CN113122648B - 一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113122648B
CN113122648B CN202110343962.7A CN202110343962A CN113122648B CN 113122648 B CN113122648 B CN 113122648B CN 202110343962 A CN202110343962 A CN 202110343962A CN 113122648 B CN113122648 B CN 113122648B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
rape
detection
kit
pathogenic bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110343962.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113122648A (zh
Inventor
雷荣
吴品珊
李明福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Original Assignee
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ filed Critical Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority to CN202110343962.7A priority Critical patent/CN113122648B/zh
Publication of CN113122648A publication Critical patent/CN113122648A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113122648B publication Critical patent/CN113122648B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

本发明涉及一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法，包括油菜茎基溃疡病菌和油菜黑胫病菌的快速检测试方法和试剂盒，致病菌的检测方法包括靶标核酸分子的特异性扩增和基于特异性向导RNA、Cas12a和核酸探针的特异性检测。使用本发明的方法可快速检测油菜植物组织中是否含有油菜茎基溃疡病菌和油菜黑胫病菌。通过与核酸等温扩增技术结合，该检测方法的灵敏度可以提到大幅提高，并且可在田间、检疫现场使用。油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒用于检测油菜茎基溃疡病菌或油菜黑茎病菌；具有灵敏度高、特异性好、耗时短、不依赖大型实验设备等优势，方便用于田间病害调查和基层实验室对油菜黑腿病病原菌的快速检测和鉴定诊断。

Description

一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及农业和植物检疫技术领域，具体涉及一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
油菜黑腿病(Phoma stem canker)是油菜上最严重的真菌病害之一，对油菜茎秆、种子、叶片和根均可造成危害，严重影响油菜生长及油菜籽产量。目前有两种真菌可引起油菜黑腿病，一种是强致病型油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans,Lm)，另一种是弱致病型油菜黑腿病菌(Leptosphaeria biglobosa,Lb)，为小球腔菌属的复合种。油菜茎基溃疡病菌致病力强，能引起油菜茎基部发生溃烂，严重时可导致油菜减产达30％-50％，甚至更高，是导致油菜黑腿病流行及产量损失的主要因素[1]，在澳大利亚、加拿大、美国、欧洲等油菜主产国广泛存在，中国未见报道。2007年L.maculans被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，为中国进境植物检疫性有害生物。近年我国口岸多次从进口澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境油菜籽中截获油菜茎基溃疡病菌L.maculans[2,3]，采用方法大多为种子挑拣、种子分离养、单菌落挑选、再培养、菌丝和孢子显微镜观察、进一步核酸提取、PCR特异性扩增或ITS基因通用引物PCR扩增测序等一系列流程，一般需要7-15天的时间才能得到结果。由于L.maculans与L.biglobosa为近似种，二者的ITS基因高度相似，当采用ITS通用引物扩增的序列在NCBI进行比对时，比对结果经常包含L.maculans和L.biglobosa，不能得到准确鉴定结论。因此准确鉴定进境油菜籽和油菜幼苗可能携带的油菜黑腿病病菌种类、分辨强致病型油菜茎基溃疡病菌(Lm)和弱致病型油菜黑腿病菌(Lb)成为防止油菜茎基溃疡病菌传播的技术关键。
目前，用于油菜黑腿病病菌种类鉴定的方法主要有滤纸培养法、普通PCR和实时荧光PCR[4]、环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)[5]和重组酶介导等温扩增(RPA)[6]等分子检测方法。常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，用时在90分钟左右。LAMP扩增方法针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性LAMP引物，利用一种链置换活性的Bst DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)孵育30-60min，完成扩增。RPA技术采用一对引物，采用重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶，在37℃-42℃之间即可完成扩增，是最适合于便携式快速检测方法所需的扩增技术。已报道的RPA实时荧光法可检测到21.6pg的Lm基因组DNA。对于从症状相同的植物组织提取的核酸，病原菌核酸浓度低，往往需要ITS通用引物PCR扩增后测序，所需时间长，且结果往往不明确。
因此，目前的技术不能满足我国田间或口岸对油菜黑腿病病菌的快速筛查与检测，尤其是快速准确有效的分辨强致病型油菜茎基溃疡病菌(Lm)和弱致病型油菜黑腿病菌(Lb)，因此迫切需要特异性好、灵敏高的相关检测方法。
专利参考文件
1.CN 101805794 B(油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针)，2012.05.02
2.CN101805793B(油菜茎基溃疡病菌的PCR检测方法及检测用引物),2012.04.18
发明内容
本发明的目的针对田间油菜黑腿病病原菌难以快速区分检测的难题，提供一种灵敏度高、特异性强、快速、可视化检测油菜黑腿病病原菌所需的便携式检测方法及试剂盒。
