CN116042370A - 一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,包括采集管、检测卡夹、新型冠状病毒的RT‑LFD‑eRDA检测的引物和探针、阳性标准质控品、阴性标准质控品及恒温加热器;所述新型冠状病毒核酸释放试剂包括异硫氰酸胍、吐温20、Tris‑HCl、EDTA;所述采集管中含有新型冠状病毒核酸释放试剂;所述检测卡夹内包括侧流层析试纸及冻干小球试剂;所述冻干小球试剂包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA抑制剂、核酸内切酶、肌酸激酶、dNTPs及冻干缓冲液;所述冻干小球试剂为经冻干而成。本发明的检测试剂盒的检测时间大大缩短,在25min内实现快速检测结果,其灵敏度和金标准PCR结果相当,灵敏度上检测可以达到5copy/test,可用于居家自检或实验室快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒及其检测方法,属于新型冠状病毒检测的技术领域。
背景技术
病毒是具有包膜的正链单股RNA病毒,新型冠病毒传播途径广泛,主要的传播途径是通过呼吸道进行传播,并且病毒的潜伏期很长为1~14天。
市面上针对检测新冠以核酸检测试剂盒(qRT-PCR)和以新冠抗原蛋白检测试剂盒(ELISA法)。新型冠状病毒核酸检测和病毒抗原抗体的检测,通常在5-6h内才能得到检测结果,检测等待时间较长,并且需要较高仪器和实验室环境的要求,难以满足实际应用需求。居家检测拥有便捷、私密、无接触、不受环境限制、节约医疗资源等特点,
发明内容
本发明提供了一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒及其检测方法,可以有效解决上述问题
本发明是这样实现的:
一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,包括采集管、检测卡夹、新型冠状病毒的RT-LFD-eRDA检测的引物和探针、阳性标准质控品、阴性标准质控品及恒温加热器;所述新型冠状病毒核酸释放试剂包括异硫氰酸胍、吐温20、Tris-HCl、EDTA;所述采集管中含有新型冠状病毒核酸释放试剂;所述检测卡夹内包括侧流层析试纸及冻干小球试剂;所述冻干小球试剂包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA抑制剂、核酸内切酶、肌酸激酶、dNTPs及冻干缓冲液;所述冻干小球试剂为经冻干而成。
作为进一步改进的,所述侧流层析试纸至少包括样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫;所述侧流层析试纸至少包括3个不接触的独立单元;其中,样品垫和结合垫,分属于不同的独立单元。结合垫吸附有标记的生物活性材料(如金标抗体),它可与待检样品溶液里的检测靶标以及检测区固定化的识别分子结合形成肉眼可见的复合物从而被检测区捕获(基于夹心检测机理)并使检测区颜色随目标物浓度增加而增强,或与检测靶标竞争结合检测区固定化的识别分子从而被检测区捕获(基于竞争检测机理),并使检测区颜色随目标物浓度增;加而减弱直至消失。
作为进一步改进的,新型冠状病毒的RT-LFD-eRDA检测的引物和探针包括引物1、引物2和探针,其核苷酸序列依次为SEQ ID NO:1-3。
作为进一步改进的,所述新型冠状病毒核酸释放试剂的异硫氰酸胍、吐温20、Tris-HCl、EDTA的比例为20-40mM、50-100mM、2wt%、1-5mM。
作为进一步改进的,所述冻干缓冲液包括Tris-HCl、硫酸镁、聚环氧乙烷、甘露醇、海藻糖、甜菜碱、ATP、四水磷酸肌酸钠。所述冻干缓冲液能够帮助冻干小球试剂各组分实现快速冻干,冻干试剂有着常温稳定、摆脱冷链,即时活化,不相容试剂共存,无交叉污染等优点,保证了试剂稳定性以及减低运输要求,使得试剂盒的运输,保存以及操作更为简单,节约成本的同时,保证试剂盒的性能。
作为进一步改进的,所述重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、逆转录酶、核酸内切酶、肌酸激酶的浓度依次为200-350ng/uL、500-750ng/uL、200ng/uL、100ng/uL、20-50ng/uL、120-200ng/uL。
作为进一步改进的,所述阳性标准质控品为新型冠状病毒N基因片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒。
作为进一步改进的,所述检测卡夹还包括放样槽;所述放样槽上设置橡胶塞,用于封闭所述放样槽,所述放样槽内含冻干小球试剂。
一种新型冠状病毒核酸释放试剂,包括异硫氰酸胍、吐温20、Tris-HCl、EDTA。由于新型冠状病毒是具有包膜的正链单股RNA病毒,它的遗传物质RNA是检测的核心,本发明提供的一种新型冠状病毒核酸释放试剂使用简单,将本产品和含脂包膜病毒的溶液按比例混合即可,就能快速裂解脂包膜病毒,使其失去活性,释放出病毒RNA,并且所含的病毒裂解剂即使占扩增反应体液不会抑制扩增反应。
一种居家自检的新型冠状病毒的检测引物探针组,包括引物1、引物2和探针,其核苷酸序列依次为SEQ ID NO:1-3。
一种上述的居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的应用方法,包括以下步骤:
S1,自行采集样品后,将样品浸没于采集管内新型冠状病毒核酸释放试剂中,手动摇匀5min;
S2,再将样品液滴加进检测卡夹内的冻干小球试剂中,手摇至冻干小球试剂复溶;
