CN110951920B

CN110951920B - 非洲猪瘟病毒的检测试剂盒与检测方法

Info

Publication number: CN110951920B
Application number: CN201911364444.2A
Authority: CN
Inventors: 姚杰; 程诚; 王恩慧; 杨欣; 毕延震
Original assignee: Wuhan Aikesha Technology Co ltd; Wuhan Bojie Biomedical Science And Technology Co ltd; Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Wuhan Aikesha Technology Co ltd; Wuhan Bojie Biomedical Science And Technology Co ltd; Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2039-12-26
Also published as: CN110951920A

Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒的crRNA、检测试剂盒与检测方法，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.5‑7任一所示。所述试剂盒包括所述crRNA；还包括DNA酶抑制剂、cpf1蛋白、待检测样本的扩增体系。本发明将用于检测非洲猪瘟病毒的crRNA组成的检测试剂(CRISPR/Cpf1检测体系)与RPA等温扩增合为一个步骤，并且以胶体金试纸条的形式呈现检测结果，操作简便、时间短，无需仪器，等温反应即可。方法简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强。

Description

非洲猪瘟病毒的检测试剂盒与检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒与检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起猪的一种烈性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与传统猪瘟症状相似且综合症状复杂难辨，它们的亚急性型和慢性型在生产现场实际上是不能区别的，只能依靠实验室监测确诊。中国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病。近年来，非洲猪瘟从西欧向东欧扩散，格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯、乌克兰等国先后发生多起非洲猪瘟疫情，并于去年8月传入我国。截至目前已相继有18个省(直辖市)报道了111起非洲猪瘟疫情，由于目前世界上还没有研发出有效的针对非洲猪瘟的疫苗，为防止疾病传播疫点内的生猪只能被全部扑杀和无害化处理，给养殖业带来巨大经济损失。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的非洲猪瘟现场检测技术就显得非常迫切。

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)属非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，是一种有囊膜的双链DNA病毒，也是唯一的虫媒DNA病毒。非洲猪瘟病毒粒子主要由病毒基因组(Genome)、核心壳(Coreshell)、内膜(Inner envelope)、衣壳(Capsid)和囊膜(External envelope)组成，外形似正六边形，直径约200nm，呈20面体对称。非洲猪瘟病毒基因组不具有感染性，可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制，但有一个短暂的入核过程，对病毒的复制起始有着重要作用，因此非洲猪瘟病毒复制机制与痘病毒比较相似。而且该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。本病毒能从被感染猪之血液、组织液、内脏，及其他排泄物中证实出来，低温暗室内存在血液中之病毒可生存六年，室温中可活数周，加热被病毒感染的血液55℃30分钟或60℃10分钟，病毒将被破坏，许多脂溶剂和消毒剂可以将其破坏。

非洲猪瘟病毒在环境中的抵抗力比较强，ASFV在PH＝4～13的环境中能稳定存活，在粪便内可存活11天，在4℃的血液中可存活18个月。因此，传统的“采样-送检-实验室检测-出具报告”模式已经不太适合，因为这些临床样品的采集、传递等可能会造成一些病源污染或病毒散播。而且，传统的病原学诊断方法结果较虽然可靠，普及性广，稳定性高，但敏感性低，容易造成漏诊、误诊。传统的分子检测技术以基因扩增为主，包括核酸杂交技术、常规PCR、巢式PCR、多重PCR等技术。PCR技术敏感、特异、高效、快速，但假阳性高。核酸杂交技术具有灵敏度高，特异性强，实用性好的特点，是多种动物疫病诊断的常规方法，但操作复杂、成本高，普通实验室没有相应设备，易出现假阳性。基因芯片和高通量测序技术快速简便、特异性强、灵敏度高和高通量化，但成本高和对操作人员水平要求高。这就使得开发ASF的简便、快速、精准的现场诊断方法变得尤为重要。因此，亟需提供一种简单快速，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒与检测方法，检测快速，特异性强，灵敏度高。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一在于提供用于检测非洲猪瘟病毒的crDNA，所述crDNA包括如下所示crDNA中的一种：

crDNA1：其序列如SEQ ID NO.2所示；

crDNA2：其序列如SEQ ID NO.3所示；

crDNA3：其序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测非洲猪瘟病毒的crRNA，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.5-6任一所示。

