CN110551846A - 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒，包括适用于非洲猪瘟病毒快速检测的Cpf1检测体系与免疫胶体金试纸条；所述Cpf1检测体系包括：针对非洲猪瘟病毒p72基因的特异性crRNA、Cpf1蛋白和单链DNA(ssDNA)报告系统；所述特异性crRNA为ASFV P72 crRNA1到ASFV P72 crRNA10中的任意一种或多种，其序列为SEQ NO.4到SEQ NO.13；所述单链DNA(ssDNA)报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter。本发明系首次采用Cpf1检测非洲猪瘟病毒，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的基于Cpf1胶体金试纸检测方法方便用于基层实验室和养殖企业对非洲猪瘟的基层快速检测检测和鉴定诊断。

Description

一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测 方法

技术领域

本发明涉及一种对非洲猪瘟病毒核酸的快速检测方法及试剂盒，更具体的说，涉及基于Cpf1对非洲猪瘟病毒核酸的快速检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)感染引起的一种急性、烈性猪传染病，该病发病过程短、最急性和急性感染死亡率高达100％，是生猪产业危害最严重的烈性传染病(Galindo and Alonso 2017)。ASF是世界动物卫生组织(OIE)要求报道的动物疫病，ASFV属于我国动物病原微生物名录一类动物病原微生物。

ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)成员，该病毒基因组由双链DNA组成。ASFV是目前已知的唯一的虫媒DNA病毒(Dixon,Escribano etal.2005)。

非洲猪瘟临床特征与经典猪瘟病毒(CSFV)感染病症在生产现场无法区分(Tauscher,Pietschmann et al.2015,Liu,Atim et al.2019)。目前，尚没有针对ASFV感染有效治疗手段或疫苗，疾病控制主要基于严格的卫生措施和动物扑灭，从而直接造成严重的经济损失(Penrith and Vosloo 2009,Rock 2017)。鉴于AFSV传播快速及高致死率，快速实验室诊断对于预防和确诊该病非常重要。ASFV准确快速的检测，使得防疫检疫决策可以当机立断、立即处置，达到阻断扩散风险的目的。

基于ASFV遗传信息检测的分子工具已被广泛用于ASF诊断(Oura,Edwards etal.2013)。聚合酶链反应(PCR)和实时荧光PCR技术为ASF诊断提供了技术支持(Fernández-Pinero,Gallardo et al.,Agüero,Fernández et al.2003)。但是，上述方案需要一些昂贵的实验设备，并不适用于猪场的现场检测。最近，有研究团队基于通用探针库(UPL)探针而改进的实时PCR测定可以用于野外条件下的ASFV分子诊断(Agüero,Fernández etal.2003)，但因电池供电的实时PCR仪器的限制，该方法只能处理中等数量的样品。

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸(Barrangou,Fremaux et al.2007,Marraffini and Sontheimer 2008)。其中，CRISPR-Cas9蛋白家族已被广泛应用到基因编辑、抗病毒制剂和生物影像等众多领域(Doudna andCharpentier 2014,Barrangou and Horvath 2017)。CRISPR-Cas12a(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine,T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)(Zetsche,Gootenberg et al.2015)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟(Fonfara,Richter et al.2016)，并产生具有交错5'的PAM远端dsDNA断裂和3'端不通顺(Zetsche,Gootenberg et al.2015)。当CRISPR/Cpf1蛋白以序列特异性方式切割双链DNA(dsDNA)时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性(Chen,Ma et al.2018)。基于Cpf1上述特性，我们开发了一种快速准确的检测方法，用于检测临床标本中ASFV。从待检猪样品中提取ASFV dsDNA，并在等温条件下进行重组酶聚合酶扩增(RPA)(Piepenburg,Williams et al.2006)。Cpf1-crRNA复合物结合并切割靶标ASFVdsDNA，其激活ssDNA的反式切割。与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。这种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因的新方法，为快速准确检测非洲猪瘟及亚型鉴定提供了强有力的平台。

胶体金免疫测定是临床快速检测的一种高效技术方案。当胶体金颗粒标记的抗体与相应的抗原结合时，可目视检测有色免疫反应物(Huang,Aguilar et al.2016)。胶体金检测作用时间短、在广泛的气候条件下长期稳定以及相对低成本，这些特性使其广泛适用于未经训练的人员进行临床一线使用。