S3,将检测卡夹通过恒温加热器40-44℃反应10-20min,反应结束后,通过检测卡夹内的侧流层析试纸进行层析作用,5-10min显色及判读。
本发明的有益效果是:
(1)本发明的居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒设计巧妙,可以实现使用者在居家时候,短时间内迅速判定新型冠状病毒,从而减少病毒在人群密集的医疗场所进一步传播。
(2)与经典的荧光qPCR法的核酸检测和核酸磁珠提取法相比,本发明方法仅通过核酸释放试剂释放病毒核酸,和恒温扩增,反应物均在检测卡夹内实现试纸条检测显色结果判读,具有封闭性,防止样品外溢造成扩散感染风险。
(3)与经典的荧光qPCR法的核酸检测和核酸磁珠提取法相比,本发明方法仪器要求低,不需要投入巨大资金成本建设医学生物安全二级实验室和购买相配套昂贵复杂的荧光PCR仪仪器设备,检测成本低。
(4)与经典的荧光qPCR法的核酸检测和核酸磁珠提取法相比,本发明的检测方法的检测时间大大缩短,在25min内实现快速检测结果,其灵敏度和金标准PCR结果相当,灵敏度上检测可以达到5copy/test,可用于居家自检或实验室快速检测。
(5)与现行的核酸检测需要专门人员操作相比,本发明检测装置操作简单,显著缩短检测时间、提高检测效率并且不需要相关专业技能培训要求,尤其对于不具备快速开展SARS-CoV-2核酸检测条件,使用本发明检测可作为核酸检测的有益补充,使得家用的核酸检测成为可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案,下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例的居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的特异性图。
图2是本发明实施例的居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的灵敏度图。
图3是本发明实施例的居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的灵敏度与金标准qPCR结果对比图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施方式中的附图,对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式是本发明一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。因此,以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。
实施例1
RT-LFD-eRDA居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的组成如表1所示
表1
其中,表1中免提取核酸释放剂、冻干小球试剂、引物、探针及其他部分试剂的详细介绍如下:
(1)免提取核酸释放剂的终浓度即是指各组分在eRDA反应体系中的浓度如表2所示:
表2
(2)冻干小球的成分如表3所示:
终浓度即是指各组分在eRDA反应体系中的浓度优选的为表内浓度
表3
试剂 | 来源 | 终浓度 |
RNA抑制剂 | 南京诺唯赞 | 40U |
Tris-HCl(pH 8.5) | 上海生工 | I50mM |
硫酸镁 | 国药集团 | 14mM |
聚环氧乙烷 | 上海默克有限公司Sigma | 5%(w/v) |
甘露醇 | 国药集团 | 16% |
海藻糖 | 国药集团 | 50% |
甜菜碱 | 国药集团 | 40uM |
ATP | 上海默克有限公司Sigma | 10mM |
dNTPs | 北京天根生物科技 | 400mM |
四水磷酸肌酸钠 | 上海默克有限公司Sigma | 30-40mM |
引物F/R/探针 | 尚亚生物 | 10uM/10uM/10uM |
肌酸激酶CKM | 厦门康基生物 | 120-200ng/uL |
重组酶UvsX | 厦门康基生物 | 200-350ng/uL |
重组酶加载因子UvsY | 厦门康基生物 | 20-50ng/uL |
单链结合蛋白GP32 | 厦门康基生物 | 500-750ng/uL |
脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶 | 厦门康基生物 | 200ng/uL |
逆转录酶(M-MLV) | 厦门康基生物 | 100ng/uL |
核酸内切酶IV(Nfo) | 厦门康基生物 | 20-50ng/uL |
(3)引物、探针
本发明的引物和探针序列以N基因为检测靶点,设计引物和探针。探针序列中,5’被荧光基团FAM修饰,第31-32碱基之间碱基替代物dSpcacer(供核酸内切酶IV识别切割)为四氢呋喃,3'末端被阻断基团C3-spacer修饰(它还可以是磷酸盐生物素或胺);反向引物序列中,5'被生物素修饰。
所述引物组的核酸序列为:
XG-eRDA-LFF1:5'-CCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTC-3'5'修饰Biotin(SEQID NO.1)
XG-eRDA-LFR1:5'-TTCGTCTGGTAGCTCTTCGGTAGTAGCCAAT-3';5'修饰FAM 3'修饰Spacer C3(SEQ ID NO.2)
探针单链为:
XG-eRDA-LFT1:5'-CTGGACTGCTATTGGTGTTAATTGGAACGCCTTG(THF)CCTCGAGGGAATTTA-3'(SEQ ID NO.3)
(3)所述阳性标准品为高度保守的新型冠状病毒N基因片段(人工合成)与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒;所述阴性标准品为无菌双蒸水。
N基因片段(人工合成)的序列为
5'-GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGG
CCGCGGGAATTCGATTATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAA
TGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTA
ACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCC
CCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCA
ACATGGCAAGGAAGGCCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAA
TTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGA
GCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAG
TCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGAC
TTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAG
GGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATG-3'(SEQ IDNO.4)。
(5)核酸检测侧流层析试纸条:由样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫构成,推荐使用厦门宝太生物科技有限公司的通用型核酸检测试纸条,核酸检测装置(型号:ZC001)。
实施例2
RT-LFD-eRDA居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的应用方法如下:
首先参照说明书,使用者打开一份Disposable Sampling Swab(鼻拭子)自行采集深鼻处的样品后,撕开采集管封口膜,将鼻拭子浸没于采集管管内(含有免提取核酸释放剂),手动摇匀5min,用手拧压采集管侧,打开卡夹的放样槽的橡胶塞(内含冻干小球),混样液从滴头出滴4-5滴于检测卡夹放样槽,关上橡胶塞,手摇至小球复溶,插入通电的恒温加热器,滴一声响声后,指示灯绿色变成闪烁的红色,检测样将在检测卡夹内通过恒温加热器42℃反应15min,反应结束后的指示灯变绿,按下流通阀开关,预置在检测卡夹的大板液,与反应液重复混匀并稀释,至卡检测夹内的检测槽,预置在检测卡夹的侧流层析试纸条将会从检测槽内反应液通过层析作用,5-10min显色及时判读。结果判读:同时出现T线和C线为阳性(+),仅出现C线为阴性(-),只出现T线需要考虑试纸条是否有效性。
检测原理:首先,在核酸释放剂里将采样的棉签(携待测样品),于室温摇匀5min,滴入检测卡夹放于小型加热器恒温15min,卡夹里反应槽内,在逆转录酶的作用下病毒RNA反转录为cDNA,接着重组酶结合引物形成核蛋白丝复合体,在双链DNA中搜索同源序列,侵入双链DNA,发生链置换,在ATP水解下提供能量,重组酶从蛋白核丝复合体脱落,被替换的DNA链与单链结合蛋白结合,防止进一步替换,聚合酶启动DNA合成,核酸内切酶IV识别到脱碱基位点(dSpacer),进行切割3'-末端的阻断剂,探针被激活作为引物与原有的上下游引物一起,在DNA聚合酶作用下,对模板进行指数式扩增,最终扩增产物带上了FAM和Biotin标签,层析扩散中,最终扩增产物遇到对应的识别亲和标记处富集,形成具有颜色的检测线。试纸条法由于不依赖荧光定量PCR仪,成本和适用范围更广。
实施例3
RT-LFD-eRDA居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的特异性分析
使用购买均为国家参考品,推出新型冠状病毒核酸标准物质(高浓度)(新冠Covid-19)货号GBW(E)091089,甲型流感病毒(F1uA)(NIM-RM4054)、乙型流感病毒(F1uB)NIM-RM4056、以及MPV的人工合成DNA质粒,
按照实施例2的步骤进行特异性试验,分别以新型冠状病毒的RNA、F1uA、F1uB、MPV为模板,以ddH2O为阴性对照,进行检测扩增,试验重复3次。
所有的进行侧流层析试纸条检测,如图1所示,从图中可以看出,居家自检的免提取检测试剂及其检测装置扩增新型冠状病毒特异性好,与其它检测病毒无交叉反应。
实施例4
RT-LFD-eRDA居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的灵敏度分析
将国家参考品,推出新型冠状病毒核酸标准物质经DEPC水进行10倍系列稀释(包括5.38×105、5.38×104、5.38×103、5.38×102、5.38×101、5拷贝和1拷贝),每个梯度的模板浓度做3个重复,卡夹内中进行反应并放于通电的恒温加热器反应15min,反应结束后的指示灯变绿,按下流通阀开关,预置在卡夹的大板液,与反应液重复混匀并稀释,至卡夹内的检测槽,预置在卡夹的试纸条将会从检测槽内反应液通过层析作用,5-10min显色及时判读。结果表明,RT-LFD-eRDA的检测限为5个拷贝(图2)。
实施例5
在实施例4的基础上,使用同样的模板在达安基因新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒绿盒48T/反应(荧光PCR法),采用核酸检测金标准qPCR法,可以在CT值在37.52处可检测出5copy/test(图3)结果表明,新型冠状病毒在RT-LFD-eRDA居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的检测方法的灵敏度可与荧光PCR法相当。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,其特征在于,包括采集管、检测卡夹、新型冠状病毒的RT-LFD-eRDA检测的引物和探针、阳性标准质控品、阴性标准质控品及恒温加热器;所述新型冠状病毒核酸释放试剂包括异硫氰酸胍、吐温20、Tris-HCl、EDTA;所述采集管中含有新型冠状病毒核酸释放试剂;所述检测卡夹内包括侧流层析试纸及冻干小球试剂;所述冻干小球试剂包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA抑制剂、核酸内切酶、肌酸激酶、dNTPs及冻干缓冲液;所述冻干小球试剂为经冻干而成。
2.根据权利要求1所述居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,其特征在于,新型冠状病毒的RT-LFD-eRDA检测的引物和探针包括引物1、引物2和探针,其核苷酸序列依次为SEQID NO:1-3。
3.根据权利要求1所述居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述新型冠状病毒核酸释放试剂的异硫氰酸胍、吐温20、Tris-HCl、EDTA的比例为20-40mM、50-100mM、2wt%、1-5mM。
4.根据权利要求1所述居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述冻干缓冲液包括Tris-HCl、硫酸镁、聚环氧乙烷、甘露醇、海藻糖、甜菜碱、ATP、四水磷酸肌酸钠。
5.根据权利要求1所述居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、逆转录酶、核酸内切酶、肌酸激酶的浓度依次为200-350ng/uL、500-750ng/uL、200ng/uL、100ng/uL、20-50ng/uL、120-200ng/uL。
6.根据权利要求1所述居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述阳性标准质控品为新型冠状病毒N基因片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒。
7.根据权利要求1所述居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒,其特征在于,所述检测卡夹还包括放样槽;所述放样槽上设置橡胶塞,用于封闭所述放样槽,所述放样槽内含冻干小球试剂。
8.一种新型冠状病毒核酸释放试剂,其特征在于,包括异硫氰酸胍、吐温20、Tris-HCl、EDTA。
9.一种居家自检的新型冠状病毒的检测引物探针组,其特征在于,包括引物1、引物2和探针,其核苷酸序列依次为SEQ ID NO:1-3。
10.一种权利要求1至7任一项所述的居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒的应用方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,自行采集样品后,将样品浸没于采集管内新型冠状病毒核酸释放试剂中,手动摇匀5min;
S2,再将样品液滴加进检测卡夹内的冻干小球试剂中,手摇至冻干小球试剂复溶;
S3,将检测卡夹通过恒温加热器40-44℃反应10-20min,反应结束后,通过检测卡夹内的侧流层析试纸进行层析作用,5-10min显色及判读。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116676422A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-09-01 | 南京农业大学 | 一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物探针组合、冻干小球及其应用 |
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2022
- 2022-12-16 CN CN202211622147.5A patent/CN116042370A/zh active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN116676422A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-09-01 | 南京农业大学 | 一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物探针组合、冻干小球及其应用 |
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PB01 | Publication | ||
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