本发明的目的之三在于提供一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，含有所述的crDNA或者所述crRNA。

优选地，所述试剂盒还包括荧光探针，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示(5’-CTCACTACAGACGCACGCTA-3’)；

采用荧光检测机器时所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团；所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种；

采用胶体金试剂盒检测时，所述荧光探针的序列的5’端或3’端均标记有荧光基团，3’端或5’端标记有生物素。具体地，本发明选用所述荧光探针的序列的3’端标记有生物素，5’端标记的有cy5。

优选地，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂、cpf1蛋白。

优选地，所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒或实时荧光定量检测试剂盒。

作为以上实施方式之一，所述胶体金检测试剂盒包括底板，粘合在所述底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、层析基质和吸水垫；所述结合垫上涂有单克隆抗体包被的胶体金复合物；所述层析基质上靠近结合垫的一侧设有质控线，靠近吸水垫的一侧设有检测线；所述质控线上涂有链霉亲和素；所述检测控线上涂有鼠抗。

本发明的目的之四在于提供所述的crRNA、以及所述的试剂盒在用于检测非洲猪瘟病毒上的用途。

本发明的目的之五在于提供一种非洲猪瘟病毒的检测方法，包括如下步骤：

S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；

S2、将所述的扩增产物、所述的crRNA、cpf1蛋白、SEQ ID NO.8所示的荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。

优选地，将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测或者将所述检测体系孵育后荧光检测仪测定荧光值。需要说明的是，采用荧光检测机器时与采用胶体金试剂盒检测时所述荧光探针两端的标记不一样，具体如上所述。

作为以上实施方式之一，将扩增产物、cpf1蛋白/crRNA复合物溶液，加入荧光探针和无酶水孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区。将所述检测体系滴加在所述试剂盒中的样品垫上，并观察质控带、检测带；若在检测带上形成肉眼可见的有色线条，则判断为阳性；否则为阴性。本发明提供了一种基于CRISPR-cpf1系统以胶体金可视化检测荧光基团，以试纸条的形式呈现检测结果，操作简便，无需仪器，具有很强的适用范围和场所，实用性极强。

作为以上另一种优选方式之一，将扩增产物、cpf1/crRNA复合物溶液，加入荧光探针和无酶水孵育后荧光检测仪测定荧光值。可以做成便携式检测仪可以随时随地及时检测，这些应用和方法为后续试剂盒的开发，临床诊断的应用提供了平台，适用于大规模临床样本检测。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒的crRNA、试剂盒及检测方法，运用此crRNA结合CRISPR-cpf1系统进行非洲猪瘟病毒的检测的方法，此方法具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10拷贝/uL)、特异性强。

本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，将用于检测非洲猪瘟病毒的crRNA组成的检测试剂(CRISPR/Cpf1检测体系)与RPA等温扩增合为一个步骤，并且以胶体金试纸条的形式呈现检测结果，操作简便、时间短，无需仪器，等温反应即可。

附图说明

图1为本发明试剂盒中检测试纸结构示意图；图中：1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、质控线；6、检测线；7、吸水垫；

图2为本发明试剂盒的特异性检测结图；

图3为本发明试剂盒的灵敏性检测结果。

具体实施方式

实施例1用于检测非洲猪瘟病毒的crRNA的的设计及获得

1、首先根据ASFV SY18毒株的p72(B646L)基因特异性序列如SEQ ID NO.1所示设计3条特异性的带T7启动子的crDNA序列，其序列分别如SEQ ID NO.2-4所示。

2、crRNA的获得：反转录体系如表1所示，反转录的条件为37℃孵育过夜。

表1

经T7 polymerase体外转录成crRNA，并纯化得到crRNA所述crRNA的序列如SEQ IDNO.5-7所示。

实施例2非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及检测方法

1、试剂盒的组成(本发明以胶体金试剂盒为例)

(1)检测试剂：

非洲猪瘟病毒的crRNA(如SEQ ID NO.5-7任一所示)；

一条特异性荧光探针(序列如SEQ ID NO.8所示，所述序列的3’端标记有生物素，5’端标记的有cy5)；

cpf1蛋白；

无酶水；

DNA酶抑制剂。

(2)所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒时，如图1所示，所述胶体金检测试剂盒包括底板1，粘合在底板1上且依次搭接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫7；所述硝酸纤维膜4上靠近结合垫3的一侧设有质控线5，硝酸纤维膜4上靠近吸水垫7的一侧设有检测线6；所述结合垫3上涂有cy5单克隆抗体包被的胶体金；所述质控线5上涂有链霉亲和素；所述检测控线6上涂有鼠抗。所述底板1为PVC板；样品垫为硝酸纤维素膜；结合垫的材料为玻璃纤维素膜；所述吸水垫7为吸水滤纸。所述检测试纸由硬质塑料卡包装。

2、胶体金试剂盒的制备方法

(1)制作颗粒大小合适的胶体金溶液

(2)用兔抗Cy5单克隆抗体包被胶体金，得到包被后的胶体金溶液；

(3)将包被后的胶体金溶液喷于结合垫上，烘干备用；

(4)在硝酸纤维膜上检测线位置喷鼠抗溶液；在质控线位置喷链霉亲和素溶液，烘干备用；

(5)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成检测试纸条，将检测试纸条用硬质塑料卡包装。

优选地，所述胶体金直径为13-40nm。胶体金合成的影响因素诸多，每次合成尽量保证操作一致，以减少合成的胶体金批间差异。另外对每次合成的胶体金进行颜色和全光谱扫描比较，可以大致判断合成胶体金纳米颗粒大小。配制1％(m/v)的氯金酸于棕色试剂瓶密封保存4冰箱备用；取1mL 1％(m/v)的氯金酸溶液与99mL的超纯水中，于棕色100mL的容量瓶定容混匀。加入到预热干燥的250mL锥形瓶中，加热至沸腾并煮沸15min；快速加入还原剂1％(m/v)柠檬酸钠2.75mL。加入还原剂的过程要迅速，连续。持续加热沸腾5min左右，冷却至室温。该过程中溶液先变成灰色，后迅速变为黑色，3min左右变为酒红色，为减少蒸发，当溶液变为稳定的酒红色，沸腾5min停止加热。

优选地，所述用鼠抗cy5单克隆抗体包被胶体金。取20mL配制好的胶体金溶液于50mL锥形瓶中，一般调节胶体金最高吸收值在0.4-0.6左右；加入480μL 2％的K2CO3调pH，加入1.2mL稀释至1mg/mL的SPA室温下连续搅拌30min(标记抗体时先加入960μL 2％的K₂CO₃调pH，加入鼠抗cy5抗体1.8mL)；逐滴加入配制好的10％(m/v)的BSA 1.6mL，室温下连续搅拌30min；逐滴加入配制好的10％(m/v)的PEG-4 000 1.6mL，室温下连续搅拌30min；分装、离心，12 000r/min 4℃离心30min，小心移取上清，用10mmol/L pH 8.0的Tris-Base缓冲溶液洗涤两次，将未标记的蛋白洗涤掉；最后一次1 000r/min低速离心30min，去掉大的聚沉的胶体金颗粒，之后用2mL的10mmol/L pH 8.0的Tris-Base缓冲溶液重悬并置于4℃冰箱保存，如果要长期保存可以加入0.05％叠氮化钠和1％BSA作为保护稳定剂。对标记后免疫胶体金测吸收光谱，判断免疫胶体金的质量。

优选地，所述免疫胶体金结合垫选用吸附能力为54μL/cm²的玻璃纤维膜，经0.01mol/L pH 8.0的含1％BSA的TBST处理半个小时，活化材料表面使胶体金更容易释放，在37℃培养箱烘干后，将处理好的玻璃纤维膜裁成0.5cm×6cm大小，每条用200μL移液器吸取150μL免疫标记胶体金均匀涂抹，置于37℃，湿度约40％的培养箱2h烘干。烘干后如不立即组装试纸条，需置于装有干燥剂的铝箔袋中密封保存。

优选地，所述硝酸纤维素膜是免疫胶体金层析试纸条中的重要材料，主要影响因素包括流速和蛋白质结合力，其中最为关键的是流速的选择。本实验选用爬速为50-225s的规格为2.5cm×50m Pall vivid 170，是最为常用的硝酸纤维素膜，其孔径为8μm，喷膜量为0.6μL-0.8μL。因此T线(链霉亲和素)和C线(鼠抗)喷膜量定为0.8μL，T线处链霉亲和素浓度设定为2mg/mL，C线处鼠抗浓度设定为2mg/mL。喷膜后置于37℃干燥30min，置于洁净的封口袋中加入干燥剂后密封，室温保存备用。

优选地，为使样品更易释放并减少免疫反应的非特异性吸附，样品垫经0.01mol/LpH 8.0的含1％BSA的TBST处理半个小时，在37℃培养箱烘干并裁成2.1cm×30cm的长条，置于洁净的密封袋中。吸水垫裁成1.6cm×30cm的长条，置于洁净的密封袋中。

3、试剂盒的使用方法

(1)提取待检血浆样本的DNA，取50-100ng加入等温扩增体系中(RPA等温扩增反应成分，对应的等温扩增引物对如SEQ ID NO.9-10所示；或者如SEQ ID NO.11-12所示)；扩增体系如表2所示。

表2

(2)将所述得到的扩增产物、与所述检测试剂：crRNA、cpf1蛋白、荧光探针和无酶水一起制成检测体系。

表3

将所述检测体系混匀在37℃孵育1～3小时。同时设立阴性对照组。

(3)将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测；判定规则为：

A、当检测区显色，且质控区也显色，则待测样品检测结果为阳性；

B、当检测区不显色，且质控区显色，则待测样品检测结果为阴性；

C、当质控区不显色，则试纸条无效，需要用新的试纸条重新测定。

具体地：使用本试剂盒时，如图1所示，将待测标本加入到点样孔，待测标本在毛细作用下沿着样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜向吸水滤纸端方向层析；检测时，如果待测标本中的含有检测物非洲猪瘟病毒，结合垫上的金标抗体复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，生物素被质控线上的链霉亲和素捕获，这样检测线位置出现标记胶体金的红色，标记金颗粒和cy5继续向前，到达检测线线区域时，与其上包被的鼠抗发生结合，显现出胶体金的红色线条，此为检测线；检测时，如果待测物中不含非洲猪瘟病毒，样品先与结合垫上的金标抗体结合并使之复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，被质控线上的链霉亲和素捕获，生物素-cy5报告探针同时被截留，标记金颗粒继续向前，到达检测线区域时，无法与其上包被的鼠抗发生结合，无法显现出胶体金的红色线条，此为检测线。

实施例3特异性检测

根据确立的反应体系进行特异性实验，使用本发明设计的引物对不同病毒的质粒DNA模板(ASFV阳性质粒、猪蓝耳病毒(PRRS)、猪细小病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性DNA或cDNA、猪圆形病毒2型(PCV2))进行实验，检测结果如图2所示，图2结果表明除了ASFV阳性质粒外，其他几个病毒的质粒均没有扩增，从而证明试验方法的特异性良好。电泳结果与试纸条结果一致。

实施例4灵敏性试验

为了确定本方法的最小检出量，将合成的质粒标准品稀释成10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μL等7个浓度梯度后作为模板进行检测。结果如图3所示。由图3结果可知，本发明具有较广的检测范围，其最低检测限为10¹拷贝/μL。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉博杰生物医学科技有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒的检测试剂盒与检测方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 979

<212> DNA

<213> 基因片段(ASFV P72)

<400> 1

ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattccctg gacgaatata gttcggatgt 60

cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa atgactggat ataagcactt 120

ggtcggccag gaggtatcgg tggagggaac tagtggccct ctcctatgca acattcatga 180

tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat gaaaatgata cgcagcgaac 240

gtgcagccat accaacccga aattcctttc acaacatttt cccgagaact ctcacaatat 300

ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tattacggac gcaacgtatc tggacataag 360

acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct aaatactatc agccccctct 420

tgcgctctgg attaagctgc gcttttggtt taacgagaac gtgaaccttg ctattccctc 480

ggtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag cttgcatcgc aaaaggattt 540

ggtgaatgaa tttcctggac tttttatacg ccagtcgcgt tttatacctg gacgccccag 600

tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga gtcattaatg aaatctcgct 660

cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc cctgaaatac acaacctttt 720

tgtaaaacgc gttcgatttt ccctgatacg tgtccataaa acgcaggtga cccacaccaa 780

caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa tggcccattg aatatatgtt 840

tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat cctcatcaac accgagattg 900

gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagcct actcaccacg cagagataag 960

ctttcaggat agagatacg 979

<210> 2

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttggatattg tgagagttct cggatctaca acagtagaaa ttccctatag tgagtcgtat 60

taatttc 67

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgtctactg gggcgtccag gtaatctaca acagtagaaa ttccctatag tgagtcgtat 60

taatttc 67

<210> 4

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttcatta atgactcctg ggaatctaca acagtagaaa ttccctatag tgagtcgtat 60

taatttc 67

<210> 5

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aauuucuacu guuguagauc cgagaacucu cacaauaucc aa 42

<210> 6

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aauuucuacu guuguagauu accuggacgc cccaguagac gc 42

<210> 7

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aauuucuacu guuguagauu cccaggaguc auuaaugaaa uc 42

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcactacag acgcacgcta 20

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agccgcacca aagcaaacct attcttaccg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggccatt taagagcaga cattagtttt 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tacgcagcga acgtgcagcc ataccaaccc 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcggtgttga tgaggatttt gatcggaga 29

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒的crDNA和/或crRNA，其特征在于，所述crDNA包括如下所示crDNA中的一种：

crDNA1：其序列如SEQ ID NO.2所示；

crDNA2：其序列如SEQ ID NO.3所示；

crDNA3：其序列如SEQ ID NO.4所示；

所述crRNA的序列如SEQ ID NO.5-7任一所示。

2.一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的crDNA或者crRNA。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光探针，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.8所示；

采用胶体金试剂盒检测时，所述荧光探针的序列的5’端或3’端均标记有荧光基团，3’端或5’端标记有生物素。

4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂、cpf1蛋白。

5.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒或实时荧光定量检测试剂盒；所述胶体金检测试剂盒包括底板，粘合在所述底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、层析基质和吸水垫；所述结合垫上涂有单克隆抗体包被的胶体金复合物；所述层析基质上靠近结合垫的一侧设有质控线，靠近吸水垫的一侧设有检测线；所述质控线上涂有链霉亲和素；所述检测控线上涂有鼠抗。

6.权利要求1所述的crDNA、crRNA、以及权利要求2-5任一所述的试剂盒在用于检测非洲猪瘟病毒非疾病诊断和治疗目的上的用途。

7.一种非洲猪瘟病毒非疾病诊断和治疗目的的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；

S2、将所述的扩增产物、权利要求1所述的crRNA、cpf1蛋白、SEQ ID NO.8所示的荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，将所述检测体系滴加在所述试剂盒中的层析试纸条的样品垫上，并观察质控带、检测带；若在检测带上形成肉眼可见的有色线条，则判断为阳性；否则为阴性。

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，将所述检测体系孵育后使用荧光检测仪测定荧光值。