发明内容

本发明的目的在于针对临床非洲猪瘟病毒的快速检测难题，提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，包括适用于非洲猪瘟病毒快速检测的Cpf1检测体系与免疫胶体金试纸条；

所述Cpf1检测体系包括：针对非洲猪瘟病毒P72基因的特异性crRNA、Cpf1蛋白和单链DNA(ssDNA)报告系统；

所述特异性crRNA为ASFV P72crRNA1到ASFV P72crRNA10中的任意一种或多种，其序列为SEQ NO.4到SEQ NO.13；

所述单链DNA(ssDNA)报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter；其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNA DBreporter为利用地高辛(Digoxin)和生物素(Biotin)标记的ssDNA,标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/；

所述免疫胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线。

优选地，所述特异性crRNA的制备方法包括：针对ASFV II亚型P72基因，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA，分别命名为ASFV P72crRNA1到ASFV P72crRNA10，设计完成后，合成oligo，构建到载体pUC57-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA。

优选地，所述crRNA为ASFV P72crRNAmix，所述ASFV P72crRNAmix为ASFVP72crRNA1到ASFV P72crRNA10的10种crRNA的等比例混合物。

优选地，所述Cpf1蛋白的制备方法包括：针对cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列SEQ NO.14，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。

本发明提供的用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒既可利用酶标仪荧光检测也可以利用免疫胶体金试纸条检测。当使用酶标仪荧光检测时，Cpf1检测体系中DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA FQ reporter，当使用免疫胶体金试纸条检测时，DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA DB reporter。

在使用酶标仪荧光检测时，当Cpf1检测体系中存在ASFV基因组，会由在ASFV特异性crRNA介导下特异性激活Cpf1蛋白的核酸内切酶活性。激活后的Cpf1蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter,从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样品中不存在ASFV时，不会有荧光读数。

在使用免疫胶体金试纸条检测时，当Cpf1切割后待检测样品加入到胶体金试纸条后，被胶体金标的鼠抗地高辛抗体会与地高辛标记的ssDNA报告系统结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssDNA报告系统，从而显示条带；只有当Cpf1检测到非洲猪瘟病毒p72基因特性性序列，会将标记有地高辛和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而会有地高辛标记的ssDNA片段被检测线抓获显色。

本发明还提供了一种非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法，其特征在于，采用上述用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒。

优选地，所述非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法包括以下步骤：

步骤a：利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；

步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用ASFV特异性引物SEQ NO.2和SEQ NO.3，加入RPA等温扩增体系，在37℃反应20min扩增获得特异性产物；

步骤c：利用Cpf1检测体系切割ASFV核酸：将步骤b中产物加入Cpf1检测体系，于37℃反应30min；

步骤d：利用免疫胶体金试纸条检测样品中ASFV核酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过利用Cpf1特异识别核酸联合免疫测流层析技术，实现对ASFV核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。根据研究发现，ASFV P72(B646L)基因具高特异性及高保守性，选定P72基因C端为检测靶序列。根据Cpf1识别特定PAM序列特点，在P72基因靶序列上设计10条特异性crRNA。通过检测发现10个crRNA均能特异性识别ASFV。并且，针对同一待检样品，10种crRNA等比例混合产物crRNAmix使用的效果优于单个crRNA，因此选定对ASFV检测中使用crRNAmix,进一步建立Cpf1快速检测ASFV核酸系统。在ASFV基因型检测中，分别使用crRNA1至crRNA10对同一样品检测。

(2)本发明基于Cpf1非洲猪瘟病毒的种快速检测工具，该工具包含免疫层析条带检测，能实现方便快捷的结果判读。

(3)本发明利用Cpf1对特异性序列切割和免疫测流层析技术实现对ASFV核酸的快速、高特异性、高灵敏性和可视化检测。同时，基于设计不同序列的crRNA，可实现对ASFV不同亚型的鉴定。本发明所建立的ASFV核酸快速检测方法,为基层实验室和生产一线提供了一个准确、快速、简便的检测方法。

