CN112126715B - 犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法 - Google Patents

犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112126715B
CN112126715B CN202010841954.0A CN202010841954A CN112126715B CN 112126715 B CN112126715 B CN 112126715B CN 202010841954 A CN202010841954 A CN 202010841954A CN 112126715 B CN112126715 B CN 112126715B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cavity
canine
sample
final concentration
infectious virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010841954.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112126715A (zh
Inventor
游腾飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Chenghui Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Chenghui Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Chenghui Medical Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Chenghui Medical Technology Co ltd
Priority to CN202010841954.0A priority Critical patent/CN112126715B/zh
Publication of CN112126715A publication Critical patent/CN112126715A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112126715B publication Critical patent/CN112126715B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法，每一PCR反应腔中容置内标试剂及至少一种犬传染性病毒检测试剂，且各PCR反应腔中的犬传染性病毒检测试剂的种类相异设置。所有的反应过程都在芯片腔室和管道中完成，防止了PCR产物或样本外泄的可能，大大降低核酸污染的可能性，能够一次同时检测多种犬传染性病毒，同时有效地防止假阴性结果的发生，且具有高度的特异性，可以达到单重实时荧光PCR检测敏感度；有利于快速地鉴定样本中的相关病原体，大大增加了检测项目通量，从加样到出结果在2小时内完成，节省了实验时间及成本，不存在样本或化学试剂泄漏的可能性，对于操作人员或者环境的安全性大大加强。

Description

犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法
技术领域
本申请涉及犬传染性病毒检测领域，特别是涉及犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法。
背景技术
随着当今社会经济水平的发展和人们精神水平的提高，越来越多的动物成为我们生活中的伙伴，其中犬类占了绝大多数。与此同时，犬类病毒性疾病的发生率也在逐渐提高，每年犬类的发病治疗费用已达数个亿之多。
然而与此对应的宠物医疗行业的疾病检测技术水平普遍较低，犬的常发病和新发病也在呈逐年上升趋势，常见犬类传染性病毒包括狂犬病病毒(rabies virus,RaV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PsrV)、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬冠状病毒(Canine coronavirus,CcoV)、犬轮状病毒(canine rotavirus,CroV)、犬疱疹病毒(Canine herpesvirus,CheV)、犬腺病毒I型(Canine adenovirus 1,CadV1)、犬腺病毒II型(Canine adenovirus 2,CadV2)、犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)、犬副流感病毒(Canine Parainfluenza Virus,CPIV)、呼肠孤病毒(Canine Reovirus,CreV)、犬杯状病毒(Canine calicivirus,CcaV)等数十种，这些可传染性病毒对犬类的健康危害巨大，有些病毒对犬只的致死率达到50％以上，严重影响着宠物业的健康可持续发展。
此外，犬类传染性病毒存在人兽共患的风险，同时由于病毒变异的迅速性，严重威胁到了人们的身体健康，因此为了有效防止犬类病毒性疾病的蔓延扩大，研制快速、准确诊断疾病的新技术、新方法，对防控犬病毒性疾病的发生，保证犬类健康和确保人们的身体健康具有重要的现实意义。
实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)技术是一项目前广泛应用于病原体检测的先进技术。使用核酸提取试剂提取样品总核酸，在高效反转录酶的作用下，以RNA为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在热启动酶的作用下，经变性、退火及延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大一倍，针对犬传染性病毒保守基因片段设计的特异Taqman探针与扩增的DNA杂交，利用Taq聚合酶的5'→3'外切活性，将5'端荧光基团从探针上切割下来，使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号，利用仪器检测特异性荧光信号，根据扩增曲线和Ct值判定检测结果。
目前针对犬传染性病毒的检测方法主要有免疫法和荧光PCR法。免疫法是通过抗原抗体的特异性结合来检测目的蛋白；荧光PCR方法是在PCR过程中通过检测荧光信号的实时变化，对目的基因进行检测分析。免疫法检测试剂的检测对象为样本中病毒产生的抗体，相比于直接的病原检测具有很长的窗口期，对于疾病的早起筛查作用有限，且其灵敏度及检测特异性都相对较低，结果容易错判。市场上针对犬传染性病毒的荧光PCR检测试剂盒有很多，其灵敏度和特异性相较免疫法有了明显的提升。此类试剂盒的使用包括病毒样本核酸提取和荧光PCR扩增两个过程，其中核酸提取过程操作繁琐费时，且试剂盒整个使用过程中对场地要求高，样本处理、试剂配制及PCR扩增需严格分区，对防污染及操作人员的专业技能也有很高的要求；此外，此类荧光PCR试剂盒基本上只能针对一种病原体进行检测，一个样本进行多项检测则比较繁琐且成本较高，不利于此类试剂盒在宠物医院中的推广。
