CN108950043B - 一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒 - Google Patents

一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒，其特征在于，所述检测体系包括用于扩增检测14种藻类的11个基因位点的引物以及扩增检测2种气单胞菌的3个基因位点的引物。本发明具有特异性好，灵敏度高的优点，可以较快速的鉴定样本中藻类，并且由于复扩系统中包含检测气单胞菌的引物，可以同时鉴定样本中是否存在气单胞菌；并有助于对水中尸体进行溺死诊断，而且可以根据鉴定出的藻类样本推测溺死地点。

Description

一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒
技术领域
本发明属于微生物分子生物学领域，具体涉及一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒。
背景技术
水中发现的尸体死亡原因可能有多种，如属于意外溺水死亡,也可能是自杀、他杀、死后抛尸入水伪造意外溺水死亡的刑事案件。因此，确定水中尸体是否是溺死是解决上述问题的关键。目前，国内外对判断水中尸体是否为溺死的方法一般根据尸表检查、尸体解剖以及相关实验室检查、藻类检验等综合分析结果的基础上做出的判定。
有报道称使用针对在水域中存在且分布广泛甲藻、绿藻、蓝藻、硅藻等藻类基因的特异性引物来进行溺死诊断的研究，同时也有研究使用针对不同藻类基因的特异性引物来检测溺死尸体脏器中的藻类来诊断溺死。本发明同时应用毛细管电泳检测溺死相关藻类多个位点基因，由于毛细管电泳法应用广泛、操作简单,在溺死鉴定中易普及推广，希望为溺死诊断提供一种新方法。
一些案例中尸体己经有不同程度的腐败或是已经白骨化时，溺死的尸体征象已经不复存在，此时藻类检验是溺死诊断不可或缺的手段，可以为判定溺死提供有力信息。近年来利用分子生物学技术来检验浮游生物研究溺死成为热点，己经研究证实溺死尸体脏器中存在的几种溺死相关藻类，如蓝藻、绿藻、甲藻、硅藻等藻类，这些藻类可同时随溺液进入溺死者体液循环中。
一对引物的PCR扩増体系与多重PCR技术相比，由于水中尸体腐败导致检测的鞭基因降解而使模板量减少可能导致PCR扩増失败引起假阴性结果，而多重PCR技术增加了检测对象的种类或(和)靶基因的数量，可能对于提高溺死诊断的可靠性是一种有效的方法。
PCR扩増后的产物除实时定量PCR技术扩増后无需对产物进行电泳检测，其它PCR技术扩増产物均需电泳检测，常用有琼脂糖-EB电泳、PAGE电泳等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒，采用荧光引物复扩和毛细管电泳方法结合，能够同时快速检测14种水藻及2种嗜水气单胞菌共14个基因，具有特异性好，灵敏度好的优点，可以较快速的鉴定样本中藻类，并且由于复扩系统中包含检测气单胞菌的引物，可以同时鉴定样本中是否存在气单胞菌；并有助于对水中尸体进行溺死诊断，而且可以根据鉴定出的藻类样本推测溺死地点。
本发明采用的技术方案是：
一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，所述体系中包括用于扩增检测14种藻类的11个基因位点的引物：硅藻叶绿体rbcl-1（ND-1）、塔玛亚历山大藻COⅠ（JIA COX）、蓝藻核糖体16S（359）、硅藻叶绿体rbcl-2（ND-2）、鱼腥藻属mcyD（mcyD）、菱形藻属核糖体18S（Dia）、筒孢藻属念珠藻科CENA33(CBR)、片状微囊藻16S (WN)、硅藻核糖体23S(UPA-99)、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ(Cox120)、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA(Psba)；以及扩增检测2种气单胞菌的3个基因位点的引物：嗜水气单胞菌AER(JUN AER)、维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD（proD-WS）、维氏气单胞菌Hly(HLYA)，其中括号内的内容表示引物对应的基因座。
所述的引物对中的引物碱基序列及浓度如表1所示：
Figure 144981DEST_PATH_IMAGE001
优选的，所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，所述 14 个基因位点的引物分组进行荧光染料标记，第一组：rbcl-1、COⅠ、AER、蓝藻核糖体16S、rbcl-2；第二组mcyD、18S、CENA33、片状微囊藻16S；第三组：23S、COXⅠ；第四组：proD、psbA、Hly。
优选的，所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，每组引物采用蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料 TAMRA、红色荧光染料ROX中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。
优选的，所述每对引物中至少有一个引物的 5’端进行荧光染料标记。
本发明还提供了一种用于检测溺死相关浮游生物的试剂盒，除了包括上述一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系外，本试剂盒还包含以下成份，如下表2：
Figure 436285DEST_PATH_IMAGE002
优选的，所述的试剂盒，还包括反应混合物、热启动Taq酶和sdH2O；所述的反应混合物中包括有：MgCl2 7.5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM，BSA 2mg/mL。
优选的，所述试剂盒的扩增体系为：反应混合物10.0μL，DNA 模板 0.1～10μL，引物混合物5μL，热启动Taq酶0.5μL，sdH2O补足至25.0μL。
优选的，本发明试剂盒扩增程序如下表3：
Figure 638072DEST_PATH_IMAGE003
本发明试剂盒的扩增产物采用毛细管电泳方法检测。具体检测步骤是：由去离子甲酰胺与系统中分子量内标 AGCU Marker SIZ-500( 制备方法见专利CN101307226) 组成上样混合物〔（0.5μl AGCU Marker SIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样数）＋（12μl 去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将 12.5μl 上样混合物与 1μl 扩增产物或系统中等位基因分析标准物 Allelic Ladder（无锡中德美联生物技术有限公司）混合，避免产生气泡。 95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
对上述的分型结果进行分析的步骤是：用片段分析软件 GeneMapper 分析遗传分析仪检测收集的数据。
优选的，所述的试剂盒在检测藻类及气单胞菌中的应用。
优选的，所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系在检测藻类及气单胞菌中的应用。
有益效果
1、本发明提供的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，可以同时检测硅藻叶绿体rbcl、塔玛亚历山大藻（COⅠ）、嗜水气单胞菌（AER）、蓝藻核糖体16S、鱼腥藻属mcyD、菱形藻属核糖体18S、筒孢藻属念珠藻科CENA33、片状微囊藻16S、硅藻核糖体23S、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ、维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因（proD）、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA、维氏气单胞菌Hly等基因。
2、本发明具有特异性好，灵敏度好的优点，可以较快速的鉴定样本中藻类，并且由于复扩系统中包含检测气单胞菌的引物，可以同时鉴定样本中是否存在气单胞菌。
3、在水中尸体脏器中发现上述藻类与细菌等生物对溺死诊断均具有一定的参考意义。溺死的判定有望随相关研究的深入，会有越来越多可随溺液进人血液循环多种对象被检测确定，可使溺死诊断结果更加可靠。本发明不但有助于对水中尸体进行溺死诊断，而且可以根据鉴定出的藻类样本推测溺死地点。目前,相关的研究报道较少，本研究发明在应用于溺死诊断中具有良好的前景。
4、本发明将毛细管电泳技术应用到溺死诊断中检测PCR产物,即通过检测不同颜色的荧光的存在来反应检测的产物，这种方法上样量少，无需制胶、显带等过程，可更加灵敏与迅速完成电泳过程。
附图说明
图 1为本发明基因座排布。
图 2 为普通小球藻提取DNA扩增结果图，检测到ND-1基因。
图 3 为桥弯藻提取DNA扩增结果图，检测到ND-1、359、UPA-99基因。
图 4为蛋白核小球藻提取DNA扩增结果图，检测到ND-1、CBR基因。
图 5 为舟形藻提取DNA扩增结果图，检测到ND-1、359、ND-2、Dia基因。
图 6 为异极藻提取DNA扩增结果图，检测到359、UPA-99基因。
图 7 为小环藻提取DNA扩增结果图，检测到359、ND-2、CBR、UPA-99基因。
图 8 为产毒铜绿微囊藻提取DNA扩增结果图，检测到ND-1、mcyD、WN基因。
图 9 为脆杆藻提取DNA扩增结果图，检测到ND-1、359、ND-2、UPA-99、Cox120基因。
图 10 为念珠藻提取DNA扩增结果图，检测到CBR基因。
图 11 针杆球藻提取DNA扩增结果图，检测到359、CBR、UPA-99基因。
图 12 为血红哈卡甲藻提取DNA扩增结果图，检测到JIA COX基因。
图 13 为伊姆裸甲藻提取DNA扩增结果图，检测到JIA COX、Psba基因。
图 14 为锥状斯克里普藻甲藻提取DNA扩增结果图，检测到JIA COX、CBR基因。
图 15 为链状亚历山大甲藻提取DNA扩增结果图，检测到CBR、Psba基因。
图 16 为杀鲑气单胞菌提取DNA扩增结果图，检测到JUN AER、HLYA基因。
图 17 为维氏气单胞菌提取DNA扩增结果图，检测到proD-WS基因。
图 18 为混合样本1提取DNA扩增结果图，检测到ND-1、359、mcyD、WN、UPA-99、proD-WS基因。
图 19 为混合样本2提取DNA扩增结果图，检测到ND-1、JIA COX、JUN AER、359、ND-2、UPA99、Cox120、Psba、HLYA基因。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 ( 例如参考 J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社 ) 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 检测基因座的确定；试剂盒引物组、扩增体系、扩增方法的确定
一、基因座的确定
从 NCBI genebank 中下载引物设计模板序列，每个基因座序列在 genebank 中比对，选择特异性较好经blast 比对唯一的引物，经大量反复测试在复扩体系中各物种DNA 模版扩增出唯一扩增峰，设计引物时，需要在引物设计软件中反复调试，确保所有引物具有适中的长度、具有相似的物理学特性和反应动力学特点、Tm 值相近、GC 含量适中、并保证引物之间不形成二聚体。此外，某些转基因位点之间同源性较高，因此需要保证每对引物的特异性；同时应考虑在复合扩增体系中，引物对不同扩增模板的适用性，保证不同模板扩增时，都满足试剂盒均衡性要求。如表4：
表4、各基因座信息
基因座名称 检测基因 NCBI Genebank 号
ND-1 rbcl KX981822.1
JIACOX COⅠ GQ501176.1
JUN AER AER M16495.1
359 蓝藻核糖体16S KC896631.1
ND-2 rbcl KX981822.1
mcyD mcyD EF565275.1
Dia 18S KX981850.1
CBR CENA33 MF423478.1
WN 片状微囊藻16S AB666076.1
UPA-99 23S KY921197.1
Cox120 COXⅠ AB020227.1
proD-WS proD HQ442835.1
Psba psbA AB359453.1
HLYA Hly KU845731.1
二、荧光标记STR 复合扩增体系的优化及建立
经过大量实验和修改优化后，最终确定同时分析基因组DNA 14个基因座的荧光标记复合扩增的试剂盒，其中PCR扩增体系由如下组成：
表5、扩增体系组成
组分 体积
Reaction Mix （反应混合物） 10.0μL
基因组 DNA 0.1 ～ 10.0μL 含量为 0.5pg ～ 0.5ng
引物混合物 5.0μL
启动 Taq 酶 (5U/μL) 0.5μL
sdH<sub>2</sub>O 补足至 25.0μL
其中所述的Reaction Mix（反应混合物）中各组分反应终浓度为125mM Tris-HCl、125mM KCl、7.5mM MgCl2、7.5mM dNTPs、2mg/mL BSA。
引物混合物见表1。引物由上海生工合成，共分为四组：第一组用于扩增硅藻叶绿体rbcl、塔玛亚历山大藻（COⅠ）、嗜水气单胞菌（AER）、蓝藻核糖体16S；第二组鱼腥藻属mcyD、菱形藻属核糖体18S、筒孢藻属念珠藻科CENA33、片状微囊藻16S基因的引物对；第三组硅藻核糖体23S、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ、第四组维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因（proD）、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA、维氏气单胞菌Hly。每组引物依次采用蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料 HEX、黄色荧光染料 TAMRA 、红色荧光染料 ROX进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为 SIZ。
试剂盒的扩增步骤如下：
（1）将PCR扩增管置于热循环仪上；
（2）选择下面推荐的程序进行扩增；
（3）扩增后的产物应避光保存；
热循环仪的扩增程序：（1）初始变性：95℃，2min；（2）热循环：30个循环： 94℃30s，59℃ 1min，72℃ 1min；（3）终延伸：72℃ 10min；（4）保温：4℃维持。
电泳结束后，将PCR扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μL产物或试剂盒等位基因分型标准物与0.5μL荧光分子量内标AGCU Marker SIZ-500和12μL去离子甲酰胺混合，避免产生气泡，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，遗传分析仪电泳检测，用片段分析软件GeneMapper分析电泳数据。
附图1是本发明基因座排布，具体包括检测藻类的11 个基因位点：硅藻叶绿体rbcl-1（ND-1）、塔玛亚历山大藻COⅠ（JIA COX）、蓝藻核糖体16S（359）、硅藻叶绿体rbcl-2（ND-2）、鱼腥藻属mcyD（mcyD）、菱形藻属核糖体18S（Dia）、筒孢藻属念珠藻科CENA33(CBR)、片状微囊藻16S (WN)、硅藻核糖体23S(UPA-99)、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ(Cox120)、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA(Psba)；以及检测2种气单胞菌的3个基因位点：嗜水气单胞菌AER(JUN AER)、维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD（proD-WS）、维氏气单胞菌Hly(HLYA)，其中括号内的内容表示引物对应的基因座。
附图 2~17是电泳结果经美国 AB 公司 genemapper IDX 软件分析之后的 14 种藻类和2种菌扩增图谱。
附图 2~17 依次为普通小球藻、桥弯藻、蛋白核小球藻、舟形藻、异极藻、小环藻、产毒铜绿微囊藻、脆杆藻、念珠藻、针杆藻、血红哈卡甲藻、伊姆裸甲藻、锥状斯克里普甲藻、链状亚历山大甲藻、杀鲑气单胞菌、维氏气单胞菌。
附图 18~19是电泳结果经美国 AB 公司 genemapper IDX 软件分析之后的混合样本1和混合样本2提取DNA扩增结果图。
实施例2 溺死脏器样本检测
2 个溺死肺脏提取样本由某市局提供。2个样本 DNA 按实施例 1 最终确定的的引物组、扩增体系、扩增程序扩增，并且如实施例 1 的检测方法检测。软件分析峰高高于100rfu，认为相应的基因有扩增。反之，分析结果峰高低于 100rfu，认为无扩增，即不含相应的基因。
2 个样本经本方案检测均有扩增峰：样本1 检测到ND-1、359、mcyD、WN、UPA-99、proD-WS基因( 扩增检测图如附图 18)，结果表明样本1中含有异极藻、产毒铜绿微囊藻、维氏气单胞菌DNA；样本2 检测到ND-1、JIA COX、JUN AER、359、ND-2、UPA-99、Cox120、Psba、HLYA基因( 扩增检测图如附图 19)，结果表明样本2中含有脆杆藻、伊姆裸甲藻、杀鲑气单胞菌DNA。检测结果与PCR扩增测序后序列比对结果一致。
SEQUENCELISTING
<110>无锡中德美联生物技术有限公司
广州市刑事科学技术研究所
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<212>DNA
<213>人工合成（Artificialsequence）
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Claims (10)

1.一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，能够同时快速检测 14 种水藻及2种气单胞菌共 14 个基因，14 种水藻包括普通小球藻、桥弯藻、蛋白核小球藻、舟形藻、异极藻、小环藻、产毒铜绿微囊藻、脆杆藻、念珠藻、针杆藻、血红哈卡甲藻、伊姆裸甲藻、锥状斯克里普甲藻和链状亚历山大甲藻，2种气单胞菌包括杀鲑气单胞菌和维氏气单胞菌，包括用于扩增检测14种藻类的11 个基因位点的引物：硅藻叶绿体rbcl-1（ND-1）、塔玛亚历山大藻COⅠ（JIA COX）、蓝藻核糖体16S（359）、硅藻叶绿体rbcl-2（ND-2）、鱼腥藻属mcyD（mcyD）、菱形藻属核糖体18S（Dia）、筒孢藻属念珠藻科CENA33(CBR)、片状微囊藻16S (WN)、硅藻核糖体23S(UPA-99)、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ(Cox120)、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA(Psba)；以及扩增检测2种气单胞菌的3个基因位点的引物：嗜水气单胞菌AER(JUNAER)、维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD（proD-WS）、维氏气单胞菌Hly(HLYA)，其中括号内的内容表示引物对应的基因座；
所述 14 对引物核苷酸序列为：硅藻叶绿体rbcl-1基因的引物如SEQ ID NO.1~2所示，塔玛亚历山大藻COⅠ基因的引物如SEQ ID NO.3~4所示，嗜水气单胞菌AER基因的引物如SEQID NO.5~6所示，蓝藻核糖体16S基因的引物如SEQ ID NO.7~8所示，硅藻叶绿体rbcl-2基因的引物如SEQ ID NO.9~10所示，鱼腥藻属mcyD基因的引物如SEQ IDNO.11~12所示，菱形藻属核糖体18S基因的引物如SEQ ID NO.13~14所示，筒孢藻属念珠藻科CENA33基因的引物如SEQ ID NO.15~16所示，片状微囊藻16S基因的引物如SEQ ID NO.17~18所示，硅藻核糖体23S基因的引物如SEQ ID NO.19~20所示，中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ基因的引物如SEQ IDNO.21~22所示，维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD基因的引物如SEQ ID NO.23~24所示，塔玛亚历山大藻叶绿体psbA基因的引物如SEQ ID NO.25~26所示，维氏气单胞菌Hly基因的引物如SEQ ID NO.27~28所示。
2.根据权利要求 1 所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为：SEQ ID NO.1~2：0.2µM；SEQ ID NO.3~4 ：0.5µM； SEQ IDNO.5~6：2. 5µM；SEQ ID NO.7~8：0.2µM；SEQ ID NO.9~10：0. 5µM；SEQ ID NO.11~12：1.5µM；SEQ ID NO.13~14：0.2µM；SEQ ID NO.15~16：0.2µM；SEQ ID NO.17~18：0.1µM；SEQ IDNO.19~20：0.1µM；SEQ ID NO.21~22：1.5µM；SEQ ID NO.23~24 ：0.6µM；SEQ ID NO.25~26：1.2µM；SEQ ID NO.27~28：1.2µM。
3.根据权利要求 1 所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，所述 14 个基因位点的引物分组进行荧光染料标记，第一组：硅藻叶绿体rbcl-1、塔玛亚历山大藻COⅠ、嗜水气单胞菌AER、蓝藻核糖体16S、硅藻叶绿体rbcl-2；第二组：鱼腥藻属mcyD、菱形藻属核糖体18S、筒孢藻属念珠藻科CENA33、片状微囊藻16S；第三组：硅藻核糖体23S、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ；第四组：维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA、维氏气单胞菌Hly。
4.根据权利要求 3 所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，每组引物采用蓝色荧光染料 6-FAM、绿色荧光染料 HEX、黄色荧光染料 TAMRA 、红色荧光染料 ROX 中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为 SIZ。
5.根据权利要求 3 所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，所述每对引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
6.一种用于检测溺死相关浮游生物的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～5中任一项所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测溺死相关浮游生物的试剂盒，其特征在于，还包括反应混合物、热启动 Taq 酶和sdH2O ；所述的反应混合物中包括有：MgCl2 7.5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM，BSA 2mg/mL。
8.根据权利要求7 所述的一种用于检测溺死相关浮游生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增体系为：反应混合物10.0μL， DNA 模板 0.1～10μL，引物混合物 5μL，热启动 Taq 酶 0.5μL，sdH2O 补足至 25.0μL。
9.根据权利要求 7所述的一种用于检测溺死相关浮游生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：变性 95℃ 2min，循环 94℃ 30s，59℃ 1min，72℃ 1min 30 个循环，终止延伸 72℃ 10min，4℃保温维持。
10.权利要求 1~5中任一项所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系在检测藻类及气单胞菌中的应用，其特征在于，所述藻类包括普通小球藻、桥弯藻、蛋白核小球藻、舟形藻、异极藻、小环藻、产毒铜绿微囊藻、脆杆藻、念珠藻、针杆藻、血红哈卡甲藻、伊姆裸甲藻、锥状斯克里普甲藻和链状亚历山大甲藻，气单胞菌包括杀鲑气单胞菌和维氏气单胞菌。
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