(4)本发明公开了一系列用于非洲猪瘟病毒核酸检测及病毒基因亚型鉴定的Cpf1反应体系和crRNA组合，其序列依次如SEQ ID NO.4至NO.13所示。所述Cpf1和crRNA组合可用于非洲猪瘟病毒核酸检测以及对24个亚型鉴定分型。本发明系首次采用Cpf1检测非洲猪瘟病毒，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的基于Cpf1胶体金试纸检测方法方便用于基层实验室和养殖企业对非洲猪瘟的基层快速检测检测和鉴定诊断。

附图说明

图1 基于Cpf1快速检测非洲猪瘟病毒核酸方法示意图；

图2 Cpf1检测非洲猪瘟病毒特异性crRNA设计及不同亚型ASFV序列比对；

图3 Cpf1不同crRNA检测非洲猪瘟病毒荧光检测效果；

图4 Cpf1检测非洲猪瘟病毒荧光法时间动态曲线；

图5 Cpf1检测非洲猪瘟病毒荧光法灵敏度；

图6 Cpf1检测非洲猪瘟病毒胶体金试纸条检测灵敏度；

图7 Cpf1检测非洲猪瘟病毒胶体金试纸条检测灵敏度量化图；

图8 Cpf1利用不同crRNA检测非洲猪瘟病毒亚型方案图；

图9 验证crRNA3对非洲猪瘟不同亚型的检测差异性；

图10 Cpf1胶体金试纸条检测判定非洲猪瘟病毒I亚型病毒；

图11 Cpf1胶体金试纸条检测判定非洲猪瘟病毒III亚型病毒；

图12 Cpf1胶体金试纸条检测临床组织样品DNA中非洲猪瘟病毒；

图13 Cpf1胶体金试纸条检测临床血清样品中非洲猪瘟病毒核酸；

图14 Cpf1胶体金试纸条检测临床血清样品中非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测灵敏度量化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中：RPA扩增试剂盒Basic kit购自TwistAmp公司；crRNA体外转录盒子MEGAshortscript T7Transcription Kit和纯化盒子MEGAclear Kit购自Ambion公司；常规试剂如Tris-Base,NaCl,Tris-HCl，MgCl₂,BSA和甘油等购自Thermo Fisher；核酸和ssDNAt探针合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。

本发明的总体技术示意图如附图1所示，包括以下3大部分：待检测核酸样品制备、Cpf1检测成分设计制备和体系构建、胶体金试纸条设计和制备。

实施案例1：非洲猪瘟病毒p72基因片段快速灵敏检测

1.1 核酸制备

本案例中非洲猪瘟病毒p72基因片段，是参考Genotype II亚型序列，由南京金斯瑞公司合成C端454bp SEQ NO.1并构建到pUC57载体，命名为pUC57-ASFV-p72。

利用本发明中RPA扩增引物RPA-F1SEQ NO.2和RPA-R1SEQ NO.3，参考RPA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。具体操作如下：

在灵敏度检测案例中，将pUC57-ASFV-P72质粒计算分子量，进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2*e10、2*e9、2*e8、2*e7、2*e6、2*e5、2*e4、2*e3、2*e2、2*e1和2*e0拷贝数(copy/μL)。将1μL梯度稀释样品，分别进行RPA扩增反应：25μL 2*Buffer，2μL RPA-F1，2μLRPA-R1和2.5μL乙酸镁，混合均匀，于37℃反应20min,获得样品进行下一步核酸检测。

1.2 cpf1蛋白表达制备

本发明利用大肠杆菌E.coli表达系统，通过亲和纯化获得高纯度、高活性的CRISPR-cpf1蛋白。具体操作如下，针对cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列SEQ14，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。

1.3 ASFV特异性crRNA的设计制备

如图2所示，crRNA制备按照如下方案进行，针对ASFV II亚型P72基因，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA，分别命名为ASFV P72crRNA1到ASFV P72crRNA10。设计完成后，交于南京金斯瑞公司合成oligo，构建到载体pUC57-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA。

本发明提供的ASFV P72crRNA包括SEQ NO.4到SEQ NO.13，具体信息如表1所示：

表1非洲猪瘟病毒P72基因特异性crRNA

本检测采用20μL体系如表2所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表2非洲猪瘟病毒cpf1检测体系

其中，ssDNA reporter为ssDNA FQ reporter或ssDNA DB reporter。

1.4 全波长酶标仪荧光检测

酶标仪荧光检测中，Cpf1对目的基因检测体系依次加入2μL Buffer、1μL RnaseInhibitors、1μL Cpf1、1μL ssDNA FQ reporter、5μL RPA sample、1μL crRNA和9μL H₂O。各组分混合均匀后于37℃反应30min。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1为200ng/μL，ssDNA FQ reporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL。

首先依次检测crRNA1至crRNA10的检测效率。在Cpf1检测体系中，各加入1μLcrRNA(crRNA1到crRNA10)，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应30min。随后，将上述反应体系中crRNA替换为crRNA1到crRNA10的10种crRNA等比例混合物crRNAmix，反应体系加入1μL crRNAmix，同样进行切割反应。上述反应产物进行后续结果检测判定。

利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值。非洲猪瘟病毒crRNA1到crRNA10，切割检测如图3。本发明检测体系中，crRNAmix混合使用对ASFV检测动态曲线如图4。同时，该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对ASFV检测超高灵敏度检测(图5)。

1.5 胶体金试纸条检测

胶体金试纸条检测中，Cpf1对目的基因检测体系依次加入2μL Buffer、1μL RnaseInhibitors、1μLCpf1、1μL ssDNA DB reporter、5μL RPA sample、1μL crRNAmix和9μLH₂O。各组分混合均匀后于37℃反应30min。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1为200ng/μL，ssDNA DB reporter浓度为25pM/μL，crRNAmix浓度为1nM/μL。

本发明中免疫胶体金试纸条检测步骤如下：将20μL Cpf1切割产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4XSSC，2％BSA和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合。将测试条浸入混合物中，反应3分钟后，可由肉眼进行结果判定，及进行拍照记录。

本案例中，应用Cpf1胶体金试纸条检测非洲猪瘟病毒，可实现2e1拷贝病毒的高灵敏度检出(图6和图7)。

实施案例2：非洲猪瘟病毒P72基因片段快速基因型鉴定

非洲猪瘟病毒基因型的快速检测，有助于详细了解病毒感染来源和追溯病毒传播途径，并病毒的防控有重要意义。本实施案例，以ASFV I亚型、II亚型和III亚型为范例，示范应用本发明的Cpf1检测试剂盒对非洲猪瘟病毒分型。

基于Cpf1是在crRNA引导下对目标序列进行高特异性识别切割的特性，提出假设：不同基因基因型ASFV存在核酸序列差异，可以导致Cpf1切割系统不能高效识别，表现为检测荧光数值低或胶体金试纸条无检测条带。基于此原理，我们比对了非洲猪瘟病毒24个亚型在crRNA1到crRNA10上的序列差异，并制备了基因型判定参照表如图8所示。在ASFV基因型检测判定中，检测体系依次使用crRNA1至crRNA10对同一样品进行检测，结果比对图8基因型判定参照表进行判定。

在对不同亚型ASFV基因检测案例中，以ASFV I亚型(GI)SEQ NO.15、ASFV II亚型(GII)和III亚型(GIII)SEQ NO.16为范例进行验证。参考NCBI数据库序列，分别合成GI和GIII P72基因片段，并构建到pUC57载体中。将GI、GII和GIII质粒稀释到10ng/μL，进行病毒基因型鉴定。

在荧光检测中，在Cpf1检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μLRnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μL ssDNA FQ reporter、1μL DNA sample、1μL crRNA和9μL H₂O。各组分混合均匀，在37℃反应30min。本检测体系中，crRNA是指crRNA1到crRNA10的10种crRNA。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1为200ng/μL，ssDNA DB reporter浓度为25pM/μL，crRNAmix浓度为1nM/μL。

本实施案例中，利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值。

本实施案例中，首先通过检测crRNA3对不同亚型ASFV的检测分析，验证上述假设。结果如图9A所示，不同ASFV在crRNA3识别核酸区段存在突变差异；如图9B荧光检测结果所示，crRNA3与序列完全匹配的II型ASFV荧光值最高(颜色最深)，对应的对存在核酸突变的其它亚型ASFV检测数值低。基于此，验证了可以通过Cpf1检测到不同亚型ASFV的假设。接下来，采用crRNA1至crRNA10分别同时检测同一待检样品，获得检测结果后。参照图8基因型判定参照表判定亚型。

