、D2S1338(1.44μM)、D18S51(2.53μM)、D19S433(1.55μM)、D22S1045(0.49μM)、D8S1179(1.71μM)、vWA(1.04μM)、TH01(2.15μM)、D10S1248(0.8μM)、D12S391(0.78μM)、CSF1PO(0.68μM)和FGA(0.87μM)。每个引物对中的两条引物在RTyper21 Primer中的终浓度相同。
2、RTyper21冻干扩增试剂
采用真空冷冻干燥(简称冻干)的方式对RTyper21液体扩增试剂进行芯片存储，得到RTyper21冻干扩增试剂。具体冻干方法如下：
1)冻干辅料的筛选
为达到更好的冻干效果，对含DNA聚合酶的RTyper21 PCR Mix和RTyper21Primer拟采用不同种类的保护剂(减少酶等蛋白质物质在冻干过程中受到的损害，以保证冻干试剂的活性)和赋形剂(使冻干试剂具有一定的硬度和韧性，以保证冻干试剂有一个较好的骨架结构便于转移)，即冻干辅料进行冻干实验，分别筛选效果最好的冻干辅料。
对含DNA聚合酶的PCR Mix的冻干辅料共设置五个实验组，分别编号为Mix1～Mix5，具体如下：
Mix1：将海藻糖、葡聚糖和去离子水混匀，得到含有20％(质量分数)海藻糖和10％(质量分数)葡聚糖的混合溶液；
Mix2：将海藻糖、葡聚糖、BSA和去离子水混匀，得到含有20％(质量分数)海藻糖、10％(质量分数)葡聚糖和5％(质量分数)BSA的混合溶液；
Mix3：将海藻糖、葡聚糖和去离子水混匀，得到含有10％(质量分数)海藻糖和12％(质量分数)葡聚糖的混合溶液；
Mix4：将海藻糖、葡聚糖、PVP和去离子水混匀，得到含有10％(质量分数)海藻糖、15％(质量分数)葡聚糖和5％(质量分数)PVP的混合溶液；
Mix5：将海藻糖、葡聚糖和去离子水混匀，得到含有15％(质量分数)海藻糖和15％(质量分数)葡聚糖的混合溶液。
分别将上述五组获得的混合溶液作为PCR Mix的冻干辅料与RTyper21 PCR Mix按照体积比为1：1的比例混匀，得到液体试剂1-5。
对Primer Mix的冻干辅料共设置七个实验组，分别编号为Primer1～Primer 7，具体如下：
Primer1：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)、质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的BSA溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为1:1:1的比例混匀，得到混合溶液；
Primer2：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为1：1的比例混匀，得到混合溶液；
Primer3：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为2：1的比例混匀，得到混合溶液；
Primer4：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为4：1的比例混匀，得到混合溶液；
Primer5：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为6：1的比例混匀，得到混合溶液；
Primer6：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为8：1的比例混匀，得到混合溶液；
Primer7：将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)、质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的BSA溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为8:1:1的比例混匀，得到混合溶液。
分别将上述七组混合溶液作为Primer Mix冻干辅料与RTyper21 Primer按照体积比为1：1的比例混匀，得到液体试剂6-12。
分别将液体试剂1-12冻干成小球，利用0.4ng/μL的K562标准DNA溶液60μL分别复溶不同比例冻干的小球，比较其冻干成形状况、速溶性、快速复水性以及扩增效果。
结果发现，Mix2、Mix4、Primer1～Primer3、Primer 7小球无法成型或成型差，Mix5、Primer 4成型尚可但超过48小时小球粘连无法使用，Mix1、Mix3、Primer5和Primer6成型较好。
采用正交实验法，利用这4种成型较好的小球，使用0.4ng/μL的9947A标准DNA溶液60μL分别复溶(4个PCR Mix小球+2个Primer Mix小球)，放于扩增芯片上进行芯片PCR，对比复溶效果和扩增效果，结果发现Mix1和Primer6组合的小球可快速复溶且扩增效果最好，即最终筛选出PCR Mix的冻干辅料为20％海藻糖与10％葡聚糖，Primer Mix的冻干辅料为15％甘露醇与15％海藻糖(体积比8:1)。
2)冻干小球的制备
将海藻糖、葡聚糖和去离子水混匀，得到含有20％(质量分数)海藻糖和10％(质量分数)葡聚糖的混合溶液，然后将该混合溶液作为RTyper21 PCR Mix的冻干辅料与RTyper21 PCR Mix按照体积比为1：1的比例混匀，得到液体试剂甲。
将质量分数为15％的甘露醇溶液(溶剂为去离子水)与质量分数为15％的海藻糖溶液(溶剂为去离子水)按照体积比为8：1的比例混匀，得到混合溶液，然后将该混合溶液作为RTyper21 Primer的冻干辅料与RTyper21 Primer按照体积比为1：1的比例混匀，得到液体试剂乙。
分别将液体试剂甲和液体试剂乙按照如下方法进行冻干：选择10cm×10cm金属板作为冻干试剂承载容器，冻干开始前将金属板在液氮中预冷冻30min，取出后使用10μL移液器悬空向金属板上滴加试剂，试剂触板后凝结成球状。将承载有试剂的金属板放入真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，冻干工艺流程的设定如表2所示，开始冻干，整个冻干过程中真空度＜60pa。
表2、冻干工艺流程
Figure BDA0003065901520000091
3)RTyper21冻干扩增试剂成型效果
图1展示了RTyper21试剂冻干前后对比图，可以看到冻干小球粒度饱满，干燥性良好。冻干后的小球平均直径大小为2mm。
实施例2、RTyper21扩增试剂的应用
一、实验材料与方法
1、实验材料
1)实验样本
由志愿者提供的口腔拭子样本、血卡样本和唾液卡样本。三种样本的制备方法如下：
口腔拭子样本：志愿者使用采样拭子在口腔内壁左右各刮擦8次。
血卡样本：取志愿者指尖血2滴，每滴直径约为1cm，滴于采血卡标记圈内。
唾液卡样本：取志愿者左右两颊粘膜擦拭物，转移至唾液卡上，以上样本采集后阴干备用。
DNA标准品9947A(初始质量浓度为10ng/μL)是美国Thermo Fisher Scientific公司的产品。
2)实验仪器
Quick TargSeq全集成式DNA现场快速检验仪和全集成芯片卡盒由北京博奥生物技术有限公司提供。
2、实验方法
1)全集成芯片卡盒制备
在扩增芯片样本处理池中预埋扩增冻干试剂，包括4个RTyper21 PCR Mix冻干小球和2个RTyper21 Primer冻干小球；同时将6μL甲酰胺与AS 500内标混合液(体积比2：1)埋于电泳芯片进样孔槽下方，将55μL 5×TTE至于芯片各缓冲液孔，并用铝箔封装。
2)加样
在1.5mL离心管中加入200μL直扩处理液Ⅰ(苏州新海生物科技股份有限公司，货号为NH9866)，放入1根口腔拭子样本，或直径2mm圆形血卡/唾液卡4片，晃动5-10次，洗脱口腔上皮细胞或血细胞，然后取20μL上述直扩处理液Ⅰ与30μL直扩处理液Ⅱ(苏州新海生物科技股份有限公司，货号为NH9867)混合，加样至扩增芯片样本处理池复溶扩增冻干试剂。
3)全集成检测
将全集成芯片卡盒插入Quick TargSeq DNA现场快速检验仪进样仓，输入样本信息，选择预先设定的程序，点击运行键后，仪器自动完成样本裂解、PCR扩增、电泳分离全部流程。全集成主要流程及各流程重要参数如下：
样本裂解：反复抽吸20次，提取进液至扩增芯片，95℃裂解10min。
PCR扩增：裂解完成后开始扩增，热循环参数为95℃1min；95℃10s，59℃1min，72℃20s，28个循环；60℃10min。
电泳分离：PCR扩增产物出液，开始电泳，进样电压480V，进样时间180s；分离电压4600V，分离时间3600s；电泳温度59℃。
收集数据，使用配套软件BioStrGenotyping v2.0对结果进行分析。
二、扩增效果检测
使用10ng/μL DNA标准品9947A测试RTyper21冻干扩增试剂的扩增效果，并与RTyper21液体扩增试剂进行比较。全集成检测操作步骤参照步骤一中的2。
冻干试剂复溶液体积为50μL，由4个RTyper21 PCR Mix冻干小球、2个RTyper21Primer冻干小球、30μL直扩处理液Ⅱ，2μL DNA标准品9947A，18μL去离子灭菌水组成。
液体扩增试剂体系为50μL，由20μL RTyper21 PCR Mix，10μL RTyper21 Primer，2μL DNA标准品9947A，18μL去离子灭菌水组成。
以等位基因峰高≥200RFU为标准，结果显示，以DNA标准品9947A为模板，RTyper21液体试剂检测体系和冻干试剂检测体系均可获得完整分型，分型图见图2。与液体试剂检测体系相比，冻干试剂分型图中等位基因峰高较低(RFU值)，个别基因座杂合子不均衡，但不影响分型判断。整体来看，RTyper 21芯片检测体系，即冻干试剂检测体系扩增效果良好，满足实验需求。
三、灵敏度检测
取同一名志愿者的口腔拭子样本，分别在其口腔内壁左右各刮擦3次、5次、8次、10次，收集样品进行上述全集成检测，全集成检测操作步骤参照步骤一中的2。每种收集方式重复3次，测试RTyper 21芯片检测体系在快检仪上的灵敏度。
对同一名志愿者采集的口腔内壁左右各刮取3次、5次、8次、10次口腔拭子的检测结果如图3所示。结果显示，刮取次数为3次或5次时，部分等位基因峰值较低甚至缺失；刮取次数为8次时，无等位基因缺失，分型完整；当刮取次数增加到10次时，等位基因峰值降低，且部分等位基因缺失。
统计不同采集方式的等位基因检出率和杂合子峰高比值，结果如图4所示。随着刮取次数从3次增加到8次，等位基因检出率从82.54％增加到95.24％，而刮取次数10次时等位基因检出率为87.30％；四种不同刮取次数的杂合子峰高比分别为0.87、0.86、0.90、0.82。由此可见等位基因检出率和扩增效果并不与刮取次数成正比，分析原因可能是随着刮取次数增加，口腔中的粘蛋白量也增多，而后者可能会抑制DNA扩增，故推荐后续口腔拭子采样方式为左右各刮取8次。
四、检材适应性
对来源于不同志愿者的不同检材，包括口腔拭子、血卡和唾液卡样本进行全集成检测，以测试RTyper 21芯片检测体系对不同类型检材的检测能力。全集成检测操作步骤参照步骤一中的2。
对口腔拭子样本(口腔内壁左右各刮取8次)进行全集成检测，整个检测时间为2小时。分型结果如图5所示，以等位基因峰高值≥200RFU为分析阈值，无等位基因丢失且杂合子峰均衡性良好，但个别基因座扩增产物峰高值较低(如TH01)。
对血卡样本进行全集成检测，整个检测时间为2小时，分型结果如图6所示，存在短片段优势扩增现象，基因座间扩增产物峰高均衡性较差，但未出现等位基因丢失。
对唾液卡样本进行全集成检测，整个检测时间为2小时，分型结果如图7所示，STR分型完整，个别短片段等位基因峰值较低，但不影响分型判断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种用于全集成微流控芯片的STR快速个体识别扩增试剂及其应用
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cttttaaatt ggagctaagt ggctgtg 27
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 4
gattttcctc tttggtatcc ttat 24
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<212> DNA
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atatgtgagt caattcccca ag 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtattagtca atgttctcca ga 22
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctttcaggca tttcagagat tatg 24
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<212> DNA
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<400> 19
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gttcatgcct acatccctag tacct 25
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<212> DNA
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<400> 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
gctcaggccc actgggctct 20
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<212> DNA
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<400> 30
gtgttcatga gtatagtttc acgtag 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cctcatttta tagacattac tagtctcc 28
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<212> DNA
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<400> 32
gataggacag atgataaata cataggatgg 30
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aaatccaaga tggccagagg tc 22
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<213> Artificial Sequence
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ggctgaaaag ctcccgatta tc 22
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<213> Artificial Sequence
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ttaatgaatt gaacaaatga gtgagt 26
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<212> DNA
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<400> 36
acaactctgg ttgtattgtc tt 22
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<212> DNA
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tgggactgtc atgagatttt tca 23
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gaatcaacag gatcaatgga tgcat 25
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<213> Artificial Sequence
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caaatgcccc ataggttttg 20
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<400> 42
gcttcaggac ttcaattctg ct 22

Claims (2)

1.用于检测人基因组中21个基因座的成套系统，其包括全集成式DNA现场快速检验仪器Quick TargSeq和与其配套使用的冻干扩增试剂；所述冻干扩增试剂包括扩增预混液和引物混合液；
所述扩增预混液包括扩增所需的酶、原料和缓冲液；
所述引物混合液包括用于检测人基因组中21个基因座的引物对组；所述21个基因座分别为：D2S441、D5S818、D21S11、D16S539、D1S1656、TPOX、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D2S1338、D18S51、D19S433、D22S1045、D8S1179、vWA、TH01、D10S1248、D12S391、CSF1PO和FGA；
所述冻干扩增试剂的制备方法包括如下步骤：
1)将含有海藻糖和葡聚糖的溶液作为冻干辅料与所述扩增预混液混匀，得到液体试剂甲；将甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液作为冻干辅料与所述引物混合液混匀，得到液体试剂乙；
所述含有海藻糖和葡聚糖的溶液由海藻糖、葡聚糖和水混匀得到，所述海藻糖在所述溶液中的质量分数为20％，所述葡聚糖在所述溶液中的质量分数为10％；所述含有海藻糖和葡聚糖的溶液与所述扩增预混液按照体积比为1：1的比例混匀；
所述甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液由质量分数为15％的甘露醇溶液与质量分数为15％的海藻糖溶液按照体积比为8：1的比例混匀得到；所述甘露醇溶液和海藻糖溶液的混合液与所述引物混合液按照体积比为1：1的比例混匀；
2)将所述液体试剂甲和所述液体试剂乙均进行冷冻干燥，分别得到冻干小球，即为冻干扩增试剂；所述冷冻干燥的程序如下：预冻：-55℃30min；升华干燥：-45℃240min，-35℃360min，-25℃240min；解析干燥：20℃360min；保温：4℃；
所述引物对组由如下(1)-(21)组成：
(1)用于检测D2S441的引物对1，由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；
(2)用于检测D5S818的引物对2，由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组
成；
(3)用于检测D21S11的引物对3，由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；
(4)用于检测D16S539的引物对4，由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；
(5)用于检测D1S1656的引物对5，由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成；
(6)用于检测TPOX的引物对6，由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成；
(7)用于检测AMEL的引物对7，由序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成；
(8)用于检测D3S1358的引物对8，由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成；
(9)用于检测D13S317的引物对9，由序列表中序列17和序列18所示的两条单链DNA组成；
(10)用于检测D7S820的引物对10，由序列表中序列19和序列20所示的两条单链DNA组成；
(11)用于检测D2S1338的引物对11，由序列表中序列21和序列22所示的两条单链DNA组成；
(12)用于检测D18S51的引物对12，由序列表中序列23和序列24所示的两条单链DNA组成；
(13)用于检测D19S433的引物对13，由序列表中序列25和序列26所示的两条单链DNA组成；
(14)用于检测D22S1045的引物对14，由序列表中序列27和序列28所示的两条单链DNA组成；
(15)用于检测D8S1179的引物对15，由序列表中序列29和序列30所示的两条单链DNA组成；
(16)用于检测vWA的引物对16，由序列表中序列31和序列32所示的两条单链DNA组成；
(17)用于检测TH01的引物对17，由序列表中序列33和序列34所示的两条单链DNA组成；
(18)用于检测D10S1248的引物对18，由序列表中序列35和序列36所示的两条单链DNA组成；
(19)用于检测D12S391的引物对19，由序列表中序列37和序列38所示的两条单链DNA组成；
(20)用于检测CSF1PO的引物对20，由序列表中序列39和序列40所示的两条单链DNA组成；
(21)用于检测FGA的引物对21，由序列表中序列41和序列42所示的两条单链DNA组成；
所述引物对组中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6、所述引物对7、所述引物对8、所述引物对9、所述引物对10、所述引物对11、所述引物对12、所述引物对13、所述引物对14、所述引物对15、所述引物对16、所述引物对17、所述引物对18、所述引物对19、所述引物对20、所述引物对21的摩尔比为0.44：0.48：1.31：0.99：1.57：8.41：0.45：0.43：0.64：1.15：1.44：2.53：1.55：0.49：1.71：1.04：2.15：0.8：0.78：0.68：0.87；每个引物对中两条引物的摩尔比均为1：1。
2.权利要求1所述的成套系统在如下任一种中的应用：
(a)STR分型；
(b)个体识别。
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