微流控芯片(microfluidics)亦称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米甚至更小的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗样本和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析，并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。
目前尚未发现微流控芯片中采用实时荧光定量PCR进行多种犬传染性病毒检测的设计。
发明内容
基于此，有必要提供一种犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法。
一种犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，包括基体，所述基体具有目标旋转中心且所述基体设有多个腔室，所述多个腔室包括样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、核酸腔、废液腔及至少二PCR反应腔，各所述腔室通过微流控管道连通；每一所述PCR反应腔中容置PCR扩增反应试剂，所述PCR扩增反应试剂包括内标试剂及至少一种犬传染性病毒检测试剂，且各所述PCR反应腔中的所述犬传染性病毒检测试剂的种类相异设置。
上述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，所有的反应过程都在芯片腔室和管道中完成，防止了PCR产物或样本外泄的可能，大大降低核酸污染的可能性，能够一次同时检测多种犬传染性病毒，同时有效地防止假阴性结果的发生，且具有高度的特异性，检测灵敏度均可达到100copies/ml，可以达到单重实时荧光PCR检测敏感度；有利于快速地鉴定样本中的相关病原体，大大增加了检测项目通量，实现从加样到出结果在2小时内完成，节省了实验时间及成本，不存在样本或化学试剂泄露的可能性，对于操作人员或者环境的安全性大大加强。
在其中一个实施例中，每一所述PCR反应腔中的所述PCR扩增反应试剂包括两种犬传染性病毒检测试剂。
在其中一个实施例中，所述PCR反应腔的数量为5至10中的一项。
在其中一个实施例中，所述PCR反应腔的数量为6，且各所述PCR反应腔中的所述犬传染性病毒检测试剂的犬传染性病毒种类包括：狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应试剂包括PCR缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2、海藻糖、甘露醇、牛血清蛋白、热启动酶、逆转录酶、犬传染性病毒引物及探针、内标引物及探针。
在其中一个实施例中，所述犬传染性病毒引物及所述内标引物在PCR扩增体系中的终浓度分别为50nM至1000nM；所述探针在PCR扩增体系中的终浓度为25nM至500nM；所述海藻糖在PCR扩增体系中的终浓度为2％至15％；所述甘露醇在PCR扩增体系中的终浓度为0.5％至5％；所述牛血清蛋白在PCR扩增体系中的终浓度为0.2％至5％；所述dATP、dTTP、dCTP、dGTP在PCR扩增体系中的终浓度为0.1mM至5mM；所述MgCl2在PCR扩增体系中的终浓度为1mM至10mM；所述热启动酶在PCR扩增体系中的终浓度为0.5U至5U；所述逆转录酶在PCR扩增体系中的终浓度为5U至50U。
在其中一个实施例中，所述样本裂解腔中容置裂解液，所述裂解液中盐酸胍的终浓度为2M至6M，无水乙醇的终浓度为30％至50％，Tris-HCl的终浓度为10mM至30mM，曲拉通100的终浓度为5％至20％；
所述清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔，每一所述清洗液储存腔中容置清洗液，所述第一清洗液储存腔中盐酸胍的终浓度为1M至5M，无水乙醇的终浓度为37％至50％；所述第二清洗液储存腔中Tris-HCl的终浓度为5mM至20mM，NaCl的终浓度为50mM至200mM，无水乙醇的终浓度为50％至80％；
所述洗脱液储存腔中容置洗脱液，所述洗脱液储存腔中Tris-HCl的终浓度为5mM至20mM，EDTA的终浓度为0.1mM至2mM。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应试剂呈干粉状态。
在其中一个实施例中，所述样本腔中预置有内标质粒干粉。
一种犬传染性病毒微流控芯片试剂盒的应用方法，其应用于任一项所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒；所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒的应用方法包括步骤：提供预置有提取试剂及PCR扩增反应试剂的犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，所述提取试剂包括裂解液、清洗液及洗脱液，所述PCR扩增反应试剂呈干粉状态；加入样本到样本腔中，在微流控环境下进行PCR扩增反应及荧光PCR检测。
附图说明
图1为本申请犬传染性病毒微流控芯片试剂盒一实施例的结构示意图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本申请的说明书所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
除非另有定义，本申请的说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本申请。本申请的说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为解决现有技术的诸多缺陷，本申请提供一种同时检测12种犬传染性病毒的快速且准确的试剂盒及检测方法，本申请提供的试剂盒及检测方法对操作环境、人员技能等要求低，高度自动化、耗时少的同时又能兼顾检测的特异性及灵敏度等性能指标。
在本申请一个实施例中，一种犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，包括基体，所述基体具有目标旋转中心且所述基体设有多个腔室，所述多个腔室包括样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、核酸腔、废液腔及至少二PCR反应腔，各所述腔室通过微流控管道连通；每一所述PCR反应腔中容置PCR扩增反应试剂，所述PCR扩增反应试剂包括内标试剂及至少一种犬传染性病毒检测试剂，且各所述PCR反应腔中的所述犬传染性病毒检测试剂的种类相异设置。上述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，所有的反应过程都在芯片腔室和管道中完成，防止了PCR产物或样本外泄的可能，大大降低核酸污染的可能性，能够一次同时检测多种犬传染性病毒，同时有效地防止假阴性结果的发生，且具有高度的特异性，检测灵敏度均可达到100copies/ml，可以达到单重实时荧光PCR检测敏感度；有利于快速地鉴定样本中的相关病原体，大大增加了检测项目通量，实现从加样到出结果在2小时内完成，节省了实验时间及成本，不存在样本或化学试剂泄露的可能性，对于操作人员或者环境的安全性大大加强。
在其中一个实施例中，每一所述PCR反应腔中容置PCR扩增反应试剂，所述PCR扩增反应试剂包括内标试剂及至少一种犬传染性病毒检测试剂，且各所述PCR反应腔中的所述犬传染性病毒检测试剂的种类相异设置。在其中一个实施例中，每一所述PCR反应腔中的所述PCR扩增反应试剂包括两种犬传染性病毒检测试剂。亦即，每一PCR反应腔中设有相异的两种犬传染性病毒检测试剂，当有五个PCR反应腔时，则可以同时检测十种犬传染性病毒检测试剂。为了避免混淆，PCR反应腔中犬传染性病毒检测试剂的种类通常不超过三种为佳。在其中一个实施例中，所述PCR反应腔的数量为5至10中的一项。即，犬传染性病毒微流控芯片试剂盒设有5、6、7、8、9或10个PCR反应腔。考虑到目前市场上还没有同时检测以上12种犬传染性病毒的检测方法，在其中一个实施例中，所述PCR反应腔的数量为6，且各所述PCR反应腔中的所述犬传染性病毒检测试剂的犬传染性病毒种类包括：狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒。这样的设计，有利于一次性快速检测多种例如12种犬传染性病毒，所有的反应过程都在芯片腔室和管道中完成，防止了PCR产物或样本外泄的可能，大大降低核酸污染的可能性，能够一次同时检测多种犬传染性病毒，同时有效地防止假阴性结果的发生。
为解决试剂储存的便捷性，进一步地，在其中一个实施例中，将PCR扩增反应试剂制备为冻干粉预置在微流控芯片中，作为所述微流控芯片试剂盒，以实现4℃低温或常温保存。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应试剂包括PCR缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2、海藻糖、甘露醇、牛血清蛋白、热启动酶、逆转录酶、犬传染性病毒引物及探针、内标引物及探针。探针标记有不同的荧光基团，能够在同一个反应体系中混合多重引物探针，实现同时检测多个目标。各实施例中，引物包括所述犬传染性病毒引物及所述内标引物。各实施例中，热启动酶即热启动Taq酶。在其中一个实施例中，所述犬传染性病毒引物及所述内标引物在PCR扩增体系中的终浓度分别为50nM至1000nM；所述探针在PCR扩增体系中的终浓度为25nM至500nM；所述海藻糖在PCR扩增体系中的终浓度为2％至15％；所述甘露醇在PCR扩增体系中的终浓度为0.5％至5％；所述牛血清蛋白在PCR扩增体系中的终浓度为0.2％至5％；所述dATP、dTTP、dCTP、dGTP在PCR扩增体系中的终浓度为0.1mM至5mM；所述MgCl2在PCR扩增体系中的终浓度为1mM至10mM；所述热启动酶在PCR扩增体系中的终浓度为0.5U至5U；所述逆转录酶在PCR扩增体系中的终浓度为5U至50U。在其中一个实施例中，所述样本裂解腔中容置裂解液，所述裂解液中盐酸胍的终浓度为2M至6M，无水乙醇的终浓度为30％至50％，Tris-HCl的终浓度为10mM至30mM，曲拉通100的终浓度为5％至20％；所述清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔，每一所述清洗液储存腔中容置清洗液，所述第一清洗液储存腔中盐酸胍的终浓度为1M至5M，无水乙醇的终浓度为37％至50％；所述第二清洗液储存腔中Tris-HCl的终浓度为5mM至20mM，NaCl的终浓度为50mM至200mM，无水乙醇的终浓度为50％至80％；所述洗脱液储存腔中容置洗脱液，所述洗脱液储存腔中Tris-HCl的终浓度为5mM至20mM，EDTA的终浓度为0.1mM至2mM。在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应试剂呈干粉状态即干粉态。PCR缓冲液以干粉状态存在，即PCR缓冲液干粉。在其中一个实施例中，所述样本腔中预置有内标质粒干粉。这样的设计，有利于预置所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒且相对于液态试剂延长保质期。
在其中一个实施例中，一种犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其包括以下实施例的部分结构或全部结构；即，所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒包括以下的部分技术特征或全部技术特征。在其中一个实施例中，一种犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，包括基体，所述基体具有目标旋转中心且所述基体设有多个腔室，所述多个腔室包括样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、核酸腔、废液腔及至少二PCR反应腔，各所述腔室通过微流控管道连通。可以理解的是，各所述腔室通过微流控管道连通，可参考传统技术例如深圳市刚竹医疗科技有限公司的相关产品或专利。进一步地，在其中一个实施例中，所述基体设有用于过滤的过滤区。进一步地，在其中一个实施例中，各所述腔室通过微流控管道连通，具体为或包括：样本腔及裂解液储存腔分别通过微流控管道连通样本裂解腔；清洗液储存腔、样本裂解腔及洗脱液储存腔分别通过微流控管道连通缓冲腔，缓冲腔分别通过微流控管道连通过滤区及废液腔；过滤区通过微流控管道连通选择腔；选择腔的底部具有相对的两侧，一侧通过微流控管道连通废液腔，另一侧通过微流控管道连通核酸腔；核酸腔通过微流控管道分别连通各PCR反应腔及废液腔。进一步地，在其中一个实施例中，所述基体还设有连通所述样本腔的加样孔，用于将样品通过加样孔加入到样本腔中。
为了控制过滤，进一步地，在其中一个实施例中，过滤区内设有过滤体，在其中一个实施例中，过滤体包括硅胶膜或者柱状体，柱状体填设有硅胶膜或者柱状体设有至少二硅胶膜层；进一步地，在其中一个实施例中，过滤区包括过滤体、进液区及出液区，进液区与出液区相连通设置，过滤体填设于进液区、出液区以及进液区与出液区之间中的至少一项。进液区与出液区在位于基体底部位置的底部通道相连通设置，过滤体至少部分位于底部通道中。进液区与出液区在位于基体上部位置间隔设置。过滤体亦可设置于进液区或出液区中。进一步地，在其中一个实施例中，进液区及出液区形成一个U形槽。这样的设计，有利于提升清洗及洗脱效果，清洗液或洗脱液在具有一定体积后才从出液区流入废液腔例如第一废液腔或核酸腔中。进一步地，在其中一个实施例中，所述基体设有定位槽，定位槽用于定位安装犬传染性病毒微流控芯片试剂盒。在其中一个实施例中，所述定位槽包括第一定位槽、第二定位槽及第三定位槽，第一定位槽、第二定位槽及第三定位槽分别用于定位安装犬传染性病毒微流控芯片试剂盒亦可简称为微流控芯片。进一步地，在其中一个实施例中，核酸腔所连通各PCR反应腔及废液腔的微流控管道作为分发管道，核酸腔通过分发管道分别连通各PCR反应腔且于分发管道的末端连通废液腔。
为了控制样本释放，进一步地，在其中一个实施例中，于样本腔与样本裂解腔之间的微流控管道中设有第一石蜡阀。第一石蜡阀用于在一定温度下熔化以控制样本腔与样本裂解腔的连通。进一步地，在其中一个实施例中，样本腔与样本裂解腔之间的微流控管道凸向所述目标旋转中心设置，以达成一定的限流效果。在其中一个实施例中，清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔；第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔分别连通缓冲腔；第二清洗液储存腔还连通第一清洗液储存腔。必要时还可以增加清洗液储存腔的数量。在其中一个实施例中，第一清洗液储存腔还连通废液腔，且于第一清洗液储存腔与废液腔之间的微流控管道中设有第二石蜡阀。第二石蜡阀用于在一定温度下熔化以控制第一清洗液储存腔与废液腔的连通。在其中一个实施例中，废液腔包括第一废液腔、第二废液腔及第三废液腔；选择腔的底部一侧连通第一废液腔；洗脱液储存腔连通第三废液腔，且洗脱液储存腔连通第三废液腔的位置到目标旋转中心的最近距离，小于洗脱液储存腔连通缓冲腔的位置到目标旋转中心的最近距离；分发管道的末端连通第二废液腔。清洗液储存腔或第一清洗液储存腔连通第二废液腔。进一步地，在其中一个实施例中，样本裂解腔包括第一样本裂解腔及第二样本裂解腔；第一样本裂解腔及第二样本裂解腔于邻近目标旋转中心处相连通设置，样本腔及裂解液储存腔分别连通第一样本裂解腔，第二样本裂解腔连通缓冲腔。设计选择腔是为了增大科里奥利力作用在液体的时间，从而让液体在做通道转换时更为可靠，例如在一定转速的逆时针转动状态下，释放第一清洗液，对过滤区的硅胶膜上的DNA进行清洗后，在科里奥利力的作用下进入第一废液腔；然后释放第二清洗液，进行清洗后，在科里奥利力的作用下进入第一废液腔；再将离心方向改为顺时针旋转，在一定转速的顺时针转动状态下，释放洗脱液浸泡硅胶膜，提升到一定转速，洗脱硅胶膜后的洗脱液在科里奥利力的作用下流入核酸腔中。
在其中一个实施例中，犬传染性病毒微流控芯片试剂盒如图1所示，其包括基体100，基体100具有目标旋转中心且基体100设有加样孔101、样本腔102、裂解液储存腔110、样本裂解腔111、第一石蜡阀103、第一清洗液储存腔104、第二清洗液储存腔105、洗脱液储存腔112、缓冲腔113、过滤区114、过滤体115、选择腔106、第二石蜡阀107、核酸腔116、第一废液腔108、第二废液腔109、第三废液腔118及六个PCR反应腔117；目标旋转中心可以在基体上亦可在基体外，根据基体的形状而定。样本裂解腔111包括第一样本裂解腔及第二样本裂解腔；第一样本裂解腔及第二样本裂解腔于邻近目标旋转中心处相连通设置，第一石蜡阀103设于样本腔102与样本裂解腔111之间的微流控管道中；洗脱液储存腔112连通第三废液腔118且洗脱液储存腔112连通第三废液腔118的位置到目标旋转中心的最近距离，小于洗脱液储存腔112连通缓冲腔113的位置到目标旋转中心的最近距离；第一清洗液储存腔104、第二清洗液储存腔105、第一样本裂解腔、第二样本裂解腔及洗脱液储存腔112分别连通缓冲腔113，缓冲腔113通过过滤区114连通选择腔106；第二清洗液储存腔105还连通第一清洗液储存腔104。选择腔106的底部具有相对的两侧，一侧连通第一废液腔108，另一侧通过核酸腔116通过分发管道分别连通各PCR反应腔117且末端连通第二废液腔109。第一清洗液储存腔104还连通第一废液腔108，且于第一清洗液储存腔104与第一废液腔208之间的微流控管道中设有第二石蜡阀107。按与目标旋转中心的最近距离从小到大的顺序排列为：样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、选择腔、核酸腔及各PCR反应腔，且第二废液腔及第三废液腔与目标旋转中心的最远距离最大。如图1所示，裂解液储存腔110与样本裂解腔111之间的微流控管道、样本裂解腔111与缓冲腔113之间的微流控管道、第一清洗液储存腔104与第二清洗液储存腔105之间的微流控管道、第一清洗液储存腔104与第一废液腔107之间的微流控管道、核酸腔116与分发管道或PCR反应腔之间的微流控管道、洗脱液储存腔112与第三废液腔118之间的微流控管道，分别设有防逆流结构。
在一个具体应用的实施例中，一种检测12种犬传染性病毒的微流控芯片试剂盒包括主动控制流路的核酸提取和扩增的离心微流控芯片、预装核酸提取试剂、预装PCR扩增冻干粉试剂、内标；微流控芯片核酸提取部分包括样本腔、样本裂解腔、裂解液储存腔、第一清洗液储存腔、第二清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、选择腔和废液腔，每个腔室都有相应管道连通；微流控芯片核酸扩增部分包括一条出样主流道及若干分样流道，各分样流道对应一个反应腔室，能保证将相同体积的核酸样本分装到各个反应腔室中。所述微流控芯片的核酸提取部分的不同腔室中分别预装有不同的提取液，其中样本腔中预置内标干粉，裂解液储存腔中预置裂解液液体试剂，第一清洗液储存腔中预置有第一清洗液的液体试剂，第二清洗液储存腔中预置有第二清洗液的液体试剂，洗脱液储存腔中预置有洗脱液液体试剂；所述微流控芯片的核酸扩增部分的包括若干个反应腔室，各反应腔室之间相互独立，各个反应腔室中分别预置有检测12种犬传染性病毒的检测试剂干粉。
在其中一个实施例中，所述提取试剂包括裂解液、清洗液及洗脱液；可以理解的是，所述样本裂解腔中容置裂解液；所述清洗液储存腔中容置清洗液；所述洗脱液储存腔中容置洗脱液。对于具有两个清洗液储存腔，即第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔的犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，所述提取试剂包括裂解液、第一清洗液、第二清洗液及洗脱液；可以理解的是，所述第一清洗液储存腔中容置第一清洗液；所述第二清洗液储存腔中容置第二清洗液。在其中一个实施例中，所述提取试剂的成分包括：
裂解液：盐酸胍、无水乙醇、SDS、曲拉通；
第一清洗液：盐酸胍、NaCl、Tris-HCl、无水乙醇；
第二清洗液：NaCl、无水乙醇；
洗脱液：Tris-HCl、EDTA。
在其中一个实施例中，所述扩增试剂的成分包括：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、海藻糖、甘露醇、BSA、热启动酶、逆转录酶以及检测20种食源性致病的引物和探针，包括狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒的特异性引物及TaqMan探针；其中，PCR缓冲液为干粉型，即干粉型缓冲液。
在其中一个实施例中，所述扩增试剂配制混合后经过冻干工艺制成干粉形态，冻干工艺采用如下表1所示冻干方式实现。
阶段 温度 升降温时间 保持时间 真空(Pa)
预冻 -50℃ 2h 4h /
一次干燥 -45℃ 1h 4h 10
-25℃ 1h 4h 10
二次干燥 / 1h / 5
-10℃ 1h 2h 5
0℃ 20min 4h 5
25℃ 1h 2h 5
表1
冻干完成后，将干粉预置到微流控芯片的各个反应腔室，对于6个PCR反应腔的实施例，即为将干粉预置到微流控芯片的1-6号反应腔中。
进一步地，在其中一个实施例中，所述犬传染性病毒检测试剂包括特异性的犬传染性病毒引物序列：狂犬病病毒，SEQ1-2；伪狂犬病病毒SEQ4-5；犬细小病毒SEQ7-8；犬冠状病毒SEQ10-11；犬轮状病毒SEQ13-14；犬疱疹病毒SEQ16-17；犬腺病毒I型SEQ19-20；犬腺病毒II型SEQ22-23；犬瘟热病毒SEQ25-26；犬副流感病毒SEQ28-29；呼肠孤病毒SEQ31-32；犬杯状病毒SEQ34-35；
所述犬传染性病毒检测试剂包括特异性的犬传染性病毒探针(即TaqMan探针)序列：狂犬病病毒，SEQ3；伪狂犬病病毒SEQ6；犬细小病毒SEQ9；犬冠状病毒SEQ12；犬轮状病毒SEQ15；犬疱疹病毒SEQ18；犬腺病毒I型SEQ21；犬腺病毒II型SEQ24；犬瘟热病毒SEQ27；犬副流感病毒SEQ30；呼肠孤病毒SEQ33；犬杯状病毒SEQ36；
所述内标试剂包括内标特异性引物SEQ37-38；以及内标特异性TaqMan探针SEQ39。
各特异性引物及探针序列如下表2所示。
表2
在一个具体应用的实施例中，一种检测12种犬传染性病毒的犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，该犬传染性病毒微流控芯片试剂盒能完成从核酸提取到PCR核酸扩增的全自动操作，包括核酸提取的各腔室与连接各腔室的微流控管道；核酸PCR扩增的核酸分发管道及若干反应腔室；各腔室包括用于核酸自动提取的样本腔、样本裂解腔、裂解液储存腔、第一清洗液储存腔、第二清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、硅胶膜、选择腔、核酸腔、废液腔，各腔室之间彼此相互独立，通过相应的微流控管道连接。微流控芯片腔室还包括用于核酸PCR扩增检测的若干个反应腔室及分发核酸的微流控管道，各个反应腔室之间彼此独立，通过核酸分发管道连接。所述反应腔室至少包括6个，各反应腔室中均预置有用于扩增2种犬传染性病毒及1个内标的PCR扩增试剂干粉即所述PCR扩增反应干粉，该试剂干粉包括用于扩增相应犬传染性病毒的引物和TaqMan探针以及用于监控整个核酸检测过程的内标引物探针；预置于各个反应腔室中的试剂干粉能够扩增以下12种犬传染性病毒中的两种，并且，所有反应腔室中的试剂干粉扩增出的犬传染性病毒能够包涵以下12种犬传染性病毒：狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒。在其中一个实施例中，微流控芯片中预置有核酸提取的液体试剂的腔室包括裂解液储存腔、第一清洗液储存腔、第二清洗液储存腔和洗脱液储存腔，分别预置有裂解液、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液。在其中一个实施例中，所述裂解液中盐酸胍的终浓度为2M至6M；无水乙醇的终浓度为30％至50％；Tris-HCl的终浓度为10mM至30mM；曲拉通100的终浓度为5％至20％；所述清洗液1中盐酸胍的终浓度为1M至5M；无水乙醇的终浓度为37％至50％；所述清洗液2中Tris-HCl的终浓度为5mM至20mM；NaCl的终浓度为50mM至200mM；无水乙醇的终浓度为50％至80％；所述洗脱液中Tris-HCl的终浓度为5mM至20mM；EDTA的终浓度为0.1mM至2mM。在其中一个实施例中，样本腔中预置有内标质粒干粉。在其中一个实施例中，所述预置在反应腔室中的反应干粉包括PCR缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2、海藻糖、甘露醇、牛血清蛋白、热启动酶、逆转录酶、犬传染性病毒及内标的引物探针。在其中一个实施例中，所述犬传染性病毒引物及所述内标引物在PCR扩增体系中的终浓度分别为50nM至1000nM；所述TaqMan探针在PCR扩增体系中的终浓度为25nM至500nM；所述海藻糖在PCR扩增体系中的终浓度为2％至15％；所述甘露醇在PCR扩增体系中的终浓度为0.5％至5％；所述牛血清蛋白在PCR扩增体系中的终浓度为0.2％至5％；所述dATP、dTTP、dCTP、dGTP在PCR扩增体系中的终浓度为0.1mM至5mM；所述MgCl2在PCR扩增体系中的终浓度为1mM至10mM；所述热启动酶在PCR扩增体系中的终浓度为0.5U至5U；所述逆转录酶在PCR扩增体系中的终浓度为5U至50U。在其中一个实施例中，所述试剂盒芯片为扇形形状，从上至下分为核酸提取功能区与核酸PCR扩增检测区两部分，其中：核酸提取功能区包括样本腔、样本裂解腔、裂解液储存腔、第一清洗液储存腔、第二清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、硅胶膜、选择腔、核酸腔、废液腔；所述腔室根据试剂加载顺序，其排布如下：样本腔通过石蜡阀和样本裂解腔连接，裂解液储存腔通过虹吸阀与样本裂解腔连接，样本裂解腔通过虹吸阀与缓冲腔连接，虹吸阀为具有特定形状结构的微流控管道，第一清洗液储存腔、第二清洗液储存腔和洗脱液储存腔分别通过微流控管道与缓冲腔相连，三个腔室均与废液腔相连，缓冲腔通过管道与硅胶膜相连，然后通过选择腔连接第一废液腔和核酸腔。核酸PCR扩增检测区包括至少6个独立的反应腔和核酸分发管道；所述核酸分发管道与核酸腔和第二废液腔相连，所述PCR反应腔具有扁平圆形状，通过毛细阀与核酸分发管道相连。
在其中一个实施例中，一种犬传染性病毒微流控芯片试剂盒的应用方法，其应用于任一实施例所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒；所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒的应用方法包括步骤：提供预置有提取试剂及PCR扩增反应试剂的犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，所述提取试剂包括裂解液、清洗液及洗脱液，所述PCR扩增反应试剂呈干粉状态；加入样本到样本腔中，在微流控环境下进行PCR扩增反应及荧光PCR检测。上述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒的应用方法，所有的反应过程都在芯片腔室和管道中完成，防止了PCR产物或样本外泄的可能，大大降低核酸污染的可能性，能够一次同时检测多种犬传染性病毒，同时有效地防止假阴性结果的发生，且具有高度的特异性，检测灵敏度均可达到100copies/ml，可以达到单重实时荧光PCR检测敏感度；有利于快速地鉴定样本中的相关病原体，大大增加了检测项目通量，实现从加样到出结果在2小时内完成，节省了实验时间及成本，不存在样本或化学试剂泄露的可能性，对于操作人员或者环境的安全性大大加强。在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应包括：分发到反应腔室中的核酸与反应用的PCR扩增反应试剂干粉充分溶解后，进行PCR反应以作下一步的PCR扩增及检测，PCR反应程序为：48℃逆转录10min至30min，95℃预变性1min至10min；95℃变性5s至15s，60℃退火延伸30s至40s，40至45个循环。在一个具体应用的实施例中，针对狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒的相应基因的保守序列分别设计特异性引物探针，能够特异性地检测出相应的病毒。探针标记有不同的荧光基团，能够在同一个反应体系中混合多重引物探针，实现同时检测多个目标。这样的设计，在微流控芯片中同时预置有核酸提取试剂和PCR扩增试剂，只需加入样本一步操作即能通过仪器操作得到最终的检测结果，实现检测的高度自动化。
下面继续给出一些具体应用的实施例说明上述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法的检测效果。
实施例1
引物及探针使用如下表3所示组合：
FAM通道 HEX通道 ROX通道
1号反应腔 狂犬病病毒 伪狂犬病病毒 内标
2号反应腔 犬细小病毒 犬冠状病毒 内标
3号反应腔 犬轮状病毒 犬疱疹病毒 内标
4号反应腔 犬腺病毒I型 犬腺病毒II型 内标
5号反应腔 犬瘟热病毒 犬副流感病毒 内标
6号反应腔 呼肠孤病毒 犬杯状病毒 内标
表3
试剂盒的操作及结果判定：
1)样本操作及核酸提取流程
用吸头取200μl样本通过加样孔加入到样本腔中，样本与预置到样本腔中的内标混合，两者混合后与内标干粉充分溶解混匀，之后第一石蜡阀打开后，再在离心力作用下经微流控管道进入样本裂解腔，同时裂解液储存腔中的裂解液在离心力作用下也流入至样本裂解腔中，样本经裂解液充分裂解后经微流控管道进入缓冲腔，然后在离心力的作用下流经过滤区的硅胶膜，核酸与硅胶膜结合，液体则进入第一废液腔；然后第一清洗液储存腔和第二清洗液储存腔中的清洗液依次进入缓冲腔并经过硅胶膜对核酸进行清洗纯化，清洗后的液体经选择腔进入第一废液腔；最后洗脱液储存腔中的洗脱液进入缓冲腔并流经硅胶膜将核酸洗脱下来，经选择腔进入核酸腔，在离心力的作用下经核酸的分发管道分别进入到1-6号PCR反应腔中，各PCR反应腔容置有PCR扩增反应试剂，所述PCR扩增反应试剂包括内标试剂及两种犬传染性病毒检测试剂，且各种犬传染性病毒检测试剂的相异设置，所采用12种犬传染性病毒检测试剂中的犬传染性病毒种类包括：狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒；所述PCR扩增反应试剂设有对应的犬传染性病毒引物及探针。
2)PCR扩增
分发到各PCR反应腔室中的核酸与PCR反应所用的干粉状态试剂充分溶解后进行下一步的PCR扩增及检测，PCR反应程序为：48℃逆转录10min，95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，40个循环。
3)结果有效性判定
所有的反应腔中PCR反应扩增后内标均应有扩增曲线，检测结果为阳性，否则实验结果无效。
4)结果判读
6个反应腔分别对应12种犬传染性病毒，仪器自动读取每个反应腔中的荧光信号值并判定阴阳性结果。
实施例2
用微流控芯片检测13个样本，其中包括12个犬传染性病毒阳性样本及1个阴性样本。1号样本为狂犬病病毒阳性样本，2号样本为伪狂犬病病毒阳性样本，3号样本为犬细小病毒阳性样本，4号样本为犬冠状病毒阳性样本，5号样本为犬轮状病毒阳性样本，6号样本为犬疱疹病毒阳性样本，7号样本为犬腺病毒I型阳性样本，8号样本为犬腺病毒II型阳性样本，9号样本为犬瘟热病毒阳性样本，10号样本为犬副流感病毒阳性样本，11号样本为呼肠孤病毒阳性样本，12号样本为犬杯状病毒阳性样本，13号样本为阴性样本。按照实施例1中的操作流程进行检测，检测结果如下表4所示。
表4
检测结果表明，本申请所述检测12种犬传染性病毒的微流控试剂盒的特异性非常好，预置的PCR扩增反应试剂只检测对应的犬传染性病毒，不会对其他种类或型别的病毒有交叉反应，能够一次同时检测多种犬传染性病毒，同时有效地防止假阴性结果的发生，且具有高度的特异性。
实施例3
使用犬传染性病毒微流控芯片试剂盒检测12种犬传染性病毒的质粒混合样本，将质粒样本按照一定的浓度梯度一次稀释为105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml五个浓度等级，进行灵敏度实验。按照实施例1中的操作流程进行检测，检测结果如下表5所示。
表5
检测结果表明，本申请所述检测12种犬传染性病毒的微流控试剂盒对于所有12种犬传染性病毒的灵敏度都很高，均达到了102copies/ml即100copies/ml，可以达到单重实时荧光PCR检测敏感度，因此有利于快速地鉴定样本中的相关病原体。且采用微流控芯片的设计，大大增加了检测项目通量，实现从加样到出结果在2小时内完成，节省了实验时间及成本，所有的反应过程都在芯片腔室和管道中完成，防止了PCR产物或样本外泄的可能，大大降低核酸污染的可能性，亦不存在样本或化学试剂泄露的可能性，对于操作人员或者环境的安全性大大加强。
需要说明的是，本申请的其它实施例还包括，上述各实施例中的技术特征相互组合所形成的、能够实施的犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法。本申请提供了犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法，以12种犬传染性病毒的微流控芯片检测为例，建立了狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒12种犬传染性病毒的微流控检测技术，与传统检测方法及市场上普通荧光PCR试剂盒相比，达到如下的检测效果：
(一)多重检测
本申请所提供的犬传染性病毒微流控芯片试剂盒的应用方法，即检测方法，能够一次同时检测狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒12种犬传染性病毒，能快速地鉴定样本中的相关病原体，大大增加了检测项目通量，节省了实验时间及成本。
(二)灵敏度高
如前实施例可见，本申请所提供的检测方法能够实现反应体系中12个目标基因的检测灵敏度均可达到100copies/ml，可以达到单重实时荧光PCR检测敏感度。
(三)特异性高
本申请所提供的检测方法只对相应的12种犬传染性病毒有扩增信号，对于其他种属相近或症状类似的病毒则没有扩增，说明检测方法具有高度的特异性。
(四)防污染
本申请所提供的检测方法采用一次性使用的全封闭微流控芯片，所有的反应过程都在芯片腔室和管道中完成，防止了PCR产物或样本外泄的可能，大大降低核酸污染的可能性。
(五)简便快速
本申请所提供的检测方法能实现只需手动一次加样，后续过程全部自动化进行，使检测过程大大简化，降低了人员的操作要求，并能实现从加样到出结果在2小时内完成。
(六)结果简单易判
本申请所提供的检测方法的结果报告十分简洁明确，增加结果的可读性和易判性。
(七)安全性
本申请所提供的检测方法中所有的试剂均预置在微流控芯片中，是一个高度封闭的体系，不存在样本或化学试剂泄露的可能性，对于操作人员或者环境的安全性大大加强。
(八)内标体系
本申请所提供的检测方法的体系中加入了内标，参与提取和PCR扩增，能够对整个过程进行监控，有效地防止假阴性结果的发生。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，所述芯片包括基体，所述基体具有目标旋转中心且所述基体设有多个腔室，所述多个腔室包括样本腔、裂解液储存腔、样本裂解腔、清洗液储存腔、洗脱液储存腔、缓冲腔、核酸腔、废液腔及至少二PCR反应腔，各所述腔室通过微流控管道连通；每一所述PCR反应腔中容置PCR扩增反应试剂，所述PCR扩增反应试剂包括内标试剂及至少一种犬传染性病毒检测试剂，且各所述PCR反应腔中的所述犬传染性病毒检测试剂的种类相异设置；
其中，所述基体还设有过滤区及选择腔；
所述过滤区包括过滤体、进液区及出液区，进液区与出液区相连通设置，所述过滤体填设于所述进液区、所述出液区以及所述进液区与出液区之间中的至少一项；所述进液区与所述出液区在位于所述基体底部位置的底部通道相连通设置，所述过滤体至少部分位于所述底部通道中，且所述进液区与所述出液区在位于所述基体上部位置间隔设置；
所述清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔；所述第一清洗液储存腔及所述第二清洗液储存腔分别连通所述缓冲腔；所述第二清洗液储存腔还连通所述第一清洗液储存腔；
所述废液腔包括第一废液腔、第二废液腔及第三废液腔，所述第一清洗液储存腔还连通所述第一废液腔，所述选择腔的底部具有相对的两侧，一侧连通所述第一废液腔，另一侧通过所述核酸腔连通分发管道；所述洗脱液储存腔连通所述第三废液腔；
所述样本腔及所述裂解液储存腔分别连通所述样本裂解腔；
所述清洗液储存腔、所述样本裂解腔及所述洗脱液储存腔分别连通所述缓冲腔，所述缓冲腔通过所述过滤区连通所述选择腔；
所述分发管道分别连通各所述PCR反应腔且末端连通所述第二废液腔；
按与目标旋转中心的最近距离从小到大的顺序排列为：所述样本腔、所述裂解液储存腔、所述样本裂解腔、所述清洗液储存腔、所述洗脱液储存腔、所述缓冲腔、所述选择腔、所述核酸腔及各所述PCR反应腔，且所述第二废液腔及所述第三废液腔与所述目标旋转中心的最远距离最大。
2.根据权利要求1所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其特征在于，每一所述PCR反应腔中的所述PCR扩增反应试剂包括两种犬传染性病毒检测试剂。
3.根据权利要求2所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述PCR反应腔的数量为5至10中的一项。
4.根据权利要求3所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述PCR反应腔的数量为6，且各所述PCR反应腔中的所述犬传染性病毒检测试剂的犬传染性病毒种类包括：狂犬病病毒、伪狂犬病病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、呼肠孤病毒、犬杯状病毒。
5.根据权利要求1所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应试剂包括PCR缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2、海藻糖、甘露醇、牛血清蛋白、热启动酶、逆转录酶、犬传染性病毒引物及探针、内标引物及探针。
6.根据权利要求5所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述犬传染性病毒引物及所述内标引物在PCR扩增体系中的终浓度分别为50nM至1000nM；所述探针在PCR扩增体系中的终浓度为25nM至500nM；所述海藻糖在PCR扩增体系中的终浓度为2％至15％；所述甘露醇在PCR扩增体系中的终浓度为0.5％至5％；所述牛血清蛋白在PCR扩增体系中的终浓度为0.2％至5％；所述dATP、dTTP、dCTP、dGTP在PCR扩增体系中的终浓度为0.1mM至5mM；所述MgCl2在PCR扩增体系中的终浓度为1mM至10mM；所述热启动酶在PCR扩增体系中的终浓度为0.5U至5U；所述逆转录酶在PCR扩增体系中的终浓度为5U至50U。
7.根据权利要求1所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述样本裂解腔中容置裂解液，所述裂解液中盐酸胍的终浓度为2M至6M，无水乙醇的终浓度为30％至50％，Tris-HCl的终浓度为10mM至30mM，曲拉通100的终浓度为5％至20％；
所述清洗液储存腔包括第一清洗液储存腔及第二清洗液储存腔，每一所述清洗液储存腔中容置清洗液，所述第一清洗液储存腔中盐酸胍的终浓度为1M至5M，无水乙醇的终浓度为37％至50％；所述第二清洗液储存腔中Tris-HCl的终浓度为5mM至20mM，NaCl的终浓度为50mM至200mM，无水乙醇的终浓度为50％至80％；
所述洗脱液储存腔中容置洗脱液，所述洗脱液储存腔中Tris-HCl的终浓度为5mM至20mM，EDTA的终浓度为0.1mM至2mM。
8.根据权利要求1至7中任一项所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应试剂呈干粉状态。
9.根据权利要求8所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，其特征在于，所述样本腔中预置有内标质粒干粉。
10.权利要求1至9中任一项所述犬传染性病毒微流控芯片试剂盒的应用方法，其特征在于，所述应用方法包括步骤：
提供预置有提取试剂及PCR扩增反应试剂的犬传染性病毒微流控芯片试剂盒，所述提取试剂包括裂解液、清洗液及洗脱液，所述PCR扩增反应试剂呈干粉状态；
加入样本到样本腔中，在微流控环境下进行PCR扩增反应及荧光PCR检测。
CN202010841954.0A 2020-08-20 2020-08-20 犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法 Active CN112126715B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010841954.0A CN112126715B (zh) 2020-08-20 2020-08-20 犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010841954.0A CN112126715B (zh) 2020-08-20 2020-08-20 犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112126715A CN112126715A (zh) 2020-12-25
CN112126715B true CN112126715B (zh) 2023-11-03

Family

ID=73851445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010841954.0A Active CN112126715B (zh) 2020-08-20 2020-08-20 犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112126715B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110643744B (zh) * 2019-11-19 2022-10-21 南京农业大学 一种同时检测三种猫易感病毒的定量检测方法及其引物探针组合

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108374056A (zh) * 2017-09-01 2018-08-07 北京市农林科学院 用于检测检测犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状毒病毒的引物组、试剂盒及检测方法
CN110283940A (zh) * 2019-06-27 2019-09-27 深圳市刚竹医疗科技有限公司 核酸组合物、流感病毒的检测试剂盒和微流控芯片
CN110452802A (zh) * 2019-08-07 2019-11-15 深圳市刚竹医疗科技有限公司 全提取分子诊断微流控芯片及微流控系统
CN110846438A (zh) * 2019-11-27 2020-02-28 金宇保灵生物药品有限公司 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108374056A (zh) * 2017-09-01 2018-08-07 北京市农林科学院 用于检测检测犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状毒病毒的引物组、试剂盒及检测方法
CN110283940A (zh) * 2019-06-27 2019-09-27 深圳市刚竹医疗科技有限公司 核酸组合物、流感病毒的检测试剂盒和微流控芯片
CN110452802A (zh) * 2019-08-07 2019-11-15 深圳市刚竹医疗科技有限公司 全提取分子诊断微流控芯片及微流控系统
CN110846438A (zh) * 2019-11-27 2020-02-28 金宇保灵生物药品有限公司 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测

Also Published As

Publication number Publication date
CN112126715A (zh) 2020-12-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110283940B (zh) 核酸组合物、流感病毒的检测试剂盒和微流控芯片
CN112011448B (zh) 微流控芯片与试剂盒及其应用方法
WO2018196879A1 (zh) 一种样本核酸检测试剂盒、试剂及其应用
CN108192996B (zh) 一种用于甲型流感病毒检测及h1和h3分型的多重rt-rpa引物组合及其应用
TWI451086B (zh) 檢測魚類病原之引子組、方法及套組
CN103602757B (zh) 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用
CN110564895A (zh) 猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法
TW201404884A (zh) 檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組
CN110699490B (zh) 非洲猪瘟病毒cd2v基因的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法
CN113061665A (zh) 核酸组合产品、检测试剂盒及微流控芯片
CN112126715B (zh) 犬传染性病毒微流控芯片试剂盒及其应用方法
CN103509880A (zh) 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的lamp检测试剂盒
CN113249517A (zh) 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒
CN115896245A (zh) 一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应的快速检测方法
CN116042370A (zh) 一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN116042916A (zh) 一种检测猴痘病毒的试剂盒及检测猴痘病毒的方法
CN110592274A (zh) 大黄鱼虹彩病毒（lyciv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
US20130122484A1 (en) Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv)
CN114395643A (zh) 非洲猪瘟病毒的双通道数字pcr检测试剂盒及方法
CN112941233A (zh) 一种体外检测活性病毒的方法
Yang et al. Enriched high‑throughput reverse transcription‑quantitative PCR template preparation without pre‑amplification
CN110923294A (zh) 一种std核酸提取和检测试剂及方法
CN111004855A (zh) 一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒
CN105586437B (zh) 四种进境奶牛携带病毒GeXP检测方法的建立
RU2610434C1 (ru) Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов из водной среды методом мультиплексной ПЦР

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230825

Address after: 518000 room 504, Block E, building 3, Yunzhi Science Park, south of Shuangming Avenue, Dongzhou community, Guangming Street, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant after: Shenzhen Chenghui Medical Technology Co.,Ltd.

Address before: 518049 805m, 8 / F, Cuilin building, 10 Kaifeng Road, Maling community, Meilin street, Futian District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant before: SHENZHEN GANGZHU MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant