CN112760390A - 用于检测替加环素耐药基因tet(X)及其变体的荧光定量PCR引物组合物及其应用 - Google Patents

用于检测替加环素耐药基因tet(X)及其变体的荧光定量PCR引物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测替加环素耐药基因tet(X)及其变体的荧光定量PCR引物组合物及其应用。本发明针对替加环素耐药基因tet(X)的5种变体tet(X)、tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)建立了相应荧光定量PCR方法，该检测方法适用于可培养菌和不可培养菌，并且PCR反应条件相同，从而保证了在同一PCR条件下可以对样品中这替加环素耐药基因tet(X)的5种变体进行同时检测，对于环境中抗生素替加环素耐药性的监测具有重要意义。

Description

用于检测替加环素耐药基因tet(X)及其变体的荧光定量PCR 引物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中耐药基因的分子生物学检测方法，具体涉及用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)及tet(X)变体的SYBRGreen荧光定量PCR引物组合物及其应用。
背景技术
替加环素是人医专用的新型甘氨酰四环素类抗菌药物，其在治疗多重耐药“超级细菌”感染具有良好效果且毒副作用低，具有很好的应用前景。然而，近期申请人团队首次从我国食品动物和动物性食品的不动杆菌和大肠杆菌中发现了由质粒携带的tet(X)基因变体tet(X3)和tet(X4)，其编码的单加氧修饰酶不仅可介导细菌对替加环素的高水平耐药(MIC＝32-64mg l-1)，还可通过插入序列等移动元件进行水平已往对tet(X)的报道主要集中于厌氧菌和非常规培养菌中，其定位于染色体且主要介导对替加环素的低水平耐药(MIC≤4mg l-1)。以tet(X3/X4)为代表的可转移tet(X)新型变体的出现，表明此类基因已突破细菌种属屏障进入临床重要菌属中，可能对食品安全和人类健康造成重大威胁，并预示着替加环素也面临失效风险。因此，监测tet(X)基因在环境中流行情况就变的十分必要。
然而，传统的检测方法，如常规PCR和Sanger测序，耗时耗力。
发明内容
本发明索要解决的问题在于提供一种用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的荧光定量PCR检测方法。
本发明提供了用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的引物组合物，由名称分别为引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ和引物对Ⅳ的引物对组成，所参照的tet(X)的DNA序列如序列9所示，所述tet(X)变体可以为tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)中的至少一种，tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)的DNA序列分别对应序列见序列表中的序列11、序列10、序列12和序列13。
所述引物对Ⅰ由引物tet(X/X2)-F和引物tet(X/X2)-R组成；
所述引物tet(X/X2)-F为如下(a1)或(a2):
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述tet(X/X2)-R为如下(a3)或(a4):
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅱ由引物tet(X1)-F和引物tet(X1)-R组成；
所述引物tet(X1)-F为如下(b1)或(b2):
(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物tet(X1)-R为如下(b3)或(b4):
(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅲ由引物tet(X3)-F和引物tet(X3)-R组成；
所述引物tet(X3)-F为如下(c1)或(c2):
(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物tet(X3)-R为如下(c3)或(c4):
(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅳ由引物tet(X4)-F和引物tet(X4)-R组成；
所述引物tet(X4)-F为如下(d1)或(d2):
(d1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物tet(X4)-R为如下(d3)或(d4):
(d3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子。
所述tet(X)变体为tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)中的至少一种。
为解决上述技术问题，本发明还提供了PCR引物对。
本发明所提供的PCR引物对，为用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的PCR引物对，其中，所述用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X/X2)的PCR引物对为引物对Ⅰ；所述用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X1)的PCR引物对为引物对Ⅱ；所述用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X3)的PCR引物对为引物对Ⅲ；所述用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X4)的PCR引物对为引物对Ⅳ。
所述用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的成套试剂或者用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的PCR引物对的用途也应在本发明的保护范围内，所述应用为如下(1)或(2)：
(1)检测待测样本中的替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)；