在胶体金试纸条检测中，在Cpf1检测体系中，依次加入2μLBuffer、1μL RnaseInhibitors、1μL Cpf1、1μL ssDNA DB reporter、1μL DNA sample、1μL crRNA和9μL H₂O。各组分混合均匀，在37℃反应30min。本检测体系中，crRNA是指crRNA1到crRNA10的10种crRNA。将20μL Cpf1切割产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4XSSC，2％BSA和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合。将测试条浸入混合物中，反应3分钟后，可由肉眼进行结果判定，及进行拍照记录。

应用CRISPR-cpf1胶体金试纸条检测体系，可实现对ASFV不同亚型的区分判定，如本案例检测结果图10和图11所示，可实现对I亚型和III亚型ASFV的快速检测判定。

实施案例3：对临床组织样品的核酸进行ASFV快速检测

本实施案例对临床组织样品的核酸进行ASFV快速检测，所有样品及操作均在国家非洲猪瘟区域实验室中完成，所有操作严格按照有关法律法规和农业部相关规定进行。

本案例中临床DNA样品来自国家非洲猪瘟区域实验室，包括从感染有非洲猪瘟病毒的生猪养殖场采集的猪组织样品，包括肺脏、脾脏、肾脏、肠管、心脏和肝脏的6种组织器官12份样品。提取获得组织总DNA，分别进行qPCR检测和Cpf1检测。本实施例使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。步骤如下：2μl待检测样品加入20μl核酸裂解液，常温静置3分钟，加入20μl中和液，混匀后进行下一步检测；其中qPCR检测结果为：样品C1到C6为ASFV阳性，C7至C12样品为ASFV阴性。在Cpf1检测中，每个待检测样品取2μl进行RPA预扩增，步骤与实施案例1中相同，获得Cpf1检测样品。

在Cpf1检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μLssDNA DB reporter、5μL RPA sample、1μL crRNAmix(包含crRNA1到crRNA10等体积的混合物)和9μL H₂O。各组分混合均匀，在37℃反应30min。

本实施案例中，将Cpf1切割产物进行胶体金试纸结果判定。将Cpf1切割产物，以1:2比例稀释到胶体金检测缓冲液中，随后插入本发明中胶体金试纸条，带并在室温下温育3分钟。判定试纸条检测结果并拍照保存。检测结果如图12胶体金试纸条所示，样品C1到C6为ASFV阳性，C7至C12样品为ASFV阴性。Cpf1胶体金试纸条能对临床组织样品中非洲猪瘟病毒实现灵敏、快速、准确检测。

实施案例4：对临床血液和组织样品ASFV直接快速检测

本实施案例对临床组织样品的核酸进行ASFV快速检测，所有样品及操作均在国家非洲猪瘟区域实验室中完成，所有操作严格按照有关法律法规和农业部相关规定进行。

本案例中临床猪血清样品自国家非洲猪瘟区域实验室，由专业人员合规从生猪养殖场采集获得。取血清样品2μL加入20μL病毒释放液，混匀后室温静置3min，随后加入20μL中和液，混匀待用。取血清样品裂解液2μL进行RPA预扩增，步骤与实施案例1中相同，获得Cpf1检测样品。

在Cpf1检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μLssDNA DB reporter、5μL RPA sample、1μL crRNAmix(包含crRNA1到crRNA10混合物)和9μLH₂O。各组分混合均匀，在37℃反应30min。

本实施案例中，将Cpf1切割产物进行胶体金试纸结果判定。将Cpf1切割产物，以1:2比例稀释到胶体金检测缓冲液中，随后插入本发明中胶体金试纸条，带并在室温下温育3分钟。判定试纸条检测结果并拍照保存。检测结果如图13所示，胶体金试纸条结果显示样品#1、#2、#3、#4、#5和#7为ASFV阳性，与qPCR检测结果一致。图14为图13检测条带灰度扫描量化数据，阳性判定结果与图13一致。Cpf1胶体金试纸条能对临床血液样品中非洲猪瘟病毒实现灵敏、快速、准确检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海科技大学

<120> 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法

<130> PCN1192037

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 454

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV II亚型 P72基因片段

<400> 1

gattggcaca agttcggaca tgttgttaac gccattatgc agcccactca ccacgcagag 60

ataagctttc aggatagaga tacagctctt ccagacgcat gttcatctat atctgatatt 120

agccccgtta cgtatccgat cacattacct attattaaaa acatttccgt aactgctcat 180

ggtatcaatc ttatcgataa atttccatca aagttctgca gctcttacat acccttccac 240

tacggaggca atgcgattaa aacccccgat gatccgggtg cgatgatgat tacctttgct 300

ttgaagccac gggaggaata ccaacccagt ggtcatatta acgtatccag agcaagagaa 360

ttttatatta gttgggacac ggattacgtg gggtctatca ctacggcttc ttcttcttca 420

gaacggttca gctgtgctgc gttacagtac ctaa 454

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RPA-F1

<400> 2

tatgcagccc actcaccacg cagagataag 30

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RPA-R1

<400> 3

ccgttctgaa gaagaagaag ccgtagtgat agac 34

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA1

<400> 4

aggatagaga tacagctctt cca 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA2

<400> 5

ataataggta atgtgatcgg ata 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA3

<400> 6

cgtaactgct catggtatca atc 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA4

<400> 7

tcgataagat tgataccatg agc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA5

<400> 8

atggaaattt atcgataaga ttg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA6

<400> 9

catcaaagtt ctgcagctct tac 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA7

<400> 10

atcgcattgc ctccgtagtg gaa 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA8

<400> 11

ctttgaagcc acgggaggaa tac 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA9

<400> 12

aagccacggg aggaatacca acc 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV P72 crRNA10

<400> 13

tattagttgg gacacggatt acg 23

<210> 14

<211> 3744

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cpf1蛋白核酸序列

<400> 14

agcaagctgg aaaaatttac caactgctac agcctgagca agaccctgcg tttcaaagcg 60

atcccggttg gcaagaccca ggaaaacatt gacaacaaac gtctgctggt tgaggacgaa 120

aagcgtgcgg aggattataa aggtgtgaag aaactgctgg atcgttacta tctgagcttt 180

atcaacgacg tgctgcacag cattaagctg aaaaacctga acaactacat cagcctgttc 240

cgtaagaaaa cccgtaccga gaaggaaaac aaagagctgg aaaacctgga aatcaacctg 300

cgtaaggaga ttgcgaaggc gttcaagggt aacgagggct acaagagcct gttcaagaaa 360

gatatcatcg aaaccatcct gccggagttc ctggacgata aggacgaaat tgcgctggtt 420

aacagcttca acggttttac caccgcgttc accggcttct ttgataaccg tgagaacatg 480

tttagcgagg aagcgaaaag caccagcatc gcgttccgtt gcattaacga aaacctgacc 540

cgttacatca gcaacatgga cattttcgag aaggttgacg cgatctttga taaacacgag 600

gtgcaggaaa tcaaggagaa aattctgaac agcgactatg atgttgaaga tttctttgag 660

ggtgaattct ttaactttgt tctgacccaa gagggcatcg acgtgtacaa cgcgatcatt 720

ggtggcttcg tgaccgaaag cggcgagaag atcaaaggcc tgaacgagta cattaacctg 780

tataaccaga agaccaaaca aaagctgccg aaatttaagc cgctgtataa gcaggtgctg 840

agcgatcgtg aaagcctgag cttctacggc gagggctata ccagcgacga ggaagttctg 900

gaagtgtttc gtaacaccct gaacaaaaac agcgagatct tcagcagcat taagaaactg 960

gaaaagctgt tcaaaaactt tgacgagtac agcagcgcgg gtatctttgt taagaacggc 1020

ccggcgatca gcaccattag caaagatatc ttcggtgaat ggaacgtgat tcgtgacaag 1080

tggaacgcgg agtatgacga tatccacctg aagaaaaagg cggtggttac cgaaaagtac 1140

gaggacgatc gtcgtaaaag cttcaaaaag attggcagct ttagcctgga acagctgcaa 1200

gagtacgcgg acgcggatct gagcgtggtt gaaaaactga aggagatcat tatccagaag 1260

gttgatgaaa tctacaaagt gtatggtagc agcgagaagc tgttcgacgc ggattttgtt 1320

ctggagaaga gcctgaaaaa gaacgacgcg gtggttgcga tcatgaagga cctgctggat 1380

agcgtgaaaa gcttcgaaaa ctacattaag gcgttctttg gtgaaggcaa agagaccaac 1440

cgtgacgaga gcttctatgg cgattttgtt ctggcgtacg acatcctgct gaaggtggac 1500

cacatctacg atgcgattcg taactatgtt acccaaaaac cgtacagcaa ggataagttc 1560

aagctgtact tccagaaccc gcaattcatg ggtggctggg acaaggataa agagaccgac 1620

tatcgtgcga ccatcctgcg ttacggtagc aagtactatc tggcgattat ggataaaaag 1680

tacgcgaaat gcctgcagaa gatcgacaaa gacgatgtta acggtaacta cgaaaagatc 1740

aactacaagc tgctgccggg cccgaacaag atgctgccga aagtgttctt tagcaaaaag 1800

tggatggcgt actataaccc gagcgaggac atccaaaaga tctacaagaa cggtaccttc 1860

aaaaagggcg atatgtttaa cctgaacgac tgccacaagc tgatcgactt ctttaaagat 1920

agcattagcc gttatccgaa gtggagcaac gcgtacgatt tcaactttag cgagaccgaa 1980

aagtataaag acatcgcggg tttttaccgt gaggttgagg aacagggcta taaagtgagc 2040

ttcgaaagcg cgagcaagaa agaggtggat aaactggtgg aggaaggtaa actgtacatg 2100

ttccaaatct acaacaagga cttcagcgat aagagccacg gcaccccgaa cctgcacacc 2160

atgtacttca agctgctgtt tgacgaaaac aaccatggtc agatccgtct gagcggtggc 2220

gcggagctgt tcatgcgtcg tgcgagcctg aagaaagagg agctggttgt gcacccggcg 2280

aacagcccga ttgcgaacaa aaacccggat aacccgaaaa agaccaccac cctgagctac 2340

gacgtgtata aggataaacg ttttagcgaa gaccaatacg agctgcacat tccgatcgcg 2400

attaacaagt gcccgaaaaa catcttcaag attaacaccg aagttcgtgt gctgctgaaa 2460

cacgacgata acccgtatgt tatcggtatt gaccgtggcg agcgtaacct gctgtacatc 2520

gtggttgtgg acggtaaagg caacattgtg gaacagtata gcctgaacga gattatcaac 2580

aactttaacg gtatccgtat taagaccgat taccacagcc tgctggacaa aaaggagaag 2640

gaacgtttcg aggcgcgtca gaactggacc agcatcgaaa acattaagga gctgaaagcg 2700

ggctatatca gccaagttgt gcacaagatt tgcgaactgg ttgagaaata cgatgcggtg 2760

atcgcgctgg aggacctgaa cagcggtttt aagaacagcc gtgttaaggt ggaaaagcag 2820

gtttaccaaa agttcgagaa gatgctgatc gataagctga actacatggt ggacaaaaag 2880

agcaacccgt gcgcgaccgg tggcgcgctg aaaggttatc agattaccaa caagttcgaa 2940

agctttaaaa gcatgagcac ccaaaacggc ttcatctttt acattccggc gtggctgacc 3000

agcaaaatcg atccgagcac cggttttgtt aacctgctga agaccaaata taccagcatt 3060

gcggatagca aaaagttcat cagcagcttt gaccgtatta tgtacgtgcc ggaggaagac 3120

ctgttcgagt ttgcgctgga ctataagaac ttcagccgta ccgacgcgga ctacatcaaa 3180

aagtggaaac tgtacagcta tggtaaccgt atccgtattt tccgtaaccc gaaaaagaac 3240

aacgtttttg actgggagga agtgtgcctg accagcgcgt ataaggaact gttcaacaaa 3300

tacggtatca actatcagca aggcgatatt cgtgcgctgc tgtgcgagca gagcgacaag 3360

gcgttctaca gcagctttat ggcgctgatg agcctgatgc tgcaaatgcg taacagcatc 3420

accggtcgta ccgatgttga ttttctgatc agcccggtga aaaacagcga cggcattttc 3480

tacgatagcc gtaactatga agcgcaggag aacgcgattc tgccgaagaa cgcggacgcg 3540

aacggtgcgt ataacatcgc gcgtaaagtt ctgtgggcga ttggccagtt caaaaaggcg 3600

gaggacgaaa agctggataa ggtgaaaatc gcgattagca acaaagaatg gctggagtac 3660

gcgcaaacca gcgttaagca cgagaacctg tacttccaat cccaccacca ccaccaccac 3720

caccaccacc accaccacca ctga 3744

<210> 15

<211> 454

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV I亚型 P72基因片段

<400> 15

gattggcaca agttcggaca tgttgttaac gccattatgc agcccactca ccacgcagag 60

ataagctttc aggatagaga tacagctctt ccagacgcat gttcatctat atctgatatt 120

agccccgtta cgtatccgat cacattacct attattaaaa acatttccgt aactgctcat 180

ggtatcaatc ttatcgataa gtttccatca aagttctgca gctcttacat acccttccac 240

tacggaggca atgcaattaa aacccccgat gatccgggtg cgatgatgat tacctttgct 300

ttgaagccac gggaggaata ccaacccagt ggtcatatta acgtatccag agcaagagaa 360

ttttatatta gttgggacac ggattacgtg gggtctatca ctacggcttc ttcttcttca 420

gaacggttca gctgtgctgc gttacagtac ctaa 454

<210> 16

<211> 454

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASFV III亚型 P72基因片段

<400> 16

gattggcaca agttcggaca tgttgttaac gccattatgc agcccactca ccacgcagag 60

ataagctttc aggatagaga tacagctctt ccagacgcat gttcatctat atctgatatt 120

agccccgtta cgtatccgat cacgttacct attattaaaa acatttccgt aactgctcat 180

ggtatcaatc ttatcgataa atttccatca aagttctgca gctcttacat acccttccac 240

tacggaggca atgcgattaa aacccccgat gatccgggtg cgatgatgat tacctttgct 300

ttgaagccac gggaggaata ccaacccagt ggtcatatta acgtatccag agcaagagaa 360

ttttatatta gttgggatac ggattacgtg gggtctatca ctacggcttc ttcttcttca 420

gaacggttca gctgtgctgc gttacagtac ctaa 454

Claims (6)

1.一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，包括适用于非洲猪瘟病毒快速检测的Cpf1检测体系与免疫胶体金试纸条；所述Cpf1检测体系包括：针对非洲猪瘟病毒P72基因的特异性crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告系统；所述特异性crRNA为ASFVP72 crRNA1到ASFV P72 crRNA10中的任意一种或多种，其序列为SEQ NO.4到SEQ NO.13；所述ssDNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter；其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQreporter/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNA DB reporter为利用地高辛和生物素标记的ssDNA,标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/；所述免疫胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线。

2.如权利要求1所述用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，所述特异性crRNA的制备方法包括：针对ASFV II亚型P72基因，寻找包含cpf1识别序列TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA，分别命名为ASFV P72 crRNA1到ASFV P72 crRNA10，设计完成后，合成oligo，构建到载体pUC57-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA。

3.如权利要求1所述用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，所述crRNA为ASFV P72 crRNAmix，所述ASFV P72 crRNAmix为ASFV P72 crRNA1到ASFV P72crRNA10的10种crRNA的等比例混合物。

4.如权利要求1所述用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，所述Cpf1蛋白的制备方法包括：针对cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列SEQ14，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。

5.一种非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法，其特征在于，采用权利要求1～4任一项所述的用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒。

6.如权利要求5所述的非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法包括以下步骤：

步骤a：利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；

步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用ASFV特异性引物SEQ NO.2和SEQ NO.3，加入RPA等温扩增体系，在37℃反应20min扩增获得特异性产物；

步骤c：利用Cpf1检测体系检测ASFV核酸：将步骤b中产物加入Cpf1检测体系，于37℃反应30min；

步骤d：利用免疫胶体金试纸条检测样品中ASFV核酸。