CN112011448B - 微流控芯片与试剂盒及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种微流控芯片与试剂盒及其应用方法；所述微流控芯片的基体设有定位槽、样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、核酸腔、废液腔、分发管道及至少二PCR反应腔；基体还设有蛋白酶溶液储存腔、混合腔、过滤区及选择腔。应用于检测可以设置PCR反应腔的数量，将荧光PCR检测方法与微流控技术相结合，使两种技术的优势互补的同时又规避了两者的缺点，不存在样本或化学试剂泄露的可能性，亦大大降低核酸污染的可能性，能快速准确地鉴定样本中的相关病原菌，尤其适合实现多重检测，节省了实验时间及成本；且对操作环境、人员技能等要求低，高度自动化、耗时少，又能兼顾检测的特异性、灵敏度等性能指标。

Description

微流控芯片与试剂盒及其应用方法

技术领域

本申请涉及病菌检测领域，特别是涉及微流控芯片与试剂盒及其应用方法。

背景技术

致病菌是指能引起人类疾病的微生物，也称病原微生物，一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。食源性致病菌是指在食品的加工和流通过程中引入的病原菌，是通过食物来传染的细菌，这些病原菌在食品中存活、生长代谢引起食物的变质和破坏，同时有些病原菌分泌有毒物质可引起人或畜患有共同的传染病以及食物中毒。食品中常见的致病菌有沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌O157:H7等。虽然不同的食源性致病菌其感染源不尽相同，但大多为肉制品、水产制品、蛋制品、乳制品，果蔬等生鲜食品。人感染食源性致病菌后主要引起恶心、呕吐、腹痛、腹部痉挛、腹泻等胃肠道症状。致病菌是引发我国食源性疾病的主要病因，对人们的身体健康造成巨大危害，同时也给国民经济带来重大损失，是目前最为突出的公共卫生问题之一。

微流控芯片(microfluidics)亦称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米甚至更小的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。

针对食源性致病菌的传统检测方法，主要包括：传统的微生物生化鉴定法、仪器分析法、分子生物学技术和免疫学检测方法等。传统的微生物生化鉴定法是根据微生物不同的生理生化特性对其进行鉴定的方法，主要步骤包括琼脂板上培养微生物增菌培养、分离纯化、革兰氏染色、生化试验及血清学试验等。该方法对实验设备要求不高，且结果稳定性较好，但实验操作却相对繁琐，耗时耗力，一般需要5-8天甚至更长时间，同时该方法的灵敏度和特异性都不高。仪器分析法，目前主要是利用气相色谱和高效液相色谱进行致病菌的检测，检测原理主要是依据不同致病菌的化学组成或产生的代谢产物不同，利用色谱分析体液中的细菌代谢产物，从而确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测，其中以气相色谱的应用居多。该方法操作简单快速、结果可靠，灵敏度高，但使用的仪器设备相对比较昂贵。免疫学检测方法是一种基于抗原和相应的抗体之间特异性结合的原理来检测食源性致病菌的方法，常用的免疫学方法有酶联免疫法、免疫胶体金技术、时间分辨荧光免疫技术、聚合酶免疫检测技术、化学发光免疫技术等。免疫学方法具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的时间比较长，成本高，且不稳定。分子生物学技术用来检测细菌，最常用的是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)法，包括常规PCR和实时荧光PCR(realtime-PCR)等。常规PCR是以核酸为模板，以引物、dNTP等为原料，利用DNA聚合酶来扩增目的片段的过程，扩增完成后通过琼脂糖凝胶电泳来分辨目的片段的长度。该方法简单快速，但只能做定性分析，琼脂糖凝胶电泳的结果不能实时显示且操作过程中容易造成交叉污染。实时荧光定量PCR是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测基因的扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，无需像常规PCR扩增反应后再进行电泳实验。市场上针对食源性致病菌的荧光PCR检测试剂盒有很多，常见的致病菌如志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、副溶血弧菌等都有相应的检测试剂盒，其灵敏度和特异性较好。此类试剂盒的使用包括致病菌样本核酸提取和荧光PCR扩增两个过程，其中核酸提取过程操作繁琐费时，且试剂盒的使用对实验人员的操作技能的要求很高，需要进行专业的培训并持证上岗；整个过程对场地也有很高的要求，其中样本处理、试剂配制及PCR扩增需严格分区，以防止试验过程中的交叉污染。

因此，传统检测方法存在操作复杂、时间长、准确度低及稳定性低等问题，此外，目前市场上还没有同时检测可增加多种食源性致病菌的微流控芯片。

发明内容

基于此，有必要提供一种微流控芯片与试剂盒及其应用方法。

一种微流控芯片，包括基体，所述基体具有目标旋转中心且所述基体设有定位槽、样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、核酸腔、废液腔、分发管道及至少二PCR反应腔；所述基体还设有蛋白酶溶液储存腔、混合腔、过滤区及选择腔；所述蛋白酶溶液储存腔通过所述样本腔连通所述混合腔，所述混合腔及所述裂解液储存腔分别连通所述样本裂解腔；所述清洗液储存腔、所述样本裂解腔及所述洗脱液储存腔分别连通所述缓冲腔，所述缓冲腔通过所述过滤区连通所述选择腔；所述选择腔的底部具有相对的两侧，一侧连通所述废液腔，另一侧通过所述核酸腔连通所述分发管道；所述分发管道分别连通各所述PCR反应腔且末端连通所述废液腔。一种微流控芯片试剂盒，其包括任一项所述微流控芯片，且于各所述PCR反应腔中设有干粉状态的目标扩增试剂。一种微流控芯片试剂盒的应用方法，其应用于任一项所述微流控芯片试剂盒；所述微流控芯片试剂盒的应用方法包括步骤：提供预置有提取试剂、内标干粉及目标扩增试剂的微流控芯片，所述提取试剂包括蛋白酶溶液、裂解液、清洗液及洗脱液，所述目标扩增试剂呈干粉状态，所述目标扩增试剂具有多种食源性致病的特异性引物及探针且每一所述PCR反应腔中预置有至少一种食源性致病菌的特异性引物及探针；加入样本到样本腔中，在微流控环境下进行荧光PCR检测。上述微流控芯片应用于检测，根据目标样品量可以设置对应PCR反应腔的数量，将荧光PCR检测方法与微流控技术相结合，使两种技术的优势互补的同时又规避了两者的缺点，形成一个高封闭的体系，不存在样本或化学试剂泄露的可能性，对于操作人员或者环境安全性大大加强，亦大大降低核酸污染的可能性，能快速准确地鉴定样本中的相关病原菌，尤其适合实现多重检测，大大增加了检测项目通量，节省了实验时间及成本；且本申请提供的试剂盒及其应用方法对操作环境、人员技能等要求低，高度自动化、耗时少的同时又能兼顾检测的特异性、灵敏度等性能指标。

附图说明

图1为本申请微流控芯片一实施例的结构示意图。图2为图1所示实施例的A-A方向剖视示意图。图3为图1所示实施例的另一方向示意图。图4为图3所示实施例的另一方向示意图。图5为图1所示实施例的部分结构示意图。图6为图1所示实施例的部分结构示意图。图7为图1所示实施例的另一方向示意图。图8为图7所示实施例的B处放大示意图。图9为图1所示实施例的另一方向示意图。图10为本申请微流控芯片另一实施例的结构示意图。图11为图10所示实施例的另一方向示意图。图12为图10所示实施例的另一方向示意图。图13为图10所示实施例的另一方向示意图。图14为图13所示实施例的C处放大示意图。图15为图10所示实施例的另一方向示意图。图16为图10所示实施例的另一方向示意图。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本申请的说明书所使用的术语“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。除非另有定义，本申请的说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本申请。本申请的说明书所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在本申请一个实施例中，一种微流控芯片，其包括以下实施例的部分结构或全部结构；即，所述微流控芯片包括以下的部分技术特征或全部技术特征。在其中一个实施例中，一种微流控芯片，包括基体，基体具有目标旋转中心且基体设有定位槽、样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、核酸腔、废液腔、分发管道及至少二PCR反应腔；基体还设有蛋白酶溶液储存腔、混合腔、过滤区及选择腔；蛋白酶溶液储存腔通过样本腔连通混合腔，混合腔及裂解液储存腔分别连通样本裂解腔；清洗液储存腔、样本裂解腔及洗脱液储存腔分别连通缓冲腔，缓冲腔通过过滤区连通选择腔；选择腔的底部具有相对的两侧，一侧连通废液腔，另一侧通过核酸腔连通分发管道；分发管道分别连通各PCR反应腔且末端连通废液腔。上述微流控芯片应用于检测，根据目标样品量可以设置对应PCR反应腔的数量，将荧光PCR检测方法与微流控技术相结合，使两种技术的优势互补的同时又规避了两者的缺点，形成一个高封闭的体系，不存在样本或化学试剂泄露的可能性，对于操作人员或者环境安全性大大加强，亦大大降低核酸污染的可能性，能快速准确地鉴定样本中的相关病原菌，尤其适合实现多重检测，大大增加了检测项目通量，节省了实验时间及成本。

在其中一个实施例中，清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔；第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔分别连通缓冲腔；第二清洗液储存腔还连通第一清洗液储存腔。必要时还可以增加清洗液储存腔的数量。在其中一个实施例中，第一清洗液储存腔还连通废液腔，且于第一清洗液储存腔与废液腔之间的连通管道中设有第二石蜡阀。第二石蜡阀用于在一定温度下熔化以控制第一清洗液储存腔与废液腔的连通。在其中一个实施例中，废液腔包括第一废液腔、第二废液腔及第三废液腔；选择腔的底部一侧连通第一废液腔；洗脱液储存腔连通第二废液腔且洗脱液储存腔连通第二废液腔的位置到目标旋转中心的最近距离，小于洗脱液储存腔连通缓冲腔的位置到目标旋转中心的最近距离；分发管道的末端连通第三废液腔；及/或，样本裂解腔包括第一样本裂解腔及第二样本裂解腔；第一样本裂解腔及第二样本裂解腔于邻近目标旋转中心处相连通设置，混合腔及裂解液储存腔分别连通第一样本裂解腔，第二样本裂解腔连通缓冲腔；及/或，于混合腔与样本裂解腔之间的连通管道中设有第一石蜡阀。第一石蜡阀用于在一定温度下熔化以控制混合腔与样本裂解腔的连通。

在其中一个实施例中，如图1所示，一种微流控芯片，包括基体100，基体100具有目标旋转中心200且基体100设有样本腔120、裂解液储存腔150、样本裂解腔140、清洗液储存腔、洗脱液储存腔180、缓冲腔190、核酸腔220、废液腔、分发管道310及十个PCR反应腔290；在其中一个实施例中，如图10、图11及图12所示，PCR反应腔290的数量为五个。请一并参阅图15及图16，基体100还设有蛋白酶溶液储存腔110、混合腔130、过滤区230及选择腔210；目标旋转中心可以在基体上亦可在基体外。请一并参阅图5，样本裂解腔140包括第一样本裂解腔141及第二样本裂解腔142；第一样本裂解腔141及第二样本裂解腔142于邻近目标旋转中心200处相连通设置，蛋白酶溶液储存腔110通过样本腔120连通混合腔130，混合腔130及裂解液储存腔150分别连通第一样本裂解腔141，于混合腔130与样本裂解腔140之间的连通管道中设有第一石蜡阀240；清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔160及第二清洗液储存腔170；废液腔包括第一废液腔260、第二废液腔270及第三废液腔280；洗脱液储存腔180连通第二废液腔270且洗脱液储存腔180连通第二废液腔270的位置到目标旋转中心200的最近距离，小于洗脱液储存腔180连通缓冲腔190的位置到目标旋转中心200的最近距离；第一清洗液储存腔160、第二清洗液储存腔170、第一样本裂解腔141、第二样本裂解腔142及洗脱液储存腔180分别连通缓冲腔190，缓冲腔190通过过滤区230连通选择腔210；第二清洗液储存腔170还连通第一清洗液储存腔160。选择腔210的底部具有相对的两侧，一侧连通第一废液腔260，另一侧通过核酸腔220连通分发管道310；分发管道310分别连通各PCR反应腔290且末端连通第三废液腔280。第一清洗液储存腔160还连通第一废液腔260，且于第一清洗液储存腔160与第一废液腔260之间的连通管道中设有第二石蜡阀250。设计选择腔是为了增大科里奥利力作用在液体的时间，从而让液体在做通道转换时更为可靠，例如在一定转速的逆时针转动状态下，释放第一清洗液，对过滤区的硅胶膜上的DNA进行清洗后，在科里奥利力的作用下进入第一废液腔；然后释放第二清洗液，进行清洗后，在科里奥利力的作用下进入第一废液腔；再将离心方向改为顺时针旋转，在一定转速的顺时针转动状态下，释放洗脱液浸泡硅胶膜，提升到一定转速，洗脱硅胶膜后的洗脱液在科里奥利力的作用下流入核酸腔中。

在其中一个实施例中，如图1所示，请一并参阅图13，按与目标旋转中心的最近距离从小到大的顺序排列为：样本腔120、蛋白酶溶液储存腔110、混合腔130、裂解液储存腔150、样本裂解腔140、清洗液储存腔、洗脱液储存腔180、缓冲腔190、选择腔210、核酸腔220、分发管道310及各PCR反应腔290，且废液腔与目标旋转中心的最远距离最大；废液腔包括第一废液腔260、第二废液腔270及第三废液腔280，选择腔的底部一侧连通第一废液腔；洗脱液储存腔连通第二废液腔，分发管道的末端及第一废液腔邻近目标旋转中心的位置分别连通第三废液腔；第一废液腔与目标旋转中心的最近距离小于选择腔与目标旋转中心的最近距离且不大于核酸腔与目标旋转中心的最近距离；第二废液腔与目标旋转中心的最近距离大于洗脱液储存腔与目标旋转中心的最近距离；第三废液腔与目标旋转中心的最远距离最大；或者，第三废液腔与目标旋转中心的最远距离最大且等于第二废液腔与目标旋转中心的最远距离。

在其中一个实施例中，如图1所示，清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔160及第二清洗液储存腔170；第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔分别连通缓冲腔；第二清洗液储存腔还连通第一清洗液储存腔；第一清洗液储存腔到目标旋转中心的最近距离不小于第二清洗液储存腔到目标旋转中心的最近距离；第二清洗液储存腔与缓冲腔之间的连通管道延长设置。在其中一个实施例中，如图1所示，蛋白酶溶液储存腔110、样本腔120、裂解液储存腔150、第一清洗液储存腔160、第二清洗液储存腔170、洗脱液储存腔180、核酸腔220、第一废液腔260、第三废液腔280中的至少一项设有用于连通外界环境的通气口。在其中一个实施例中，如图3所示，请一并参阅图5，蛋白酶溶液储存腔110设有用于连通外界环境的蛋白酶K溶液储存腔通气口111，洗脱液储存腔180设有用于连通外界环境的洗脱液储存腔通气口181，请一并参阅图6，第三废液腔280设有用于连通外界环境的第三废液腔通气口281，其余防逆流结构如图所示，不再赘述。在其中一个实施例中，如图1所示，样本裂解腔140包括第一样本裂解腔141及第二样本裂解腔142；第一样本裂解腔及第二样本裂解腔于邻近目标旋转中心处相连通设置，混合腔及裂解液储存腔分别连通第一样本裂解腔，第一样本裂解腔及第二样本裂解腔分别连通缓冲腔。

在其中一个实施例中，如图1所示，裂解液储存腔150与第一样本裂解腔141之间的连通管道、第一样本裂解腔141与缓冲腔190之间的连通管道、第一清洗液储存腔160与第二清洗液储存腔170之间的连通管道、第一清洗液储存腔160与第一废液腔260之间的连通管道、核酸腔220与分发管道310之间的连通管道、洗脱液储存腔180与第二废液腔270之间的连通管道，分别设有防逆流结构。如图1所示，核酸腔220与分发管道310之间的连通管道设有第一防逆流结构330，请一并参阅图14，裂解液储存腔150与第一样本裂解腔141之间的连通管道设有第二防逆流结构340，其余防逆流结构如图所示，不再赘述。

在其中一个实施例中，如图3及图4所示，基体100设有定位槽，定位槽包括第一定位槽101、第二定位槽102及第三定位槽103，第一定位槽、第二定位槽及第三定位槽分别用于定位安装微流控芯片。在其中一个实施例中，如图1及图3所示，过滤区230设有过滤体232，过滤体包括硅胶膜或者柱状体，柱状体填设有硅胶膜或者柱状体设有至少二硅胶膜层；进一步地，在其中一个实施例中，如图2所示，过滤区230包括过滤体232、进液区231及出液区233，进液区与出液区相连通设置，过滤体填设于进液区、出液区以及进液区与出液区之间中的至少一项。请一并参阅图7及图8，进液区与出液区在位于基体底部位置的底部通道相连通设置，过滤体至少部分位于底部通道中。请一并参阅图9及图10，进液区与出液区在位于基体上部位置间隔设置。过滤体亦可设置于进液区或出液区中。这样的设计，有利于提升清洗及洗脱效果，清洗液或洗脱液在具有一定体积后才从出液区流入第一废液腔或核酸腔中。

在其中一个实施例中，如图1所示，于混合腔130与第一样本裂解腔141之间的连通管道中设有第一石蜡阀240，于第一清洗液储存腔160与第一废液腔260之间的连通管道中设有第二石蜡阀250，请一并参阅图9，在第二石蜡阀250之前还设有缓冲区320；用于暂存多余的第一清洗液。

在其中一个实施例中，一种微流控芯片试剂盒，其包括任一实施例所述微流控芯片，且于各所述PCR反应腔中设有干粉状态的目标扩增试剂。在其中一个实施例中，所述微流控芯片还预置有提取试剂，所述提取试剂包括蛋白酶溶液、内标干粉、裂解液、洗脱液及两种清洗液；所述PCR反应腔的数量为十个，各所述PCR反应腔中设有相异的目标扩增试剂，每一所述目标扩增试剂用于检测对应的两种食源性致病菌。即一个PCR反应腔检测两种相异的食源性致病菌，N个PCR反应腔检测2N种相异的食源性致病菌。所述微流控芯片还预置有提取试剂，包括：微流控芯片的蛋白酶溶液储存腔中预置蛋白酶溶液，混合腔中预置内标干粉，裂解液储存腔中预置裂解液，两个清洗液储存腔中分别预置两种清洗液，洗脱液储存腔中预置洗脱液。这样的试剂盒采用了微流控芯片快速检测技术和多重荧光PCR技术，在微流控芯片中同时预置有核酸提取试剂和PCR扩增试剂，核酸提取试剂即提取试剂，PCR扩增试剂即目标扩增试剂，只需加入样本一步操作即能通过仪器操作得到最终的检测结果，实现检测的高度自动化。进一步地，在其中一个实施例中，各所述目标扩增试剂包括沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigellosis spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、霍乱弧菌O1群(Vibrio choleraeO1)、霍乱弧菌O139群(Vibrio cholerae O139)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲菌(Campylobactercolic)、大肠杆菌O157(Escherichia coli O157)、大肠杆菌O104(Escherichia coliO104)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)特定基因保守序列具有的特异性引物及探针，以对应检测上述各致病菌亦可称为食源性致病菌，从而能够特异性地检测出相应的细菌类型。探针标记有不同的荧光基团，能够在同一个反应体系中混合多重引物探针，实现同时检测多个目标。

为解决试剂储存的便捷性，进一步地，在其中一个实施例中，将PCR试剂制备为干粉状态的目标扩增试剂预置在微流控芯片中，实现4℃低温或常温保存即目标扩增试剂以冻干粉状态保存。进一步地，在其中一个实施例中，所述微流控芯片试剂盒中，对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、大肠杆菌O157、大肠杆菌O104、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜水气单胞菌、产气荚膜梭菌、阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的相应基因的保守序列分别设计特异性引物探针；本申请提供的试剂盒及其应用方法对操作环境、人员技能等要求低，高度自动化、耗时少的同时又能兼顾检测的特异性、灵敏度等性能指标。

在其中一个实施例中，所述提取试剂的成分包括：蛋白酶K溶液：蛋白酶K；裂解液：盐酸胍、无水乙醇、SDS、曲拉通；清洗液1：盐酸胍、NaCl、Tris-HCl、无水乙醇；清洗液2：NaCl、无水乙醇；洗脱液：Tris-HCl、EDTA；所述扩增试剂即目标扩增试剂的成分包括：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、海藻糖、甘露醇、BSA、热启动Taq酶、逆转录酶以及检测20种食源性致病的引物和探针，包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、大肠杆菌O157、大肠杆菌O104、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜水气单胞菌、产气荚膜梭菌、阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的特异性引物及TaqMan探针。在其中一个实施例中，所述扩增试剂配制混合后经过冻干工艺制成干粉形态，冻干工艺采用如下冻干程序实现。

阶段	温度	升降温时间	保持时间	真空(Pa)
					预冻	-50℃	2h	4h	/
一次干燥	-45℃	1h	4h	10
						-25℃	1h	4h	10
二次干燥	/	1h	/	5
						-10℃	1h	2h	5
	0℃	20min	4h	5
						25℃	1h	2h	5

冻干完成后，将干粉预置到微流控芯片的各个反应腔室(1-10号反应腔室)中。进一步地，在其中一个实施例中，所述目标扩增试剂包括特异性引物序列：沙门氏菌，SEQ1-2；志贺氏菌，SEQ4-5；金黄色葡萄球菌，SEQ7-8；单增李斯特菌，SEQ10-11；霍乱弧菌O1群，SEQ13-14；霍乱弧菌O139群，SEQ16-17；副溶血弧菌，SEQ19-20；创伤弧菌，SEQ22-23；拟态弧菌，SEQ25-26；溶藻弧菌，SEQ28-29；空肠弯曲菌，SEQ31-32；结肠弯曲菌，SEQ34-35；大肠杆菌O157，SEQ37-38；大肠杆菌O104，SEQ40-41；假结核耶尔森菌，SEQ43-44；小肠结肠炎耶尔森菌，SEQ46-47；嗜水气单胞菌，SEQ49-50；产气荚膜梭菌，SEQ52-53；阪崎肠杆菌，SEQ55-56；蜡样芽孢杆菌，SEQ58-59。所述目标扩增试剂包括特异性TaqMan探针序列：沙门氏菌，SEQ3；志贺氏菌，SEQ6；金黄色葡萄球菌，SEQ9；单增李斯特菌，SEQ12；霍乱弧菌O1群，SEQ15；霍乱弧菌O139群，SEQ18；副溶血弧菌，SEQ21；创伤弧菌，SEQ24；拟态弧菌，SEQ27；溶藻弧菌，SEQ30；空肠弯曲菌，SEQ33；结肠弯曲菌，SEQ36；大肠杆菌O157，SEQ39；大肠杆菌O104，SEQ42；假结核耶尔森菌，SEQ45；小肠结肠炎耶尔森菌，SEQ48；嗜水气单胞菌，SEQ51；产气荚膜梭菌，SEQ54；阪崎肠杆菌，SEQ57；蜡样芽孢杆菌，SEQ60。所述目标扩增试剂还包括内标特异性引物SEQ61-62以及内标特异性TaqMan探针SEQ63。

各特异性引物及探针序列如下表1所示。

表1

在其中一个具体应用的实施例中，一种检测20种食源性致病菌的微流控芯片试剂盒包括主动控制流路的核酸提取和扩增的离心微流控芯片、预装核酸提取试剂、预装PCR扩增冻干粉试剂、内标；微流控芯片核酸提取部分包括样本腔、混合腔、样本裂解腔、裂解液储存腔、清洗液1储存腔、清洗液2储存腔、洗脱液储存腔和提取试剂废液腔，每个腔室都有相应管道联通；微流控芯片核酸扩增部分包括一条出样主流道及若干分样流道，各分样流道对应一个反应腔室，能保证将相同体积的核酸样本分装到各个反应腔室中。所述微流控芯片的核酸提取部分的不同腔室中分别预装有不同的提取液，其中混合腔中预置内标干粉，裂解液储存腔中预置裂解液液体试剂，清洗液1储存腔中预置有清洗液1液体试剂，清洗液2储存腔中预置有清洗液2液体试剂，洗脱液储存腔中预置有洗脱液液体试剂；所述微流控芯片的核酸扩增部分的包括若干个反应腔室，各反应腔室之间相互独立，各个反应腔室中分别预置有检测20种食源性致病菌中的2种检测试剂干粉。

在其中一个具体应用的实施例中，一种检测20种食源性致病菌的微流控芯片试剂盒，该试剂盒能完成从核酸提取到PCR核酸检测的全自动操作，包括核酸提取的各腔室与连接各腔室的微流控管道；核酸PCR检测的核酸分发管道及若干反应腔室；所述微流控芯片腔室包括用于核酸自动提取的样本腔、混合腔、样本裂解腔、蛋白酶K溶液储存腔、裂解液储存腔、清洗液1储存腔、清洗液2储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、硅胶膜、选择腔、核酸腔、废液腔，各腔室之间彼此相互独立，通过相应的微流控管道连接。微流控芯片腔室还包括用于核酸PCR扩增检测的若干个反应腔室及分发核酸的微流控管道，各个反应腔室之间彼此独立，通过核酸分发管道连接。所述反应腔室至少包括10个，各反应腔室中均预置有用于扩增2种致病菌及1个内标的PCR试剂干粉，该试剂干粉包括用于扩增相应致病菌的引物和TaqMan探针以及用于监控整个核酸检测过程的内标引物探针；预置于各个反应腔室中的试剂干粉能够扩增以下20种食源性致病性中的两种，并且，所有反应腔室中的试剂干粉扩增出的食源性致病菌能够包涵以下20种食源性致病：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、大肠杆菌O157、大肠杆菌O104、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜水气单胞菌、产气荚膜梭菌、阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌。在其中一个实施例中，微流控芯片中预置有核酸提取的液体试剂的腔室包括蛋白酶K溶液储存腔、裂解液储存腔、清洗液1储存腔、清洗液2储存腔和洗脱液储存腔，分别预置有蛋白酶K溶液、裂解液、清洗液1、清洗液2和洗脱液。在其中一个实施例中，蛋白酶K溶液中蛋白酶K的浓度为10mg/ml至100mg/ml。在其中一个实施例中，所述裂解液中盐酸胍的终浓度为2M-6M；无水乙醇的终浓度为30％-50％；Tris-HCl的终浓度为10-30mM；曲拉通100的终浓度为5％-20％；在其中一个实施例中，所述清洗液1中盐酸胍的终浓度为1-5M；无水乙醇的终浓度为37％-50％；在其中一个实施例中，所述清洗液2中Tris-HCl的终浓度为5-20mM；NaCl的终浓度为50-200mM；无水乙醇的终浓度为50-80％；所述洗脱液中Tris-HCl的终浓度为5-20mM；EDTA的终浓度为0.1-2mM。在其中一个实施例中，混合腔中预置有内标质粒干粉。在其中一个实施例中，所述预置在反应腔室即PCR反应腔中的目标扩增试剂包括PCR缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl₂、海藻糖、甘露醇、牛血清蛋白、热启动Taq酶、逆转录酶、食源性致病菌及内标引物探针。在其中一个实施例中，特异性引物在PCR扩增体系中的终浓度为50-1000nM；所述TaqMan探针在PCR扩增体系中的终浓度为25-500nM；所述海藻糖在PCR扩增体系中的终浓度为2％-15％；所述甘露醇在PCR扩增体系中的终浓度为0.5％-5％；所述牛血清蛋白在PCR扩增体系中的终浓度为0.2％-5％；所述dATP、dTTP、dCTP、dGTP在PCR扩增体系中的终浓度为0.1mM-5mM；所述MgCl₂在PCR扩增体系中的终浓度为1mM-10mM；所述热启动酶在PCR扩增体系中的终浓度为0.5U-5U；所述逆转录酶在PCR扩增体系中的终浓度为5U-50U。在其中一个实施例中，所述试剂盒芯片为扇形形状，从上至下分为核酸提取功能区与核酸PCR扩增检测区两部分，其中：核酸提取功能区包括样本腔、混合腔、样本裂解腔、蛋白酶K溶液储存腔、裂解液储存腔、清洗液1储存腔、清洗液2储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、硅胶膜、选择腔、核酸腔、废液腔；所述腔室根据试剂加载顺序，其排布如下：样本腔和蛋白酶K溶液储存腔通过毛细阀与混合腔连接，混合腔通过石蜡阀与样本裂解腔连接，裂解液储存腔通过虹吸阀与样本裂解腔连接，样本裂解腔通过虹吸阀与缓冲腔连接，清洗液1储存腔、清洗液2储存腔和洗脱液储存腔分别通过微流控管道与缓冲腔相连，三个腔室同时均与废液腔相连，缓冲腔通过管道与硅胶膜相连，然后通过选择腔连接废液腔1和核酸腔；核酸PCR扩增检测区包括至少10个独立的反应腔和核酸分发管道；所述核酸分发管道与核酸腔和废液腔2相连，所述反应腔为扁平圆形状，通过毛细阀与核酸分发管道相连。

在其中一个实施例中，一种微流控芯片试剂盒的应用方法，其应用于任一实施例所述微流控芯片试剂盒；所述微流控芯片试剂盒的应用方法包括步骤：提供预置有提取试剂、内标干粉及目标扩增试剂的微流控芯片，所述提取试剂包括蛋白酶溶液、裂解液、清洗液及洗脱液，所述目标扩增试剂呈干粉状态，所述目标扩增试剂具有多种食源性致病的特异性引物及探针且每一所述PCR反应腔中预置有至少一种食源性致病菌的特异性引物及探针；加入样本到样本腔中，在微流控环境下进行荧光PCR检测。在其中一个实施例中，所述微流控芯片试剂盒的应用方法还包括步骤：于微流控芯片的蛋白酶溶液储存腔中预置蛋白酶溶液；于微流控芯片的混合腔中预置内标干粉；于微流控芯片的裂解液储存腔中预置裂解液；于微流控芯片的两个清洗液储存腔中分别预置两种清洗液；于微流控芯片的洗脱液储存腔中预置洗脱液；于微流控芯片的十个PCR反应腔中分别预置目标扩增试剂，所述目标扩增试剂包括PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、海藻糖、甘露醇、BSA、热启动Taq酶、逆转录酶以及检测20种食源性致病菌的特异性引物及探针，所述目标扩增试剂预制成干粉状态，且每一所述PCR反应腔中的所述目标扩增试剂包括的食源性致病菌的特异性引物及探针相异设置。在其中一个实施例中，所述20种食源性致病菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、大肠杆菌O157、大肠杆菌O104、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜水气单胞菌、产气荚膜梭菌、阪崎肠杆菌及蜡样芽孢杆菌。这样的设计，建立了上述20种食源性致病菌的微流控检测技术，与传统检测方法及市场上普通荧光PCR试剂盒相比，达到如下的检测效果：(一)多重检测：本申请所建立的检测方法能够一次同时检测上述20种食源性致病菌，能快速地鉴定样本中的相关病原菌，大大增加了检测项目通量，节省了实验时间及成本。(二)灵敏度高：本申请所建立的检测方法能够实现反应体系中20个目标基因的检测灵敏度均可达到102copies/ml，可以达到单重实时荧光PCR检测敏感度。(三)特异性高：本申请所建立的检测方法只对相应的20种食源性致病菌有扩增信号，对于其他种属相近或环境类似的致病菌则没有扩增，说明检测方法具有高度的特异性。(四)防污染：本申请所建立的检测方法使用一次性使用的全封闭微流控芯片，所有的反应过程都在芯片腔室和管道中完成，防止了PCR产物外泄的可能，大大降低核酸污染的可能性。(五)简便快速：本申请所建立的检测方法能实现只需手动加样，后续过程全部自动化进行，使检测过程大大简化，降低了人员的操作要求，并能实现从加样到出结果在2小时内完成。(六)结果易判：本申请所建立的检测方法的结果报告十分明确，大大增加结果的可读性和易判性。(七)安全性：本申请所建立的检测方法中所有的试剂预置在微流控芯片中，形成一个高封闭的体系，不存在样本或化学试剂泄露的可能性，对于操作人员或者环境安全性大大加强。(八)内标体系：本申请所建立的检测方法的体系中加入了内标，参与提取和PCR扩增，能够对整个过程进行监控，有效地防止假阴性结果的发生。

在其中一个实施例中，应用方法包括样本操作及核酸提取步骤、PCR扩增步骤以及荧光检测步骤。在其中一个实施例中，样本操作及核酸提取步骤包括：用吸头取200ul样本加入到样本腔中，样本和蛋白酶K溶液在离心力作用下经管道流入混合腔中，与内标干粉充分溶解混匀后再在离心力作用下经石蜡阀管道进入样本裂解腔，同时裂解液储存腔中的裂解液在离心力作用下也流入至样本裂解腔中，样本经裂解液充分裂解后经管道进入缓冲腔，然后在离心力的作用下流经硅胶膜，核酸与硅胶膜结合，液体则进入废液腔1；然后清洗液1储存腔和清洗液2储存腔中的清洗液依次进入缓冲腔并经过硅胶膜对核酸进行清洗纯化，清洗后的液体经选择腔进入废液腔1；最后洗脱液储存腔中的洗脱液进入缓冲腔并流经硅胶膜将核酸洗脱下来，经选择腔进入核酸腔，在离心力的作用下经核酸分发管道分别进入到10个PCR反应腔室中。在其中一个实施例中，PCR扩增步骤包括：将分发到反应腔室中的核酸与反应干粉即目标扩增试剂充分溶解后进行下一步的PCR扩增及检测，PCR反应程序为：50℃逆转录10-30min，95℃预变性1-10min；95℃变性5-15s，60℃退火延伸30-40s，40-45个循环。

下面继续给出具体应用的实施例说明上述微流控芯片试剂盒及其应用方法的检测效果。

实施例1

引物探针使用如下表2所示组合：

	FAM通道	HEX通道	ROX通道
				1号反应腔	沙门氏菌	志贺氏菌	内标
2号反应腔	金黄色葡萄球菌	单增李斯特菌	内标
				3号反应腔	霍乱弧菌O1群	霍乱弧菌O139群	内标
4号反应腔	副溶血弧菌	创伤弧菌	内标
				5号反应腔	拟态弧菌	溶藻弧菌	内标
6号反应腔	空肠弯曲菌	结肠弯曲菌	内标
				7号反应腔	大肠杆菌O157	大肠杆菌O104	内标
8号反应腔	假结核耶尔森菌	小肠结肠炎耶尔森菌	内标
				9号反应腔	嗜水气单胞菌	产气荚膜梭菌	内标
10号反应腔	阪崎肠杆菌	蜡样芽孢杆菌	内标

表2

试剂盒的操作及结果判定：

1)样本操作及核酸提取流程：用吸头取200ul样本加入到样本腔中，样本和蛋白酶K溶液在离心力作用下经管道流入混合腔中，与内标干粉充分溶解混匀后再在离心力作用下经石蜡阀管道进入样本裂解腔，同时裂解液储存腔中的裂解液在离心力作用下也流入至样本裂解腔中，样本经裂解液充分裂解后经管道进入缓冲腔，然后在离心力的作用下流经硅胶膜，核酸与硅胶膜结合，液体则进入废液腔1；然后清洗液1储存腔和清洗液2储存腔中的清洗液依次进入缓冲腔并经过硅胶膜对核酸进行清洗纯化，清洗后的液体经选择腔进入废液腔1；最后洗脱液储存腔中的洗脱液进入缓冲腔并流经硅胶膜将核酸洗脱下来，经选择腔进入核酸腔，在离心力的作用下经核酸分发管道分别进入到10个PCR反应腔室中。

2)PCR扩增：分发到反应腔室中的核酸与反应干粉充分溶解后进行下一步的PCR扩增及检测，PCR反应程序为：50℃逆转录15min，95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，40个循环。

3)结果有效性判定：所有的反应腔中PCR反应扩增后内标均应有扩增曲线，检测结果为阳性，否则实验结果无效

4)结果判读：10个反应腔分别对应20种食源性致病，仪器自动读取每个反应腔中的荧光信号值并判定阴阳性结果。

实施例2

用微流控芯片检测21个样本，其中包括20个食源性致病菌阳性样本及1个阴性样本。1号样本为沙门氏菌阳性样本，2号样本为志贺氏菌阳性样本，3号样本为金黄色葡萄球菌阳性样本，4号样本为单增李斯特菌阳性样本，5号样本为霍乱弧菌O1群阳性样本，6号样本为霍乱弧菌O139群阳性样本，7号样本为副溶血弧菌阳性样本，8号样本为创伤弧菌阳性样本，9号样本为拟态弧菌阳性样本，10号样本为溶藻弧菌阳性样本，11号样本为空肠弯曲菌阳性样本，12号样本为结肠弯曲菌阳性样本，13号样本为大肠杆菌O157阳性样本，14号样本为大肠杆菌O104阳性样本，15号样本为假结核耶尔森菌阳性样本，16号样本为小肠结肠炎耶尔森菌阳性样本，17号样本为嗜水气单胞菌阳性样本，18号样本为产气荚膜梭菌阳性样本，19号样本为阪崎肠杆菌阳性样本，20号样本为蜡样芽孢杆菌阳性样本21号样本为细菌阴性样本。按照实施例1中的操作流程进行检测，检测结果如表3所示。

表3

检测结果表明，本申请所述检测20种食源性致病菌的微流控试剂盒的特异性很好，只检测相应的食源性致病菌，不会对其他种类或型别的致病菌有交叉反应。

实施例3

使用微流控芯片检测20种食源性致病菌的质粒混合样本，将质粒样本按照一定的浓度梯度依次稀释为105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml五个浓度，进行灵敏度实验。按照实施例1中的操作流程进行检测，检测结果如下表4所示。

表4

检测结果表明，本申请所述检测20种食源性致病菌的微流控试剂盒对于所有20种食源性致病菌的灵敏度都很高，均达到了100copies/ml。

需要说明的是，本申请的其它实施例还包括，上述各实施例中的技术特征相互组合所形成的、能够实施的微流控芯片与试剂盒及其应用方法。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种微流控芯片，包括基体，所述基体具有目标旋转中心且所述基体设有定位槽、样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、核酸腔、废液腔、分发管道及至少二PCR反应腔；其特征在于，所述基体还设有蛋白酶溶液储存腔、混合腔、过滤区及选择腔；

所述过滤区包括过滤体、进液区及出液区，进液区与出液区相连通设置，过滤体填设于进液区、出液区以及进液区与出液区之间中的至少一项；进液区与出液区在位于基体底部位置的底部通道相连通设置，过滤体至少部分位于底部通道中，且进液区与出液区在位于基体上部位置间隔设置；

所述清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔；所述第一清洗液储存腔及所述第二清洗液储存腔分别连通所述缓冲腔；所述第二清洗液储存腔还连通所述第一清洗液储存腔；所述第一清洗液储存腔到所述目标旋转中心的最近距离不小于所述第二清洗液储存腔到所述目标旋转中心的最近距离；所述第二清洗液储存腔与所述缓冲腔之间的连通管道延长设置；

所述废液腔包括第一废液腔、第二废液腔及第三废液腔，所述第一清洗液储存腔还连通所述第一废液腔，所述选择腔的底部具有相对的两侧，一侧连通所述第一废液腔，另一侧通过所述核酸腔连通所述分发管道；所述洗脱液储存腔连通所述第三废液腔，所述第一废液腔邻近所述目标旋转中心的位置连通所述第二废液腔；

所述蛋白酶溶液储存腔通过所述样本腔连通所述混合腔，所述混合腔及所述裂解液储存腔分别连通所述样本裂解腔；

所述清洗液储存腔、所述样本裂解腔及所述洗脱液储存腔分别连通所述缓冲腔，所述缓冲腔通过所述过滤区连通所述选择腔；

所述分发管道分别连通各所述PCR反应腔且末端连通所述第二废液腔；

所述蛋白酶溶液储存腔、所述样本腔、所述裂解液储存腔、所述第一清洗液储存腔、所述第二清洗液储存腔、所述洗脱液储存腔、所述核酸腔、所述第一废液腔、所述第三废液腔中的至少一项设有用于连通外界环境的通气口；

按与所述目标旋转中心的最近距离从小到大的顺序排列为：所述样本腔、所述蛋白酶溶液储存腔、所述混合腔、所述裂解液储存腔、所述样本裂解腔、所述第一清洗液储存腔、所述第二清洗液储存腔、所述洗脱液储存腔、所述缓冲腔、所述选择腔、所述第一废液腔、所述核酸腔、所述分发管道、所述第二废液腔、各所述PCR反应腔及所述第三废液腔；所述第一废液腔与所述目标旋转中心的最近距离小于所述选择腔与所述目标旋转中心的最近距离且不大于所述核酸腔与所述目标旋转中心的最近距离；所述第二废液腔与所述目标旋转中心的最近距离大于所述洗脱液储存腔与所述目标旋转中心的最近距离；所述第三废液腔与所述目标旋转中心的最远距离最大；所述洗脱液储存腔连通所述第三废液腔的位置到所述目标旋转中心的最近距离，小于所述洗脱液储存腔连通所述缓冲腔的位置到所述目标旋转中心的最近距离。

2.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，于所述第一清洗液储存腔与所述第一废液腔之间的连通管道中设有第二石蜡阀。

3.根据权利要求2所述微流控芯片，其特征在于，于所述第一清洗液储存腔与所述第二石蜡阀之间还设有缓冲区。

4.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述样本裂解腔包括第一样本裂解腔及第二样本裂解腔；所述第一样本裂解腔及所述第二样本裂解腔于邻近所述目标旋转中心处相连通设置，所述混合腔及所述裂解液储存腔分别连通所述第一样本裂解腔，所述第一样本裂解腔及所述第二样本裂解腔分别连通所述缓冲腔。

5.根据权利要求4所述微流控芯片，其特征在于，所述裂解液储存腔与所述第一样本裂解腔之间的连通管道、所述第一样本裂解腔与所述缓冲腔之间的连通管道、所述第一清洗液储存腔与所述第二清洗液储存腔之间的连通管道、所述第一清洗液储存腔与所述第一废液腔之间的连通管道、所述核酸腔与所述分发管道之间的连通管道、所述洗脱液储存腔与所述第二废液腔之间的连通管道，分别设有防逆流结构。

6.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，于所述混合腔与所述样本裂解腔之间的连通管道中设有第一石蜡阀。

7.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述定位槽包括第一定位槽、第二定位槽及第三定位槽，所述第一定位槽、所述第二定位槽及所述第三定位槽分别用于定位安装所述微流控芯片。

8.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述过滤体包括硅胶膜或者柱状体，所述柱状体填设有硅胶膜或者所述柱状体设有至少二硅胶膜层。

9.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述PCR反应腔的数量为十个。

10.一种微流控芯片试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至9中任一项所述微流控芯片，且于各所述PCR反应腔中设有干粉状态的目标扩增试剂。

11.根据权利要求10所述微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片还预置有提取试剂，所述提取试剂包括蛋白酶溶液、内标干粉、裂解液、洗脱液及两种清洗液；各所述PCR反应腔中设有相异的目标扩增试剂，每一所述目标扩增试剂用于检测对应的两种食源性致病菌。

12.一种微流控芯片试剂盒的应用方法，其特征在于，应用于权利要求10或11所述微流控芯片试剂盒；所述微流控芯片试剂盒的应用方法包括步骤：

提供预置有提取试剂、内标干粉及目标扩增试剂的微流控芯片，所述提取试剂包括蛋白酶溶液、裂解液、清洗液及洗脱液，所述目标扩增试剂呈干粉状态，所述目标扩增试剂具有多种食源性致病的特异性引物及探针且每一所述PCR反应腔中预置有至少一种食源性致病菌的特异性引物及探针；

加入样本到样本腔中，在微流控环境下进行荧光PCR检测。

13.根据权利要求12所述微流控芯片试剂盒的应用方法，其特征在于，还包括步骤：

于微流控芯片的蛋白酶溶液储存腔中预置蛋白酶溶液；

于微流控芯片的混合腔中预置内标干粉；

于微流控芯片的裂解液储存腔中预置裂解液；

于微流控芯片的两个清洗液储存腔中分别预置两种清洗液；

于微流控芯片的洗脱液储存腔中预置洗脱液；

于微流控芯片的十个PCR反应腔中分别预置目标扩增试剂，所述目标扩增试剂包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、海藻糖、甘露醇、BSA、热启动Taq酶、逆转录酶以及检测20种食源性致病菌的特异性引物及探针，所述目标扩增试剂预制成干粉状态，且每一所述PCR反应腔中的所述目标扩增试剂包括的食源性致病菌的特异性引物及探针相异设置。

14.根据权利要求13所述微流控芯片试剂盒的应用方法，其特征在于，所述20种食源性致病菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、大肠杆菌O157、大肠杆菌O104、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜水气单胞菌、产气荚膜梭菌、阪崎肠杆菌及蜡样芽孢杆菌。

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