(2)制备用于检测待测样本中替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的试剂盒。
本发明还提供用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的成套试剂的试剂盒；所述试剂盒含有用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的成套试剂或者用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的PCR引物对。
其中，所述试剂盒中的引物单独包装。
所述试剂盒的用途为检测待测样本中替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体。
上述引物组合物中，各个引物对的配比本领域技术人员可根据检测效果确定，如各引物对可等摩尔。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的方法，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别用引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ和引物对Ⅳ对其进行PCR扩增，如果采用引物对I可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带tet(X/X2)耐药基因；如果采用引物对Ⅱ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带tet(X1)耐药基因；如果采用引物对Ⅲ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带tet(X3)耐药基因；如果采用引物对Ⅳ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带tet(X4)耐药基因。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的方法，包括如下步骤：检测待测样本的核酸中是否含有引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ或引物对Ⅳ的靶序列，如果所述核酸中含有引物对I的靶序列，待测样本携带tet(X/X2)耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅱ的靶序列，待测样本携带tet(X1)耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅲ的靶序列，待测样本携带tet(X3)耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅳ的靶序列，待测样本携带tet(X4)耐药基因。
本发明还保护一种定量检测待测样本是否含有替加环素耐药基因tet(X)及其变体的方法，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别采用用引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ和引物对Ⅳ进行荧光定量PCR扩增，根据Ct值结合耐药基因的标准曲线方程对待测样本中的替加环素耐药基因tet(X)及其变体进行定量。
所述定量方法为将Ct值作为Y值代入标准曲线方程，得到的X值为目的基因的拷贝数的对数值。
tet(X/X2)耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.138X+36.825。
tet(X1)耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.291X+38.212。
tet(X3)耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.305X+38.378。
tet(X4)耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.328X+39.926。
以上任一所述PCR扩增的反应体系具体可为：上游引物0.8μl，下游引物0.8μl,2×Taq PCR MasterMix10μl,无核酸水6.4μl，DNA模版2μl。PCR扩增反应程序具体可为：95℃，5min；30×(95℃，30s；60℃,30s；72℃,30s)；72℃,10min。
上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。
以上任一所述荧光定量PCR扩增的反应体系具体可为：PowerUpTM SYBRTM GreenMaster Mix(2×)10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，Rnase-Free水6.4μL，模板2μL。荧光定量PCR扩增的反应程序具体可见表3。
本发明还提供一种引物组合物，为如下(a)或(b)：
(a)所述引物对Ⅰ或所述引物对Ⅱ或所述引物对Ⅲ或所述引物对Ⅳ；
(b)所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ中的任意两个引物对的组合、任意三个引物对的组合。
本发明还保护所述引物组合物在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒的用途为检测待测样本中替加环素耐药基因tet(X)的5种变体。
本发明还保护含有所述引物组合乙的试剂盒，所述试剂盒的用途为检测待测样本中的替加环素耐药基因tet(X)的5种变体。
以上所述替加环素耐药基因tet(X)的5种变体具体为tet(X)、tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)，其中本发明中针对tet(X)、tet(X2)两种变体设计通用引物tet(X/X2)，因该两种变体序列相似，仅相差3个碱基。
本发明针对替加环素耐药基因及其变体，(即tet(X)、tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4))建立了相应荧光定量PCR方法，该检测方法适用于可培养菌和不可培养菌，并且PCR反应条件相同，从而保证了在同一PCR条件下可以对样品中替加环素耐药基因tet(X)的5种变体进行同时检测，对于环境中替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的监测具有重要意义。
附图说明
图1为替加环素耐药基因tet(X)的PCR电泳结果；
图2为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X1)变体的PCR电泳结果；
图3为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X3)变体的PCR电泳结果；
图4为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X4)变体的PCR电泳结果；
图5为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X/X2)变体10倍倍比稀释质粒标准品的PCR检测的溶解曲线；
图6为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X1)变体10倍倍比稀释质粒标准品的PCR检测的溶解曲线；
图7为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X3)变体10倍倍比稀释质粒标准品的PCR检测的溶解曲线；
图8为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X4)变体10倍倍比稀释质粒标准品的PCR检测的溶解曲线。
图9为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X/X2)变体10倍系列稀释质粒标准品的荧光定量PCR检测的扩增曲线；
图10为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X1)变体10倍系列稀释质粒标准品的荧光定量PCR检测的扩增曲线；
图11为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X3)变体10倍系列稀释质粒标准品的荧光定量PCR检测的扩增曲线；
图12为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X4)变体10倍系列稀释质粒标准品的荧光定量PCR检测的扩增曲线；
图13为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X/X2)变体10倍系列稀释质粒标准品的荧光定量PCR检测的标准曲线；
图14为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X1)变体10倍系列稀释质粒标准品的荧光定量PCR检测的标准曲线；
图15为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X3)变体10倍系列稀释质粒标准品的荧光定量PCR检测的标准曲线；
图16为替加环素耐药基因tet(X)的tet(X4)变体10倍系列稀释质粒标准品的荧光定量PCR检测的标准曲线；
图17为替加环素耐药基因tet(X)的5种变体进行引物特异性验证的结果；
图18为替加环素耐药基因tet(X)的5种变体在不同野生菌株中的丰度；
图19为替加环素耐药基因tet(X)的3种变体在不同环境样品中的丰度。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、引物的设计及制备
进行大量序列分析、比对获得了用于检测替加环素耐药基因tet(X)的5种变体(tet(X)、tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4))的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于检测替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的引物组，具体如表1所示。
表1替加环素耐药基因tet(X)的5种变体和内参基因16S rRNA的引物信息
Figure BDA0002260431840000061
引物tet(X/X2)-F和引物tet(X/X2)-R组成引物对I；
引物tet(X1)-F和引物tet(X1)-R组成引物对Ⅱ；
引物tet(X3)-F和引物tet(X3)-R组成引物对Ⅲ；
引物tet(X4)-F和引物tet(X4)-R组成引物对Ⅳ。
实施例2、质粒标准品的构建
1、tet(X/X2)质粒标准品：将序列表的序列14所示的双链DNA分子插入pDM19-T载体(pDM19-T载体：Takara宝生物工程(大连)有限公司，货号：6013)的EcoR Ⅴ位点，得到tet(X/X2)质粒标准品，将其命名为pDM19-T-tet(X/X2)，所述pDM19-T-tet(X/X2)为pDM19-T在EcoR Ⅴ位点插入序列14并保持pDM19-T质粒其他部分的序列不变。pDM19-T-tet(X/X2)含有替加环素耐药基因tet(X)和tet(X2)的共同序列(即序列14所示的核苷酸序列)。
2、tet(X1)质粒标准品：将序列表的序列15所示的双链DNA分子插入pDM19-T载体的EcoR Ⅴ位点，得到tet(X1)质粒标准品，将其命名为pDM19-T-tet(X1)，所述pDM19-T-tet(X1)为pDM19-T在EcoRⅤ位点插入序列15并保持pDM19-T质粒其他部分的序列不变。
3、tet(X3)质粒标准品：将序列表的序列16所示的双链DNA分子插入pDM19-T载体的EcoRⅤ位点，得到tet(X3)质粒标准品，将其命名为pDM19-T-tet(X3)，所述pDM19-T-tet(X3)为pDM19-T在EcoRⅤ位点插入序列16并保持pDM19-T质粒其他部分的序列不变。
4、tet(X4)质粒标准品：将序列表的序列17所示的双链DNA分子插入pDM19-T载体的EcoR Ⅴ位点，得到tet(X4)质粒标准品，将其命名为pDM19-T-tet(X4)，所述pDM19-T-tet(X4)为pDM19-T在EcoRⅤ位点插入序列17并保持pDM19-T质粒其他部分的序列不变。
实施例3、标准曲线的建立
采用实施例2制备的5种质粒标准品分别建立标准曲线。
1、计算质粒标准品的拷贝数，计算方式如下：
copies/μl＝(L×C)/(N×M×109)；
L:阿弗加德罗常数(6.02x1023/mol)；
C:质粒DNA的浓度(ng/μl)；
N:重组质粒长度，单位是bp；
M:每对碱基的平均分了量(660/bp)。
2、分别将将质粒标准品pDM19-T-tet(X)、pDM19-T-tet(X1)、pDM19-T-tet(X2)、pDM19-T-tet(X3)和pDM19-T-tet(X4)采用实时荧光定量PCR标曲专用的稀释液EASYDilution(购于Takara宝生物工程(大连)有限公司，货号：9160)稀释为不同梯度浓度(10- 1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、10-6ng/μL、10-7ng/μL、10-8ng/μL、10- 9ng/μL和10-10ng/μL)。
3、采用引物对I对不同浓度的pDM19-T-tet(X)进行荧光定量PCR；采用引物对I对不同浓度的pDM19-T-tet(X2)进行荧光定量PCR采用引物对Ⅱ对不同浓度的pDM19-T-tet(X1)进行荧光定量PCR；采用引物对Ⅲ对不同浓度的pDM19-T-tet(X3)进行荧光定量PCR；采用引物对Ⅳ对不同浓度的pDM19-T-tet(X4)进行荧光定量PCR。内参引物信息见表1中的16S-F和16S-R。
上述荧光定量PCR的荧光定量PCR反应体系均为：PowerUpTM SYBRTM GreenMasterMix(2×)(北京赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：A25742)10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，Nuclease-Free水6.4μL，模板2μL。上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。
上述荧光定量PCR的荧光定量PCR反应程序如表2所示。
表2实时荧光定量PCR反应程序
Figure BDA0002260431840000081
以Ct值(ThresholdCycle:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)为横坐标,起始模板拷贝数的对数为纵坐标,这两者之间存在线性关系，利用PCR反应得到的Ct值和己知的起始模板拷贝数的对数制作标准曲线。
溶解曲线是指定量PCR反应结束之后让样品继续升温直到PCR产物的双链全部打开，这时由于双链打开，荧光染料不发荧光，这样荧光值会有一个陡然的突降，借以检测PCR产物的特异性，相当于进行电泳检测。因为不同的PCR产物片段其TM值不同，单一的双链DNA其荧光陡降的温度一致，如果含有非特异性扩增产物，那么其荧光陡降的温度不止一个(两个或者更多)，说明PCR引物特异性不够，需要重新设计引物进行标准曲线的制作。如溶解曲线出现单峰则说明引物特异性良好，可用于定量检测。
质粒标准品的荧光定量PCR检测的溶解曲线如图5-图8所示。
质粒标准品的荧光定量PCR检测的扩增曲线如图9-图12所示。
质粒标准品的荧光定量PCR检测的标准曲线如图13-图16所示。图13-图16中分别展示了耐药基因tet(X/X2)、tet(X1)、tet(X3)、tet(X4)的标准曲线方程、相关系数R2及引物的扩增效率。
tet(X/X2)耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.138X+36.825。(然后此处tet(X)和tet(X2)的标准曲线相同，均为此方程)
tet(X1)耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.291X+38.212。
tet(X3)耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.305X+38.378。
tet(X4)耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.328X+39.926。
tet(X/X2)耐药基因、tet(X1)耐药基因、tet(X3)耐药基因、tet(X4)耐药基因检测范围分别为:(13.12*100～1.31*109copies/μl)、(10.94*100～1.09*109copies/μl)、(1.07*101～1.07*109copies/μl)、(8.42*100～8.42*108copies/μl)。
实施例4、引物验证及验证性实验
一、质粒标准品验证引物
待测样本：实施例2制备的4个质粒标准品。
以待测样本为模板，分别采用实施例1中的引物对I至引物对Ⅳ进行PCR扩增。
引物对I至引物对Ⅳ的PCR扩增反应体系均为：上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，2×Taq PCR MasterMix(购于南京诺维赞生物科技有限公司,P111-01)10μL，基因组模板2μL，灭菌水加至20μL。
上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。
采用无核酸水作为阴性对照。
引物对I至引物对Ⅳ的PCR扩增反应程序均为：95℃，5min；30×(95℃，30s；60℃,30s；72℃,30s)；72℃,10min。
结果表明，引物对I可以实现对tet(X/X2)质粒标准品的特异扩增，且对其余3种耐药基因质粒标准品不能实现扩增。引物对Ⅱ可以实现对tet(X1)质粒标准品的特异扩增，且对其余3种耐药基因质粒标准品不能实现扩增。引物对Ⅲ可以实现对tet(X3)质粒标准品的特异扩增，且对其余3种质粒标准品不能实现扩增。引物对Ⅳ可以实现对tet(X4)质粒标准品的特异扩增，且对其余3种耐药基因质粒标准品不能实现扩增。
二、菌株验证引物
阳性样本：见表3，菌株均经一代测序分析确定携带的耐药基因类型。
表3目标基因阳性菌株信息
Figure BDA0002260431840000091
其中特异性阳性菌株DH5α-tet(X)、DH5α-tet(X1)和DH5α-tet(X2)由如下方法重组构建：1)分别人工合成替加环素耐药基因tet(X)(其核苷酸序列如序列9所示)、tet(X1)(其核苷酸序列如序列11所示)和tet(X2)(其核苷酸序列如序列10所示)；
2)构建重组质粒，分别将替加环素耐药基因tet(X)、tet(X1)和tet(X2)插入到质粒质粒pET-28a(+)的NdeI识别位点和HindII识别位点之间，得到重组质粒质粒pET-28-tet(X)，pET-28-tet(X1)和pET-28-tet(X2)。其中，pET-28a(+)购自武汉淼灵生物科技有限公司；
3)重组菌的构建，将分别将pET-28-tet(X)、pET-28-tet(X1)和pET-28-tet(X2)转染至大肠杆菌DH5α中，得到阳性菌株DH5α-tet(X)、DH5α-tet(X1)和DH5α-tet(X2)。
为保证引物验证时阳性对照的特异性与准确性，本实验室PCR扩增保存的分别携带tet(X3)和tet(X4)基因型的阳性菌株34AB和47EC，并按照以上方法获得重组质粒pET-28-tet(X3)、pET-28-tet(X4)和重组菌DH5α-tet(X3)、DH5α-tet(X4).
阳性菌株34AB和47EC在参考文献：He T,Wang R,Liu D,et al.Emergence ofplasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes in animals andhumans.Nat Microbiol.2019Sep；4(9):1450-1456.doi:10.1038/s41564-019-0445-2.Epub 2019 May 27中公开，公众可以从中国农业大学汪洋老师试验室获得。
提取阳性菌株的质粒DNA，以质粒DNA为模板，分别采用实施例1中的引物对I至引物对Ⅳ进行普通PCR扩增和SYBRGreen荧光定量PCR扩增。
引物对I至引物对Ⅳ的PCR扩增反应体系均为：上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，2×Taq PCR MasterMix(购于南京诺维赞生物科技有限公司,P111-01)10μL，基因组模板2μL，灭菌水加至20μL。
上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。
采用无核酸水作为阴性对照。
引物对I至引物对Ⅳ的PCR扩增反应程序均为：95℃，5min；30×(95℃，30s；60℃,30s；72℃,30s)；72℃,10min。
结果如图1-4和图17所示。图1为采用引物对I对分别携带替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的阳性菌和阴性对照进行扩增的结果；图2为采用引物对Ⅱ对分别携带替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的阳性菌和阴性对照进行扩增的结果；图3为采用引物Ⅲ对分别携带替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的阳性菌和阴性对照进行扩增的结果；图4为采用引物对Ⅳ对分别携带替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的阳性菌和阴性对照进行扩增的结果。图17为分别采用引物对I、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ对分别携带替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的阳性菌进行SYBRGreen荧光定量PCR扩增定量检测的结果，荧光定量PCR的扩增体系和扩增程序比照实施例3中的记载。
从图1-4和图17中的结果可以看出，引物对I可以同时实现对tet(X)和tet(X2)基因的特异扩增，且对其余3种耐药基因不能实现扩增。引物对Ⅱ可以实现对tet(X1)基因的特异扩增，且对其余4种耐药基因不能实现扩增。引物对Ⅲ可以实现对tet(X3)基因的特异扩增，且对其余4种耐药基因不能实现扩增。引物对Ⅳ可以实现对tet(X4)基因的特异扩增，且对其余4种耐药基因不能实现扩增。
实施例5、样本的实际检测
一、菌株检测
待测样本：见表5，所述菌株公众均可从中国农业大学处获得。
表5待测菌株信息
Figure BDA0002260431840000111
提取待测样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用引物对I至引物对Ⅳ对模板进行进行荧光定量PCR，荧光定量PCR的反应体系和反应程序同实施例4。
注：因为本实验室无携带tet(X)、tet(X1)两种耐药基因的野生菌株，所以该过程未检测携带这两种耐药基因的野生菌株。
如果可以实现阳性扩增，则该菌株为该耐药基因阳性菌株，如果不能实现阳性扩增，则该菌株为该耐药基因阴性菌株。
结果如表6和图18所示。
表6-替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的阳性菌信息及荧光定量PCR检测结果
Figure BDA0002260431840000112
a为所测菌株数，b为阳性菌株数，DH5α为阴性菌株
二、环境样品检测
待测样品信息见表7。
表7环境样品信息
Figure BDA0002260431840000121
提取待测样本的总DNA，以总DNA为模板，分别采用引物对I至引物对Ⅳ对模板进行荧光定量PCR，荧光定量PCR的反应体系和反应程序同实施例4。
将得到的Ct值代入实施例4得到的标准曲线方程，计算样品中耐药基因的丰度，结果见表8和图19。
表8-替加环素耐药基因tet(X)的5种变体的环境样本荧光定量PCR检测结果
Figure BDA0002260431840000122
c指样本中检测到含有所测基因；d指所检样本数。
上述结果表明，本发明设计的引物和建立的检测方法可以实现在同一PCR条件下对样品中替加环素耐药基因tet(X)这5种变体进行检测，结果可靠。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 用于检测替加环素耐药基因tet(X)及其变体的荧光定量PCR引物组合物及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcggctaat ggcatctcac 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgctacac atgacaacgt cgt 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcgtttcc gagttcttga 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggacgattac tcttccaagg ct 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtggatgctt tgctattgtc tga 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctgttgatt cgtcctgcgt at 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgctacaaa gaactgattc gtg 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtcgcttac ttctccaaga cttac 25
<210> 9
<211> 1167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgacaatgc gaataaatac agacaaacaa atgaatttac ttagtgataa gaacgttgca 60
ataattggtg gtggacccgt tggactgact atggcaaaat tattacagca aaacggcata 120
gacgtttcag tttacgaaag agacaacgac cgagaggcaa gaatttttgg tggaaccctt 180
gacctacaca aaggttcagg tcaggaagca atgaaaaaag cgggattgtt acaaacttat 240
tatgacttag ccttaccaat gggtgtaaat attgctgatg aaaaaggcaa tattttatcc 300
acaaaaaatg taaagcccga aaatcgattt gacaatcctg aaataaacag aaatgactta 360
agggctatct tgttgaatag tttagaaaac gacacggtta tttgggatag aaaacttgtt 420
atgcttgaac ctggtaagaa gaagtggaca ctaacttttg agaataaacc gagtgaaaca 480
gcagatttgg ttattcttgc caatggcggg atgtccaagg taagaaaatt tgttaccgac 540
acggaagttg aagaaacagg tactttcaat atacaagccg atattcatca accagagata 600
aactgtcctg gattttttca gctatgcaat ggaaaccggc taatggcatc tcaccaaggt 660
aatttattat ttgctaaccc caataataat ggtgcattgc attttggaat aagttttaaa 720
acacctgatg aatggaaaaa ccaaacgcag gtagattttc aaaacagaaa tagtgtcgtt 780
gattttcttc tgaaaaaatt ttccgattgg gacgaacgct acaaagaatt gattcatgcg 840
acgttgtcat ttgtaggatt ggctacacgg atatttcctt tagaaaagcc ttggaaaagc 900
aagcgcccat tacccataac aatgattggg gatgccgcac atttgatgcc gccttttgca 960
gggcagggag taaatagtgg gttggtggat gccttgatat tgtctgataa tctagccgat 1020
ggaaaattta atagcattga agaggctgtt aaaaattatg aacagcaaat gtttatctat 1080
ggcaaagaag cacaagaaga atcaactcaa aacgaaattg aaatgtttaa acccgacttt 1140
acgtttcagc aattgttaaa tgtataa 1167
<210> 10
<211> 1167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgacaatgc gaatagatac agacaaacaa atgaatttac ttagtgataa gaacgttgca 60
ataattggtg gtggacccgt tggactgact atggcaaaat tattacagca aaacggcata 120
gacgtttcag tttacgaaag agacaacgac cgagaggcaa gaatttttgg tggaaccctt 180
gacctacaca aaggttcagg tcaggaagca atgaaaaaag cgggattgtt acaaacttat 240
tatgacttag ccttaccaat gggtgtaaat attgctgatg aaaaaggcaa tattttatcc 300
acaaaaaatg taaagcccga aaatcgattt gacaatcctg aaataaacag aaatgactta 360
agggctatct tgttgaatag tttagaaaac gacacggtta tttgggatag aaaacttgtt 420
atgcttgaac ctggtaagaa gaagtggaca ctaacttttg agaataaacc gagtgaaaca 480
gcagatttgg ttattcttgc caatggcggg atgtccaagg taagaaaatt tgttaccgac 540
acggaagttg aagaaacagg tactttcaat atacaagccg atattcatca accagagata 600
aactgtcctg gattttttca gctatgcaat ggaaaccggc taatggcatc tcaccaaggt 660
aatttattat ttgctaaccc caataataat ggtgcattgc attttggaat aagttttaaa 720
acacctgatg aatggaaaaa ccaaacgcag gtagattttc aaaacagaaa tagtgtcgtt 780
gattttcttc tgaaagaatt ttccgattgg gacgaacgct acaaagaatt gattcatacg 840
acgttgtcat ttgtaggatt ggctacacgg atatttcctt tagaaaagcc ttggaaaagc 900
aagcgcccat tacccataac aatgattggg gatgccgcac atttgatgcc gccttttgca 960
gggcagggag taaatagtgg gttggtggat gccttgatat tgtctgataa tctagccgat 1020
ggaaaattta atagcattga agaggctgtt aaaaattatg aacagcaaat gtttatctat 1080
ggcaaagaag cacaagaaga atcaactcaa aacgaaattg aaatgtttaa acccgacttt 1140
acgtttcagc aattgttaaa tgtataa 1167
<210> 11
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggcaaact tgttacaaca aaacggtatt gacattaccg tttacgaaag agatgaaaac 60
ccaaaagcac gagtttgggg cggaacgctt gaccttcaca aaaattcagg acaagaagca 120
atgaaaaaag taggattgtt gcaaacctac tatgatttgg cgctacctat gggcgtaaac 180
tttgctgatg agaagggtaa cattatagca acaagaaacc cgacactcga aaataagttt 240
gacaaccccg aaataaatag aaacgcgttg cgaaaaatgt tgcttggcag cttgaaaaat 300
gacacagttg tttgggatag aaaatctatt gggcttgaac aagaaaacgg aaaatggctg 360
ctacattttg aaaataagcc aactgcattg gccgacttta ttattgtttc caatggtgga 420
atgtctaaaa taagaaattt tgtttcagat aatgaagtcg aagaaacagg tacttttatt 480
attcagggcg acattcctga accagaaacg aactgccctg aattttataa gttgtgcaac 540
aacaatagac taatgaccgc acatcaaggg aatttattag ttgcgaatcc atttaacaac 600
ggaatgttaa cttacggtgt cattttcaaa aagcctgaag aatggaataa tggaaaagga 660
ttagatttta agcccacaaa aagcgtttcc gagttcttga caaacaggtt ttcaaattgg 720
agcaatgaat acaaggagtt aattcgttca acaacttttt tcgttggttt aacaataaaa 780
atatttccgc tagacaaaaa gccttggaag agtaatcgtc cgttacccat aactttaatt 840
ggcgacacag ctcacctaat gccacctttt gcagggcagg gcgtaaacat tggactaatg 900
gacgctttga ttttgtcaga aaatcttaca aacgggaaat ttggaacgat acaaagtgct 960
attgatgact atgaacaacg aatgtttgtt tacgcaacag aagcacaagc ggactcgaca 1020
aagaatgaaa tagaaatgcg aaatccgagc tttacttttc aacagctaat gaatgtataa 1080
<210> 12
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgcgaatag atacagacaa acaaatgaat ttacttagtg ataagaacgt tgcaataatt 60
ggtggtggac ccgttggact gactatggca aaattattac agcaaaacgg catagacgtt 120
tcagtttacg aaagagacaa cgaccgagag gcaagaattt ttggtggaac ccttgaccta 180
cacaaaggtt caggtcagga agcaatgaaa aaagcgggat tgttacaaac ttattatgac 240
ttagccttac caatgggtgt aaatattgct gatgaaaaag gcaatatttt atccacaaaa 300
aatgtaaagc ccgaaaatcg atttgacaat cctgaaataa acagaaatga cttaagggct 360
atcttgttga atagtttaga aaacgacacg gttatttggg atagaaaact tgttatgctt 420
gaacctggta agaagaagtg gacactaact tttgagaata aaccgagtga aacagcagat 480
ttggttattc ttgccaatgg tggaatgtcg aaaataagga gctttgttac cgacacgcaa 540
gttgaagaaa ccggtacttt caacatccaa gctgatattc ttcaaccgga aataaactgt 600
cccggatttt ttcagctatg caacggcaac cgattaatgg cgggacatca gggcatttta 660
ttgtttgcca atcccaataa taatggtgca ttgtatttag gaattagttt taaaacgccc 720
gatgaatgga aaaataaaat tcccttagat tttcaggaca gaaacagcgt tgccgatttt 780
ttattgaaaa gattttccaa atggagtgaa gtttacaaac aattaatacg ttcggtatca 840
acatttcaat gcttgcccac aaggaaattt cctttgaaca atgattggaa aagtaaccgt 900
ccattaccca taacaatgat tggcgatgct gctcatttga tgtcgccttt tgcaggacag 960
ggtgtaaata cgggattatt ggatgctttg atattgtctg aaaaccttac aaacggagaa 1020
tttacaagta ttgaaaatgc catcgaaaac tacgaacaac aaatgtttgt ttatgcaaaa 1080
gatacgcagg acgaatcgac agaaaacgaa accgaaatgt ttagtcccaa tttttcgttt 1140
caaaaattat tgaatctata a 1161
<210> 13
<211> 1158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgagcaata aagaaaaaca aatgaattta cttagtgata agaacgttgc aataattggt 60
ggtggacccg ttggactgac tatggcaaaa ttattacagc aaaacggcat agacgtttca 120
gtttacgaaa gagacaacga ccgagaggca agaatttttg gtggaaccct tgacctacac 180
aaaggttcag gtcaggaagc aatgaaaaaa gcgggattgt tacaaactta ttatgactta 240
gccttaccaa tgggtgtaaa tattgctgat gaaaaaggca atattttatc cacaaaaaat 300
gtaaagcccg aaaatcgatt tgacaatcct gaaataaaca gaaatgactt aagggctatc 360
ttgttgaata gtttagaaaa cgacacggtt atttgggata gaaaacttgt tatgcttgaa 420
cctggtaaga agaagtggac actaactttt gagaataaac cgagtgaaac agcagatctg 480
gttattattg ccaatggtgg aatgtctaaa gtaagaaaat ttgttaccga cacggaagtt 540
gaagaaacag gtactttcaa tatacaagcc gatattcatc atccagaggt gaactgtcct 600
ggattttttc agctatgcaa tggaaaccgg ctaatggctg ctcatcaagg taatttatta 660
tttgcgaatc ctaataataa tggtgcattg cattttggaa taagttttaa aacacctgat 720
gaatggaaaa accaaacgca ggtagatttt caaaacagaa atagtgtcgt tgattttctt 780
ctgaaagaat tttccgattg ggacgaacgc tacaaagaac tgattcgtgt gacatcatct 840
tttgtagggt tagcgacacg aatatttccc ttaggtaagt cttggaaaag taagcgtcca 900
ttacccataa cgatgattgg agatgctgct catttgatgc ctccttttgc aggacaaggc 960
gtaaacagcg ggttgatgga tgccttgata ttgtcggata atctgaccaa tgggaaattt 1020
aacagcattg aagaggctat tgaaaattat gaacagcaaa tgtttatcta tggcaaagaa 1080
gcacaagaag aatcaactca aaacgaaatt gaaatgttta aacccgactt tacgtttcag 1140
caattgttaa atgtataa 1158
<210> 14
<211> 226
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgcggctaat ggcatctcac caaggtaatt tattatttgc taaccccaat aataatggtg 60
cattgcattt tggaataagt tttaaaacac ctgatgaatg gaaaaaccaa acgcaggtag 120
attttcaaaa cagaaatagt gtcgttgatt ttcttctgaa agaattttcc gattgggacg 180
aacgctacaa agaattgatt catacgacgt tgtcatgtgt agcagc 226
<210> 15
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagcgtttcc gagttcttga caaacaggtt ttcaaattgg agcaatgaat acaaggagtt 60
aattcgttca acaacttttt tcgttggttt aacaataaaa atatttccgc tagacaaaaa 120
gccttggaag agtaatcgtc c 141
<210> 16
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtggatgctt tgctattgtc tgaaaacctt acaaacggag aatttacaag tattgaaaat 60
gccatcgaaa actacgaaca acaaatgttt gtttatgcaa aagatacgca ggacgaatca 120
acaga 125
<210> 17
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgctacaaa gaactgattc gtgtgacatc atcttttgta gggttagcga cacgaatatt 60
tcccttaggt aagtcttgga gaagtaagcg acc 93

Claims (10)

1.用于检测替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的引物组合物，其特征在于，由名称分别为引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ和引物对Ⅳ的引物对组成；
所述引物对Ⅰ由引物tet(X/X2)-F和引物tet(X/X2)-R组成；
所述引物tet(X/X2)-F为如下(a1)或(a2):
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述tet(X/X2)-R为如下(a3)或(a4):
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅱ由引物tet(X1)-F和引物tet(X1)-R组成；
所述引物tet(X1)-F为如下(b1)或(b2):
(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物tet(X1)-R为如下(b3)或(b4):
(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅲ由引物tet(X3)-F和引物tet(X3)-R组成；
所述引物tet(X3)-F为如下(c1)或(c2):
(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物tet(X3)-R为如下(c3)或(c4):
(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物对Ⅳ由引物tet(X4)-F和引物tet(X4)-R组成；
所述引物tet(X4)-F为如下(d1)或(d2):
(d1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物tet(X4)-R为如下(d3)或(d4):
(d3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
其中，所述tet(X)变体为tet(X1)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)中的至少一种。
2.权利要求1所述引物组合物的应用，为如下(1)或(2)：
(1)检测待测样本中是否含有替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体；
(2)制备用于检测待测样本中是否含有替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的试剂盒。
3.含有权利要求1所述引物组合物的成套试剂或者试剂盒。
4.如权利要求1所述引物组合物或权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每对所述引物单独包装。
5.一种检测待测样本中是否含有替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的方法，包括如下步骤：检测待测样本的核酸中是否含有权利要求1中的含有引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ或引物对Ⅳ的靶序列，如果所述核酸中含有引物对I的靶序列，待测样本携带或候选携带tet(X)和/或tet(X2)；如果所述核酸中含有引物对Ⅱ的靶序列，待测样本携带或候选携带tet(X1)；如果所述核酸中含有引物对Ⅲ的靶序列，待测样本携带或候选携带tet(X3)；如果所述核酸中含有引物对Ⅳ的靶序列，待测样本携带或候选携带tet(X4)。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，检测待测样本的核酸中是否含有权利要求1中的含有引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ或引物对Ⅳ的靶序列的方法为：以待测样本的核酸为模板，分别采用权利要求1中的用引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ和引物对Ⅳ进行PCR扩增；如果所述PCR扩增能得到特异扩增产物，所述待测样本含有或候选含有该引物对的靶序列，如果所述PCR扩增不能得到特异扩增产物，所述待测样本不含有或没有候选含有该引物对的靶序列。
7.一种定量检测待测样本中是否含有替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别采用权利要求1中的用引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ和引物对Ⅳ进行荧光定量PCR扩增，根据Ct值对待测样本中的替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体进行定量。
8.用于检测替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的引物组合物，为如下(a)或(b)：
(a)权利要求1中的所述引物对Ⅰ或所述引物对Ⅱ或所述引物对Ⅲ或所述引物对Ⅳ；
(b)权利要求1中的所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ、所述引物对Ⅳ、任意两个引物对的组合、任意三个引物对的组合的组合。
9.权利要求8所述引物组合物的应用，为如下(1)或(2)：
(1)在检测待测样本中是否含有替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体；
(2)制备用于检测待测样本中是否含有替加环素耐药基因tet(X)和/或tet(X)变体的试剂盒。
10.含有权利要求8所述引物组合物的成套试剂或试剂盒。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005211A (zh) * 2019-12-20 2021-06-22 中国农业大学 用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)及其变体的LAMP引物和方法
CN114032318A (zh) * 2021-11-30 2022-02-11 中国农业大学 一种检测肠杆菌科细菌中是否含有能够介导替加环素耐药的tet(X)基因变异体的方法
CN116063537A (zh) * 2022-12-09 2023-05-05 深圳市儿童医院 一种高亲和力结合tet(x2)蛋白的单克隆抗体及其产品和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110257509A (zh) * 2019-08-02 2019-09-20 浙江大学 替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110257509A (zh) * 2019-08-02 2019-09-20 浙江大学 替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LESKI,T.A.等: "Delftia sp. SL20 tetracylcine resistance protein TetX gene, complete cds", 《GENBANK》, 6 March 2014 (2014-03-06), pages 990988 *
TAO HE等: "Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes in animals and humans", 《NATURE MICROBIOLOGY》, vol. 4, 17 May 2019 (2019-05-17), pages 1450, XP036870022, DOI: 10.1038/s41564-019-0445-2 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005211A (zh) * 2019-12-20 2021-06-22 中国农业大学 用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)及其变体的LAMP引物和方法
CN114032318A (zh) * 2021-11-30 2022-02-11 中国农业大学 一种检测肠杆菌科细菌中是否含有能够介导替加环素耐药的tet(X)基因变异体的方法
CN116063537A (zh) * 2022-12-09 2023-05-05 深圳市儿童医院 一种高亲和力结合tet(x2)蛋白的单克隆抗体及其产品和应用
CN116063537B (zh) * 2022-12-09 2023-12-29 深圳市儿童医院 一种高亲和力结合tet(x2)蛋白的单克隆抗体及其产品和应用

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