本发明提出一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒，其技术要点是：所述荧光检测试剂盒包括：10×Buffer 2μL，RNase Inhibitors(40U/μL)0.3-1.0μL，DTT 0.3-1.0μL，Cas12a(1μM)2-5μL，Lm crRNA或Lb crRNA(1μM)2-4μL，FQ reporter(1μM)或FB reporter(5μM)1-4μL，Lm或Lb扩增产物1-3μL；H2O(RNAase free Up to 20μL；
所述Cas12a切割识别位点为TTTN；
所述Lm crRNA为以下中任一种或几种；
Lm crRNA1(SEQ ID NO：1)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCCACCAUCUGGUCGCCGGU；
Lm crRNA2(SEQ ID NO：2)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUGCGGCUUCCUGGCAUGAG；
Lm crRNA3(SEQ ID NO：3)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAAUUUAGCCACCAUCUGGUC；
Lm crRNA4(SEQ ID NO：4)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAAUGGCCAUACUGGCGCG；
Lm crRNA5(SEQ ID NO：5)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAAUUUAGCCACCAUCUGGU；
Lm crRNA6(SEQ ID NO：6)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAUCGCACGCUUGAGAGCCUU；
Lm crRNA7(SEQ ID NO：7)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAUAUGGCCTCCGUAUGCAUG；
Lm crRNA8(SEQ ID NO：8)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAAGACACCUAUGAUCCA；
Lm crRNA9(SEQ ID NO：9)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAAUUUAGCCACCAUCUGGU；
Lm crRNA10(SEQ ID NO：10)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUCAUGCAUACGGAGGCCA；
Lm crRNA11(SEQ ID NO：11)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUACACGAAUCCCGCCUUUUC；
Lm crRNA12(SEQ ID NO：12)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAAGUGCGGCUGUGUUGAGA；
所述Lb crRNA为以下中任一种或几种；
Lb crRNA1(SEQ ID NO：13)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAGGGAGCUGAGGCUGUGGC
Lb crRNA2(SEQ ID NO：14)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUGGGGCGGAUUUCUUAAGCC；
Lb crRNA3(SEQ ID NO：15)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCUUUCUUGUGCAGAUGCGC；
Lb crRNA4(SEQ ID NO：16)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCCUCGAGCUUUACGCCAU；
Lb crRNA5(SEQ ID NO：17)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUAUAUCGCCUACACGGAUCC；
Lb crRNA6(SEQ ID NO：18)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCCAAGCCCACAUCGUCUUCU；
Lb crRNA7(SEQ ID NO：19)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCCUCGAGCUUUACGCCAUC；
Lb crRNA8(SEQ ID NO：20)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUAAGCCUGUGUUGGAGCGG；
Lb crRNA9(SEQ ID NO：21)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGUUCGGCAAUGGGGCAAC；
Lb crRNA10(SEQ ID NO：22)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUGUGCAGAUGCGCUGCCAU；
Lb crRNA11(SEQ ID NO：23)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCCGCCGGAGAAGGCGUGCA；
Lb crRNA12(SEQ ID NO：24)：
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAAGCUCUGUAGUGCACGCC；
所述FQ reporter为荧光基团-TTTATTT-淬灭荧光基团的物质；所述荧光基团为FAM、FITC、其它与检测器激发波长和发射波长匹配的荧光基团；所述淬灭荧光基团的物质为BHQ1、BHQ2、其它可淬灭荧光基团的物质；
所述FB reporter为抗原分子-TTTATTT-Biotin，所述荧光基团为FAM、FITC，罗丹明、地高辛等与试纸条抗体匹配的抗原分子；
进一步的，所述Lm或Lb扩增产物获得方法为：
(1)提取待测样品核酸
待测样品包括待测病原菌或油菜籽或油菜植物残基；
(2)核酸扩增
分别采用Lm或Lb特异性引物，加入重组酶聚合酶(RPA)等温扩增体系，获得Lm或Lb特异性扩增产物；
所述Lm特异性引物的核苷酸序列为：
Lm-正向：TGCCCATCGATGTCAAGTTCGTTGAGTAC(SEQ ID NO：25)；Lm-反向：CCATGGCGGC ATCCGCATAT CCAGAGGGCA GC(SEQ ID NO：
26)
所述Lb特异性引物的核苷酸序列为：
Lb-正向:CCAACACAGGCTTAAGAAATCCGCCCCAGA(SEQ ID NO：27)
Lb-反向:CCGTGCCTTGACTCTGCTGCCCGTGCCAAG(SEQ ID NO：28)
所述油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒的使用方法为：
所述油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒用于检测油菜茎基溃疡病菌(Lm)或油菜黑茎病菌(Lb)；
试剂盒各组分添加后，在37℃反应20-40min，获得Cas12切割产物；所述Cas12切割产物通过荧光检测方法或胶体金试纸条检测方法鉴定Lm或Lb；
所述荧光检测方法：利用荧光仪、蓝光切胶仪，荧光手电筒或胶体金试纸条检测Cas12切割产物；所述荧光仪检测波长设置为485nm；
所述胶体金试纸条检测方法：把Cas12切割产物与PBST缓冲液(PBS和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合，二者体积比为1:4，将试纸条浸入混合物中，观察控制线和检测线，控制线出现条带后取出试纸条，在5分钟内进行肉眼观察并判定结果，如果待测样品出现与阳性对照样品一样位置的明显检测线条带，说明样品含有目标菌，否则样品不含有目标菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用油菜茎基溃疡病菌和油菜黑胫病菌的特异性effector基因，具高特异性和保守性。
(2)本发明利用CRISPR/Cas12(Cpf1)特异性识别核酸联合胶体金试纸条，实现对Lm或Lb基因组核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。根据Cas12a识别特定TTTN特定PAM序列特点，在特异性基因靶序列上设计12个特异性crRNA。通过检测发现12个crRNA均能特异性识别Lm或Lb。
(3)本发明公开了一系列用于油菜黑腿病病原菌鉴定的CRISPR反应体系和crRNA组合，其序列依次如所示。本发明系首次采用CRISPR/Cas检测油菜茎基溃疡病菌和油菜黑茎病菌，具有灵敏度高、特异性好、耗时短、不依赖大型实验设备等优势。这此优势使用本发明开发的胶体金试纸条检测方法方便用于田间病害调查和基层实验室对油菜黑腿病病原菌的快速检测和鉴定诊断。
附图说明
图1为Lm基因组DNA扩增产物的荧光检测信号图；
图中各曲线分别代表的Lm基因组浓度为：1,2.16ng；2,0.216ng；3,21.6pg；4,2.16pg；5,0.216pg；6,21.6fg。
图2为Lm蓝光切胶仪检测结果；
图中其中1号代表21.6pg Lm基因组DNA，2号代表2.16pg基因组DNA；3号为2.4ngLb；4号为1.8ng向日葵茎溃疡病菌DNA；5号为阴性对照。
图3为Lm便携式荧光手电筒检测结果；
图中1号代表1.8ng向日葵茎溃疡病菌DNA；2号代表2.4ng Lb中国种；3号代表Lb英国株系；4号代表0.6ng Lm英国株系；5号代表1.1ng Lm加拿大株系；6号代表0.216pg Lm基因组DNA；7号为阴性对照。
图4Lm基因组DNA扩增产物的试纸条检测结果；
图中编号1-6分别代表的基因组浓度为：1,阴性对照；2,0.216pg；3,2.16pg；4,21.6pg；5,0.216ng；6,2.16ng
图5Lb基因组DNA扩增产物的荧光检测信号图；
图中各曲线分别代表的Lb基因组浓度为：1,1.8ng；2,0.18ng；3,0.018ng；4,1.8pg；5,0.18pg；6,1.8fg。
图6为Lb蓝光切胶仪检测结果；
图中1号代表1.8ng Lb基因组DNA，2号代表0.18ng Lb基因组DNA；3号为0.018ngLb基因组DNA；4号为1.8pg Lb基因组DNA；5号为2.16ng Lm基因组DNA；6号为阴性对照；7号Lb英国株系。
图7为Lb便携式荧光手电筒检测；
图中1号代表0.01ng Lm基因组DNA；2号代表1.8ng Lb基因组DNA；3号为0.18ng Lb基因组DNA；4号0.018ng Lb基因组DNA；5号为1.8pg Lb基因组DNA；；6号为阴性对照。
图8为Lb试纸条检测结果；
图中Lb引物和Lb crRNA扩增真菌基因组的试纸条检测结果：1,1.8ng；2,0.018ng；3,1.8pg；4,0.18pg；5,阴性对照。
图9为采用Lm特异性引物和相应crRNA检测真菌基因组DNA扩增产物的荧光检测信号图；
经测序验证为Lm的样品为：E9,E8,Lm-Can2 S,Lm-Can1；经测序验证为Lb的样品为：3658,E1,Lb-china；黑线为阴性对照。
图10采用Lb特异性引物和相应crRNA检测真菌基因组DNA扩增产物的荧光检测信号图；
经测序验证为Lm的样品为：Lm-Can2 S,Lm-Can1；经测序验证为Lb的样品为：E1,E6,Lb-china；经测序验证为向日葵茎溃疡病菌的样品为：Li黑线为阴性对照。
图11采用Lm特异性引物和crRNA的检测结果；
其中测序验证为Lm的条带1,Lm-can2 S；2,E9；3,Lm-can1；4,E8；
测序验证为Lb的条带：5,Lb-china；6,E1。
图12采用Lb特异性引物的检测结果；
测序验证为Lb的样品：1,Lb-can2；3,Lb-can1；4,Lb-china；6，编号43-1的油菜茎秆；7，编号30-1的油菜茎秆；测序验证为Lm的样品：2,Lm-can1；5,甘肃萝卜分离的真菌；8；阴性对照。
具体实施方式
实施例1油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法
所述油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒用于检测油菜茎基溃疡病菌(Lm)或油菜黑茎病菌(Lb)；所述油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒包括荧光检测试剂盒或胶体金试纸条检测试剂盒；
所述荧光检测试剂盒包括：10×Buffer 2μL，RNase Inhibitors(40U/μL)0.3-1.0μL，DTT 0.3-1.0μL，Cas12a(1μM)2-5μL，Lm crRNA或Lb crRNA(1μM)2-4μL，FQ reporter(1μM)或FB reporter(5μM)1-4μL，Lm或Lb扩增产物1-3μL；H2O(RNAase free Up to 20μL；
所述Cas12a切割识别位点为TTTN；
所述Lm crRNA为表1(12种)中任一种或几种；
所述Lb crRNA为表4(12中)中任一种或几种；
所述FQ reporter为荧光基团-TTTATTT-淬灭荧光基团的物质；所述荧光基团为FAM、FITC、其它与检测器激发波长和发射波长匹配的荧光基团；所述淬灭荧光基团的物质为BHQ1、BHQ2、其它可淬灭荧光基团的物质；
所述FB reporter为抗原分子-TTTATTT-Biotin，所述荧光基团为FAM、FITC，罗丹明、地高辛等与试纸条抗体匹配的抗原分子；
所述Lm或Lb扩增产物获得方法为：
(1)提取待测样品核酸
待测样品包括待测病原菌或油菜籽或油菜植物残基；
(2)核酸扩增
分别采用Lm或Lb特异性引物，加入重组酶聚合酶(RPA)等温扩增体系，获得Lm或Lb特异性扩增产物；
所述Lm特异性引物的核苷酸序列为：
Lm-正向：TGCCCATCGATGTCAAGTTCGTTGAGTAC；
Lm-反向：CCATGGCGGC ATCCGCATAT CCAGAGGGCAGC；
所述Lb特异性引物的核苷酸序列为：
Lb-正向:CCAACACAGGCTTAAGAAATCCGCCCCAGA；
Lb-反向:CCGTGCCTTGACTCTGCTGCCCGTGCCAAG；
所述油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒的使用方法为：
试剂盒各组分添加后，在37℃反应20-40min，获得Cas12切割产物；所述Cas12切割产物通过荧光检测方法或胶体金试纸条检测方法鉴定Lm或Lb；
所述荧光检测方法：利用荧光仪、蓝光切胶仪，荧光手电筒或胶体金试纸条检测Cas12切割产物；所述荧光仪检测波长设置为485nm；
所述胶体金试纸条检测方法：把Cas12切割产物与PBST缓冲液(PBS和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合，二者体积比为1:4，将试纸条浸入混合物中，观察控制线和检测线，控制线出现条带后取出试纸条，在5分钟内进行肉眼观察并判定结果，如果待测样品出现与阳性对照样品一样位置的明显检测线条带，说明样品含有目标菌，否则样品不含有目标菌。
实施例2：油菜茎基溃疡病菌纯菌检测
实施例2和3中：等温扩增试剂盒既可采用TwistAmp公司的
Figure BDA0002998162120000081
Basickit，也可采用中国其它公司生产的RPA或RAA核酸扩增试剂盒；crRNA体外转录试剂T7Transcript Kit,
Figure BDA0002998162120000082
Lba Cas12a(Cpf1)核酸酶，购自NEB公司，RNA纯化磁珠购自Beckman；磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒购自北京天根；快速提取试剂为基于NaOH的试剂；引物核酸，FQ reporter和FB reporter探针合成由上海生工合成；
本实施例使用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒或快速核酸释放剂获得预处理的核酸。
2.1核酸制备
采用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒，提取真菌菌丝核酸。
2.2核酸扩增
利用RPA扩增引物Lm-F和Lm-R，参考RPA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。Lm-F核苷酸序列：TGCCCATCGATGTCAAGTTCGTTGAGTAC(SEQ ID NO：25)；Lm-R核苷酸序列：CCATGGCGGC ATCCGCATAT CCAGAGGGCA GC(SEQ ID NO：26)；
在灵敏度检测案例中，把Lm基因组DNA核酸1.2ng，进行10倍梯度稀释；
采用
Figure BDA0002998162120000091
Basic kit核酸扩增方法：
把29.5μL再水化溶液，8.65μL RNase free水，2.4μL正向引物和2.4μL反向引物混合后，加入干粉中，溶解后加入2.5μL醋酸镁，分别取10μL反应液于4个0.2μL PCR管中，加入1μL待测核酸样品，于38℃反应30min，获得扩增产物。
2.3油菜茎基溃疡病菌特异性crRNA的设计制备
针对Lm特异性基因，寻找包含Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计20bp长度的crRNA，分别命名为Lm crRNA1到Lm crRNA12；设计完成后，交于上海生工合成oligo获得目的crRNA。也可以通过体外转录得到crRNA。
本发明提供的Lm crRNA，具体信息如表1所示：
表1 Lm特异性基因特异性crRNA genus-specific
crRNA name crRNA sequence
Lm crRNA1 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCCACCAUCUGGUCGCCGGU(SEQ ID NO：1)
Lm crRNA2 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUGCGGCUUCCUGGCAUGAG(SEQ ID NO：2)
Lm crRNA3 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAAUUUAGCCACCAUCUGGUC(SEQ ID NO：3)
Lm crRNA4 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAAUGGCCAUACUGGCGCG(SEQ ID NO：4)
Lm crRNA5 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAAUUUAGCCACCAUCUGGU(SEQ ID NO：5)
Lm crRNA6 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAUCGCACGCUUGAGAGCCUU(SEQ ID NO：6)
Lm crRNA7 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAUAUGGCCUCCGUAUGCAUG(SEQ ID NO：7)
Lm crRNA8 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAAGACACCUAUGAUCCA(SEQ ID NO：8)
Lm crRNA9 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAAUUUAGCCACCAUCUGGU(SEQ ID NO：9)
Lm crRNA10 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUCAUGCAUACGGAGGCCA(SEQ ID NO：10)
Lm crRNA11 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUACACGAAUCCCGCCUUUUC(SEQ ID NO：11)
Lm crRNA12 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAAGUGCGGCUGUGUUGAGA(SEQ ID NO：12)
2.4荧光检测
2.4.1反应体系
本检测采用20μL体系，如表2所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表2 Lm荧光检测反应体系
成分 用量/样品
10×Buffer* 2μL
RNase Inhibitors(40U/μL) 0.5μL
DTT(0.1M) 0.5μL
Cas12a(1μM) 2μL
FQ reporter(1μM) 2.5μL
扩增子 1μL具体体积
Lm crRNA(1μM) 2-4μL
H2O(RNAase free) Up to 20μL
所述Buffer：50mM NaCl,10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/ml；所述Cas12a：
Figure BDA0002998162120000101
Lba Cas12a(Cpf1)核酸酶(购自于NEB公司)；所述FQ reporter：FAM-TTTATTT-BHQ1(由上海生工合成)；所述扩增子为步骤2.2所得扩增产物；所述Lm crRNA(1μM)为表1中任一种。
2.4.2便携式荧光仪检测
将上述组分混合均匀后加入荧光PCR管或黑色384孔板中，置于37℃反应30min。监测激发波长为485nm的通道，每10s采集一次数据，持续检测30min。其检测图如图所示。如果荧光强度高于500，判断样品为Lm阳性。结果表明，当Lm基因组浓度为0.216pg(～5拷贝)时，30分钟后有明显的荧光信号，说明该发明可实现对Lm的高灵敏度检测(见图1)。
2.4.3蓝光切胶仪检测
将1.4.1反应组分混合均匀后置于0.2mL PCR管中，置于37℃反应30min。37℃可由便携式金属浴，保温桶等实现。反应30min后，置于蓝光切胶仪上进行观察(见图2)。
2.4.4便携式荧光手电筒检测
放入黑色暗盒中，黑色暗盒顶部放置蓝光手电筒，正面开一个小窗，便于观察PCR管的荧光情况(见图3)。
2.5试纸条检测
1.5.1反应体系
本检测采用20μL体系，如表3所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表3 Lm试纸条检测反应体系
成分 用量/样品
10×Buffer<sup>*</sup> 2μL
RNase Inhibitors(40U/μL) 0.5μL
DTT(0.1M) 0.5μL
Cas12a(1μM) 2μL
Lm crRNA(1μM) 2.4μL
FB reporter(5μM) 2μL
扩增子 1μL
H<sub>2</sub>O(RNAase free) Up to 20μL
所述Buffer：50mM NaCl,10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/ml；
所述Cas12a：
Figure BDA0002998162120000111
Lba Cas12a(Cpf1)核酸酶(购自于NEB公司)；
FB reporter：FAM-TTTATTT-Biotin(由上海生工合成)；
所述Lm crRNA(1μM)为表1中任一种。
1.5.2试纸条检测
把20μLCas12切割产物与80μL PBST缓冲液(PBS和0.05％Tween-20,pH7.0)混合，将试纸条浸入混合物中，观察控制线，控制线出现后取出试纸条，并在5分钟内进行肉眼观察判定结果，如果样品的检测限条带明显深于阴性对照的检测限条带，则判定样品为Lm阳性，并进行拍照记录。
本案例中，应用Cas12a胶体金试纸条检测Lm，可实现真菌基因组的灵敏检测。
实施案例3：油菜黑胫病原菌L.bioglobosa的快速检测(Lb)
本实施病例，示范应用本发明的Cas12a对油菜黑胫病原菌L.bioglobosa的快速检测。
3.1核酸制备
采用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒，提取油菜黑胫病原菌菌丝的核酸。
3.2核酸扩增
利用RPA扩增引物Lb-F和Lb-R，参考RPA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。
所述Lb特异性引物核苷酸序列为：
Lb-F:CCAACACAGGCTTAAGAAATCCGCCCCAGA(SEQ ID NO：27)；
Lb-R:CCGTGCCTTGACTCTGCTGCCCGTGCCAAG(SEQ ID NO：28)；
在灵敏度检测案例中，把Lb基因组DNA核酸1.5ng，进行10倍梯度稀释。
采用
Figure BDA0002998162120000121
Basic kit进行核酸扩增的方法为：
把29.5μL再水化溶液，8.65μL RNase free水，2.4μL正向引物和2.4μL反向引物混合后，加入干粉中，溶解后加入2.5μL醋酸镁，分别取10μL反应液于4个0.2μL PCR管中，加入1μL待测核酸样品，于38℃反应30min，获得扩增产物。
采用RAA核酸扩增试剂盒进行核酸扩增的方法为：
把25μL再水化溶液，13.15μL RNase free水，2.4μL正向引物和2.4μL反向引物混合后，加入干粉中，溶解后加入2.5μL醋酸镁，分别取10μL反应液于4个0.2μL PCR管中，加入1μL待测核酸样品，于38℃反应30min，获得扩增产物。
3.3油菜黑胫病原菌特异性crRNA的设计制备
针对Lb特异性基因，寻找包含Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计20bp长度的crRNA，分别命名为Lb crRNA1到Lb crRNA12。设计完成后，交于上海生工合成oligo，与T7-3G启动序列互补成双链，通过体外转录获得目的crRNA。也可以通过体外转录得到crRNA。
本发明提供的Lb crRNA，具体信息如表4所示：
表4.Lb特异性基因特异性crRNA
crRNA name crRNA sequence
Lb crRNA1 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAGGGAGCUGAGGCUGUGGC(SEQ ID NO：13)
Lb crRNA2 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUGGGGCGGAUUUCUUAAGCC(SEQ ID NO：14)
Lb crRNA3 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCUUUCUUGUGCAGAUGCGC(SEQ ID NO：15)
Lb crRNA4 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCCUCGAGCUUUACGCCAU(SEQ ID NO：16)
Lb crRNA5 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUAUAUCGCCUACACGGAUCC(SEQ ID NO：17)
Lb crRNA6 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCCAAGCCCACAUCGUCUUCU(SEQ ID NO：18)
Lb crRNA7 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCCUCGAGCUUUACGCCAUC(SEQ ID NO：19)
Lb crRNA8 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUAAGCCUGUGUUGGAGCGG(SEQ ID NO：20)
Lb crRNA9 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGUUCGGCAAUGGGGCAAC(SEQ ID NO：21)
Lb crRNA10 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUGUGCAGAUGCGCUGCCAU(SEQ ID NO：22)
Lb crRNA11 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCCGCCGGAGAAGGCGUGCA(SEQ ID NO：23)
Lb crRNA12 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAAGCUCUGUAGUGCACGCC(SEQ ID NO：24)
3.4荧光检测
3.4.1反应体系
本检测采用20μL休系，如表5所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表5.Lb特异性基因荧光检测反应体系
成分 用量/样品
10×Buffer<sup>*</sup> 2μL
RNase Inhibitors(40U/μL) 0.5μL
DTT(0.1M) 0.5μL
Cas12a(1μM) 2μL
FQ reporter(1μM) 2.5μL
Lb crRNA(1μM) 3.0μL
扩增子 1μL
H<sub>2</sub>O(RNAase free) Up to 20μL
所述Buffer：50mM NaCl,10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/ml；
所述Cas12a：所述Cas12a：
Figure BDA0002998162120000131
Lba Cas12a(Cpf1)核酸酶(购自于NEB公司)
所述FQ reporter：FAM-TTTATTT-BHQ1(由上海生工合成)
所述扩增子为步骤3.2所得扩增产物；
所述Lb crRNA(1μM)为表4中任一种。
3.4.2实时荧光PCR仪检测
将上述组分混合均匀后加入荧光PCR管或板中，置于37℃反应30min。监测激发波长为485nm的通道，每17s采集一次数据，持续检测30min。其检测图如图所示。根据荧光强度判定，该发明可实现对Lb的高灵敏度检测(见图5)。
3.4.3蓝光切胶仪检测
将1.4.1反应组分混合均匀后置于0.2mL PCR管中，置于37℃反应30min。37℃可由便携式金属浴，保温桶等实现。反应30min后，置于蓝光切胶仪上进行观察(图6)。
3.4.4便携式荧光手电筒检测
放入黑色暗盒中，黑色暗盒顶部放置蓝光手电筒，正面开一个小窗，便于观察PCR管的荧光情况(图7)。
3.5试纸条检测
3.5.1反应体系
本检测采用20μL体系，如表6所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
表6 Lb试纸条检测反应体系
成分 用量/样品
10×Buffer 2μL
RNase Inhibitors(40U/μL) 0.5μL
DTT(0.1M) 0.5μL
Cas12a(1μM) 2μL
Lb crRNA(1μM) 2.5μL
FB reporter(5μM) 3.0μL
扩增子 1μL
H<sub>2</sub>O(RNAase free) Up to 20μL
所述Buffer：50mM NaCl,10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/ml；
所述Cas12a：
Figure BDA0002998162120000141
Lba Cas12a(Cpf1)核酸酶(购自于NEB公司)；
FB reporter：FAM-TTTATTT-Biotin(由上海生工合成)；
所述扩增子为步骤3.2所得扩增产物；
所述Lb crRNA(1μM)为表4中任一种。
3.5.2试纸条检测
把20μLCas12切割产物与80μL PBST缓冲液(PBS和0.05％Tween-20，pH7.0)混合，将试纸条浸入混合物中，观察控制线，控制线出现后取出试纸条，并在5分钟内进行肉眼观察判定结果，并进行拍照记录(图8)。
本案例中，应用Cas12a胶体金试纸条检测Lb，可实现真菌基因组的灵敏检测。
实施案例4：油菜黑腿病病原菌的特异性检测
本实施案例的样品为从具有油菜黑腿病症状的组织中分离培养，并经测序验证的真菌核酸。
本案例中的植物组织样品采用快速提取试剂，直接提取核酸，并做为模板。当目标菌是油菜茎基溃疡病菌时，实施步骤同实施案例1；当目标菌是油菜黑腿病菌时，实施步骤同实施案例2。
本实施案例中，将Cas12a切割产物进行实时荧光检测。检测结果如图9、10、11、12所示。
实施案例5：
针对测试样品中Lm和Lb检测，设置了实施例1与现有技术的对比试验，试验结果表明，实施例1的测定方法可以完全区分开Lm和Lb，灵敏度高、特异性强，可以实现对油菜黑腿病病原菌的快速检测和鉴定诊断。
表7实施例1与现有技术的对比试验结果
Figure BDA0002998162120000151
实施例1-5的参考文献：
1.Fitt BDL,Hu BC,Li ZQ,Liu SY,Lange RM,Kharbanda PD,Butterworth MH,White RP:Strategies to prevent spread of Leptosphaeria maculans(phoma stemcanker)onto oilseed rape crops in China；costs and benefits.Plant Pathol 2008,57(4):652-664.
2.王振华,杨武,赵晖,曾宪东,李凤新,蔡翔,王瀚昌,余浩:加拿大进境油菜籽茎基溃疡病菌的检测与鉴定.华中农业大学学报2011,30(1):66-69.
3.Zhou G,Shang L,Yu C,Yin L,Xu D,Yi J:Detection of Leptosphaeriamaculans and L.biglobosa in oilseed rape samples imported from Australia.ActaPhytophylacica Sinica 2010,37(4):289-294.
4.Zhou G,Shang L,Lin H,Yin L,Xu D,Yi J:Detection ofLeptosphaeriamaculans by real-time PCR.Acta Phytopathologica Sinica 2011,41(1):10-17.
5.周圆,黄海龙,李孝军,单长林,李雪松,陈宇,邵炜冬,朱鹏:油菜茎基溃疡病菌LAMP-LFD检测方法的建立.植物检疫2016,30(4):32-37.
6.Lei R,Kong J,Qiu YH,Chen NZ,Zhu SF,Wang XY,Wu PS:Rapid detection ofthe pathogenic fungi causing blackleg of Brassica napus using a portablereal-time fluorescence detector.Food Chem 2019,288:57-67.
本发明的原理：
本检测体系包括：针对Lm的特异性基因LCB的crRNA,Cas12a(Cpf1)蛋白，RNase抑制剂和单链DNA(ssDNA)报告系统；
所述特异性DNA为Lm LCB crRNA1到crRNA12中的任意一种或多种。
所述单链DNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测或实时荧光PCR仪或便携式荧光仪的荧光报告分子FQ reporter或用于侧向流试纸检测的FB reporter。其中FQ reporter为荧光基团和荧光猝灭剂标记的ssDNA，如5'-6-FAM/TTTATTT/BHQ-1-3'；所述FB reporter为5'-6-FAM/TTTATTT/Biotin-3'。
所述侧向流试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和PCV背衬；PVC背衬上依次有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有金纳米标记的FITC抗体；所述的硝酸纤维素膜上有链霉亲和素包被的质控线和IgG抗体构成的检测线。
所述特异性crRNA的筛选及制备方法包括：针对Lm和Lb特异性基因，寻找包含Cas12a识别序列TTTN的靶向序列，设计长度20-23bp的模板DNA，并进行化学合成或体外转录获得目的crRNA。
所述油菜黑腿病病原菌核酸快速检测方法包括以下步骤：
步骤a：利用核酸快速释放试剂释放油菜及植物病原菌核酸；
步骤b：利用等温扩增引物扩增特测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用Lm或Lb特异性引物，加入RPA等温扩增体系，在38℃反应20min，获得特异性产物；
步骤c：利用CRISPR/Cas12a检测体系切割核酸：将步骤b中产物和相应的ssDNA报告基团加入CRISPR/Cas12a检测体系，于37℃反应20-40min；
步骤d：利用荧光检测仪器或胶体金试纸条检测信号。
本发明提供的用于油菜黑腿病病原菌快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒既可利用便携式荧光仪或荧光手电筒检测，也可以利用胶体金试纸条检测。当用荧光仪或荧光手电筒检测时，CRISPR/Cas12a检测体中ssDNA报告系统为FQ reporter，使用胶体金试纸条检测时，ssDNA报告系统为FB reporter。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 1
uaauuucuac ucuuguagau gccaccaucu ggucgccggu 40
<210> 2
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 2
uaauuucuac ucuuguagau uugcggcuuc cuggcaugag 40
<210> 3
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 3
uaauuucuac ucuuguagau aauuuagcca ccaucugguc 40
<210> 4
<211> 39
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 4
uaauuucuac ucuuguagau gaauggccau acuggcgcg 39
<210> 5
<211> 39
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 5
uaauuucuac ucuuguagau aauuuagcca ccaucuggu 39
<210> 6
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 6
uaauuucuac ucuuguagau aucgcacgcu ugagagccuu 40
<210> 7
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 7
uaauuucuac ucuuguagau auauggccuc cguaugcaug 40
<210> 8
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 8
uaauuucuac ucuuguagau gagaagacac cuaugaucca 40
<210> 9
<211> 39
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 9
uaauuucuac ucuuguagau aauuuagcca ccaucuggu 39
<210> 10
<211> 39
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 10
uaauuucuac ucuuguagau uucaugcaua cggaggcca 39
<210> 11
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 11
uaauuucuac ucuuguagau uacacgaauc ccgccuuuuc 40
<210> 12
<211> 39
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 12
uaauuucuac ucuuguagau aagugcggcu guguugaga 39
<210> 13
<211> 39
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 13
uaauuucuac ucuuguagau agggagcuga ggcuguggc 39
<210> 14
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 14
uaauuucuac ucuuguagau uggggcggau uucuuaagcc 40
<210> 15
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 15
uaauuucuac ucuuguagau gcuuucuugu gcagaugcgc 40
<210> 16
<211> 39
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 16
uaauuucuac ucuuguagau gccucgagcu uuacgccau 39
<210> 17
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 17
uaauuucuac ucuuguagau uauaucgccu acacggaucc 40
<210> 18
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 18
uaauuucuac ucuuguagau ccaagcccac aucgucuucu 40
<210> 19
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 19
uaauuucuac ucuuguagau gccucgagcu uuacgccauc 40
<210> 20
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 20
uaauuucuac ucuuguagau uuaagccugu guuggagcgg 40
<210> 21
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 21
uaauuucuac ucuuguagau gaguucggca auggggcaac 40
<210> 22
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 22
uaauuucuac ucuuguagau uugugcagau gcgcugccau 40
<210> 23
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 23
uaauuucuac ucuuguagau uccgccggag aaggcgugca 40
<210> 24
<211> 40
<212> RNA
<213> genus-specific(特异性基因)
<400> 24
uaauuucuac ucuuguagau gaagcucugu agugcacgcc 40
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> primer(引物)
<400> 25
tgcccatcga tgtcaagttc gttgagtac 29
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> primer(引物)
<400> 26
ccatggcggc atccgcatat ccagagggca gc 32
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> primer(引物)
<400> 27
ccaacacagg cttaagaaat ccgccccaga 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> primer(引物)
<400> 28
ccgtgccttg actctgctgc ccgtgccaag 30

Claims (5)

1.一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒，其特征是：所述试剂盒包括：10×Buffer2μL，40U/μL 的RNase Inhibitors 0.3-1.0μL，DTT 0.3-1.0μL，1μM 的Cas12a 2-5μL，1μM的Lm crRNA或Lb crRNA 2-4μL，1μM 的FQ reporter或5μM 的FB reporter 1-4μL，Lm或Lb扩增产物1-3μL；RNAase free 的H2O补足至20μL；
所述Cas12a切割识别位点为TTTN；
所述Lm crRNA为以下中任一种或几种；
SEQ ID NO：1所示的Lm crRNA1，SEQ ID NO：2所示的Lm crRNA2，SEQ ID NO：3所示的LmcrRNA3，SEQ ID NO：4所示的Lm crRNA4，SEQ ID NO：5所示的Lm crRNA5，SEQ ID NO：6所示的Lm crRNA6，SEQ ID NO：7所示的Lm crRNA7，SEQ ID NO：8所示的Lm crRNA8，SEQ ID NO：9所示的Lm crRNA9，SEQ ID NO：10所示的Lm crRNA10，SEQ ID NO：11所示的Lm crRNA11，SEQID NO：12所示的Lm crRNA12；
所述Lb crRNA为以下中任一种或几种；
SEQ ID NO：13所示的Lb crRNA1，SEQ ID NO：14所示的Lb crRNA2，SEQ ID NO：15所示的Lb crRNA3，SEQ ID NO：16所示的Lb crRNA4，SEQ ID NO：17所示的Lb crRNA5，SEQ IDNO：18所示的Lb crRNA6，SEQ ID NO：19所示的Lb crRNA7，SEQ ID NO：20所示的Lb crRNA8，SEQ ID NO：21所示的Lb crRNA9，SEQ ID NO：22所示的Lb crRNA10，SEQ ID NO：23所示的LbcrRNA11，SEQ ID NO：24所示的Lb crRNA12；
所述FQ reporter为荧光基团-TTTATTT-淬灭荧光基团的物质；所述FB reporter为荧光基团-TTTATTT-Biotin；
所述Lm或Lb扩增产物获得方法为：
(1)提取待测样品核酸
待测样品包括待测病原菌或油菜籽或油菜植物残基；
(2)核酸扩增
采用Lm或Lb特异性引物，加入重组酶聚合酶等温扩增体系，获得Lm或Lb特异性扩增产物；
所述Lm特异性引物的核苷酸序列为：Lm-正向：SEQ ID NO：25和Lm-反向：SEQ ID NO：26；
所述Lb特异性引物的核苷酸序列为：Lb-正向：SEQ ID NO：27和Lb-反向：SEQ ID NO：28。
2.根据权利要求1所述的一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒，其特征是：所述FQreporter荧光基团为FAM或FITC；所述淬灭荧光基团的物质为BHQ1或BHQ2。
3.根据权利要求1所述的一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒，其特征是：所述FBreporter荧光基团为与试纸条抗体匹配的抗原分子FAM、FITC、罗丹明、地高辛任一种。
4.根据权利要求1所述的一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒，其特征是：所述油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒组成为：10×Buffer 2μL，40U/μL 的RNase Inhibitors0.5μL，DTT 0.5μL，1μM 的Cas12a 2μL，1μM 的Lm crRNA或Lb crRNA 2-4μL，1μM 的FQreporter或5μM 的FB reporter 2-2.5μL，Lm或Lb扩增产物1-3μL；RNAase free 的H2O补足至20μL。
5.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征是：所述试剂盒用于检测油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans或油菜黑茎病菌Leptosphaeria biglobosa；
所述试剂盒的各组分添加后，于37℃反应20-40min，获得切割产物；所述切割产物通过荧光检测方法或胶体金试纸条检测方法鉴定油菜茎基溃疡病菌或油菜黑茎病菌；
所述荧光检测方法：利用荧光仪、蓝光切胶仪，荧光手电筒检测切割产物；所述荧光仪激发波长设置为450-488nm，发射波长为510-530nm；荧光手电筒为蓝光手电筒或254nm紫外光手电筒；
所述胶体金试纸条检测方法：把切割产物与PBST缓冲液混合，二者体积比为1:(4-10)，将试纸条浸入混合物中，观察控制线和检测线，控制线出现条带后取出试纸条，在5分钟内进行肉眼观察并判定结果，如果待测样品出现与阳性对照样品一样位置的明显检测线条带，说明样品含有目标菌，否则样品不含有目标菌。
CN202110343962.7A 2021-03-30 2021-03-30 一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法 Active CN113122648B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110343962.7A CN113122648B (zh) 2021-03-30 2021-03-30 一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110343962.7A CN113122648B (zh) 2021-03-30 2021-03-30 一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113122648A CN113122648A (zh) 2021-07-16
CN113122648B true CN113122648B (zh) 2022-11-22

Family

ID=76775036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110343962.7A Active CN113122648B (zh) 2021-03-30 2021-03-30 一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113122648B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114075564B (zh) * 2022-01-17 2022-04-22 广东华美众源生物科技有限公司 马拉色菌的检测组合物、试剂盒及其检测方法
CN114774410A (zh) * 2022-05-16 2022-07-22 西北农林科技大学 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物和试剂盒及检测方法
CN117512165B (zh) * 2023-10-27 2024-05-28 中国检验检疫科学研究院 一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111187856B (zh) * 2020-02-13 2020-11-13 上海科技大学 一种用于新冠病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其制备方法与应用
CN111778357B (zh) * 2020-07-13 2023-01-06 国家卫生健康委科学技术研究所 基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113122648A (zh) 2021-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113122648B (zh) 一种油菜黑腿病致病菌的快速检测试剂盒及其使用方法
CN110551846B (zh) 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
CN107164479B (zh) 用于检测和鉴定人组织包虫病病原的引物对组合及试剂盒
CN111979303A (zh) 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用
CN105256048B (zh) 口腔致病菌多重pcr检测引物组和探针组及其应用
CN109913565B (zh) 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法
CN114807311A (zh) 基于CRISPR-Cas12a检测松树脂溃疡病原菌的方法及应用
CN114196766B (zh) 用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法
CN107828906B (zh) 一种检测玉蜀黍黑粉菌的方法及专用试剂盒
CN117089631B (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测红火蚁的序列组合及其应用
CN108315469B (zh) 环介导等温扩增法检测致病镰刀菌的引物组合物和试剂盒及其用途
CN116574841B (zh) 一种非特异CrRNA的CRISPR/Cas12a切割体系的多重病原菌的检测方法
CN113444777A (zh) 一种用于碳青霉烯酶检测的CrRNA、CRISPR-Cas12a系统及应用
CN111088395B (zh) 小麦全蚀病菌禾顶囊壳lamp检测引物组及方法
CN112852995A (zh) 一种检测禾谷镰孢菌的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN116516058A (zh) 可视化检测大豆疫霉菌的方法及试剂盒
CN108950043B (zh) 一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒
CN115820889A (zh) 一种用于幽门螺旋杆菌检测的crRNA、CRISPR Cas12a系统及其应用
CN117512165B (zh) 一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法
CN109988860B (zh) 一种用于检测冬生疫霉的引物及探针组合物及其试剂盒和检测方法
CN115181803A (zh) 检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用
CN106676193B (zh) 一种青霉菌鉴别用分子标记及引物和探针
JP7176682B2 (ja) 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法
CN111733271A (zh) 检测炭疽病菌对qoi类杀菌剂抗药性的组合物及其应用
CN110699482A (zh) 一种橡树疫霉的特异性检测靶标Pr40993及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant