CN113005211A - 用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)及其变体的LAMP引物和方法 - Google Patents

用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)及其变体的LAMP引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)及其变体的LAMP引物和方法，所述鉴定或辅助鉴定替加环素耐药基因的成套引物，由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA和名称为BIP的单链DNA组成。本发明引物组可以有效且准确的检测出替加环素耐药基因tet(X)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)，该方法具有检测结果直观的可视化，便于快速辨别，临场应用；同时本发明的检测方法灵敏度显著高于常规PCR检测方法10～100倍。

Description

用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)及其变体的LAMP引 物和方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种多黏菌素耐药基因tet(X)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)通用性LAMP(环介导等温扩增PCR)引物及检测方法。
背景技术
抗菌药物的广泛应用导致了细菌耐药性的产生和传播，涉及到畜牧、食品、环境和卫生等多个领域，成为全球公共卫生安全的重大威胁。世界卫生组织(WHO)数据显示，细菌耐药性已经成为21世纪人类健康最大威胁之一。世界各国相继出台了多个国家计划，以期探寻有效防控措施，破解耐药性防控相关科学难题。
近年来，随着多重耐药菌的流行，碳青霉烯类、多黏菌素类及替加环素被视为抗感染的为数不多的有效药物，在临床治疗多重耐药菌感染中发挥着重要的作用。由于药物在人医及养殖业的临床的使用量的增加，耐药性问题日益凸显，人类面临进入后抗生素时代，即无药可用的境地。然而随着碳青霉烯类耐药菌CRE及多粘菌素耐药菌的相继发现和爆发，使得这些抗菌药物面临失效的风险；致使替加环素成为了目前仅有的治疗多重耐药菌感染“最后一道防线类”药物。更严重的是，在前期研究中发现和报道了能够介导替加环素高水平耐药基因tet(X3)和tet(X4)(He T,Wang R,Liu D,et al.Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes in animals and humans[J].Nature microbiology,2019:1.)，该类基因已经突破种属传播障碍，存在快速流行的风险，预示了替加环素这道防线的失守，势必会增加临床多重耐药菌治疗的难度，给人类健康带来极大威胁。如何快速反应制定快速、灵敏、特异、简单、成本低，尤其是适于临场对tet(X)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)通用性检测的方法，对于后期的疾病的风险评估和定合理的用药方案极其重要。
发明内容
本发明所述解决的技术问题在于提供一种能够可视化的且快速、灵敏高、特异高的对tet(X)、tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)通用的检测方法。
鉴定或辅助鉴定替加环素耐药基因的成套引物，由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA和名称为BIP的单链DNA组成；
所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA；
所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA；
所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA；
所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的DNA。
其中，所述替加环素耐药基因为tet(X)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)中的至少一种。
鉴定或辅助鉴定替加环素耐药基因的试剂，含有权利要求1所述成套引物与M；所述M为DNA聚合酶、反应缓冲液、甜菜碱、dNTP、Mg2+和/或羟基萘酚蓝。
其中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
其中，所述替加环素耐药基因为tet(X)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)中的至少一种。
所述成套引物的制备方法，包括将权利要求1中所述FIP、所述BIP、所述F3和所述B3分别单独包装的步骤。
所述试剂的制备方法，包括将权利要求1中所述FIP、所述BIP、所述F3和所述 B3分别单独包装的步骤。
所述成套引物在制备鉴定或辅助鉴定替加环素耐药基因试剂或试剂盒中的应用。
所述成套引物或所述试剂在鉴定或辅助替加环素耐药基因中的应用。
本发明有益效果在于，本发明引物组可以有效且准确的检测出替加环素耐药基因tet(X)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)，该方法具有检测结果直观的可视化，便于快速辨别，临场应用；同时本发明的检测方法灵敏度显著高于常规PCR检测方法10～100倍。
附图说明
图1为四种替加环素耐药基因的LAMP检测结果；
图2为20中待测菌株的LAMP检测结果；
图3为不同浓度的替加环素耐药基因tet(X)的LAMP和PCR检测对比图；
图4为不同浓度的替加环素耐药基因tet(X2)的LAMP和PCR检测对比图；
图5为不同浓度的替加环素耐药基因tet(X3)的LAMP和PCR检测对比图；
图6为不同浓度的替加环素耐药基因tet(X4)的LAMP和PCR检测对比图；
图7为引物序列对应耐药基因的靶序列的位置及引物构成。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明涉及的携带的待测菌株见表1
Myroides odoratimimus，(拟香味类香味菌)，(He T,Wang R,Liu D,et al.Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes inanimals and humans[J].Nature microbiology,2019:1.)，公众可以从中国农业大学获得。
Proteus mirabilis，(奇异变形杆菌)，(He T,Wang R,Liu D,et al.Emergenceof plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes in animals andhumans[J].Nature microbiology,2019:1.)，公众可以从中国农业大学获得。
Acinetobacter lwoffii，(鲁氏不动杆菌)，(He T,Wang R,Liu D,etal.Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes inanimals and humans[J].Nature microbiology,2019:1.)，公众可以从中国农业大学获得。
Sphingobacterium multivorum，(鞘氨醇杆菌)，(He T,Wang R,Liu D,et al.Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes inanimals and humans[J].Nature microbiology,2019:1.)，公众可以从中国农业大学获得。
Proteus vulgaris，(普通变形杆菌)，(He T,Wang R,Liu D,et al.Emergence ofplasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes in animals andhumans[J]. Nature microbiology,2019:1.)，公众可以从中国农业大学获得。
Raoultella ornithinolytica，(解鸟氨酸拉乌尔菌)，(He T,Wang R,Liu D,etal. Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes inanimals and humans[J].Nature microbiology,2019:1.)，公众可以从中国农业大学获得。
Escherichia coli，(大肠杆菌)，市售。Escherichia coli-1，(大肠杆菌)，公众可以从中国农业大学获得。
Acinetobacterjohnsonii，(不动杆菌)，(He T,Wang R,Liu D,et al.Emergenceof plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes in animals andhumans[J].Nature microbiology,2019:1.)，公众可以从中国农业大学获得。
实施例1、鉴定或者辅助鉴定替加环素耐药基因的成套试剂的制备
本发明所述的鉴定或者辅助鉴定替加环素耐药基因的成套试剂，由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA和名称为BIP的单链DNA 组成；
所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA(ATGAAAAAAGCGGGATTGT)；
所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA(TCTTACCAGGTTCAAGCATAA)；
所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA；
所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的DNA。
该鉴定或辅助鉴定替加环素耐药基因的成套试剂中，所述F3、所述B3、所述FIP 和所述BIP各自独立包装。所述引物序列对应耐药基因的靶序列的位置及引物构成如图7所示，上述引物的设计，为针对替加环素耐药基因为tet(X)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4) 进行设计，具有能够同时检测出替加环素耐药基因为tet(X)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)的特性。其中，所述的tet(X)的DNA序列如序列5所示，所述tet(X2)的DNA序列如序列6所示、所述tet(X3)的DNA序列如序列7所示、所述tet(X4)的DNA序列如序列8所示。
实施例2替加环素耐药基因的检测条件
1、替加环素耐药基因DNA的提取
将携带替加环素耐药基因的待测菌株(见表1)复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2mL的MHB液体培养基(购自北京陆桥有限公司)中，在37℃的条件下200rpm 摇培，过夜培养，离心收菌，水煮法提取DNA，得到待测菌株的总DNA。
2、LAMP检测方法
以步骤1中的DNA为模板，实施例1中的引物组合物为引物，按照LAMP检测的方法进行扩增。
LAMP反应体系：待测物的基因组DNA 1μl，0.8M甜菜碱(betaine)，180μmol/L 羟基萘酚兰，8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNApolymerase，0.2μM SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示引物，1.6μM SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物；
LAMP反应条件：62℃恒温60min。
反应结束后，记录不同体系反应体系的颜色，并按照如下方法进行结果判定：反应结束后,根据肉眼在可见光下观察到的反应体系的颜色来判定结果，可见光下，阴性样品反应结束后仍为紫色，阳性样品反应结束后由反应前的从紫色变为天蓝色。
实施例3、检测替加环素耐药基因的引物组合的特异性
1、四种不同替加环素耐药基因LAMP检测
按照实施例1中的方法，分别提取表1菌株中的DNA，并以蒸馏水为阴性对比样，按照实施例2中的方法进行LAMP检测。测试结果如图1所示，图1中的结果表明，替加环素耐药基因tet(X)及其同源基因tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)的检测结果均为天蓝色，而作为阴性对照的对照样1、对照样2、对照样3和水的测试结果均为紫色，表明，本发明的引物组合物可以有效兵准确的检测出替加环素耐药基因tet(X)及其同源基因 tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)。
为了进一步检测引物组合的特异性
选取含有如表1所示的20株菌株，并以水为对比样,按照实施例2中的方法进行LAMP检测，反应过来结果如图所示。颜色结果统计如表1所示。通过基因测序的方法对LAMP检测结果为蓝色的菌株进行测序并比对其含有的替加环素耐药基因耐药基因类型，结果如表1所示。
表1
Figure RE-GDA0002547273830000041
Figure RE-GDA0002547273830000051
由表1和图2可以看出，使用本发明的引物组合物，可以同时检测出替加环素耐药基因tet(X)及其同源基因tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)。同时，不含替加环素耐药基因tet(X)及其同源基因tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)的菌株(如编号1-5、编号11-15的菌株)，在使用本发明的引物组合进行LAMP检测时，检测结果均为紫色。作为对比例的水，在使用本发明的引物组合进行LAMP检测时，检测结果也为紫色。说明本发明的引物组合对于替加环素耐药基因tet(X)及其同源基因tet(X2)、tet(X3)、tet(X4)具有良好的特异性。
实施例4灵敏度测试
1.替加环素耐药基因tet(X)的灵敏度测试
取含有替加环素耐药基因tet(X)的待测菌株，按照实施例2中的方法和反应体系进行替加环素耐药基因tet(X)的LAMP检测，检测结果为蓝色，如图3中1所示。
分别将实施例2中的反应体系中的待测物的基因组DNA作为样品A1，并对其进行10倍系列稀释，分别得到替加环素耐药基因tet(X)含量的不同稀释倍数的稀释液作为样品A2-A10。将实施例2中的反应体系中基因组DNA 1μL替换为上述样品A1-A10，其他反应条件不变，进行LAMP检测，结果如图3A中1-10所示，其中标号1和2的样品的检测结果为蓝色，编号3-10的样品的检测结果为紫色。并将样品A1-A10使用按照He T,Wang R,Liu D,etal.Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes inanimals and humans[J].Nature microbiology,2019: 1中的方法进行PCR检测，结果如图3中B所示。图3表明，本发明的引物组合可以检测出样品A2的浓度的替加环素耐药基因tet(X)，但是使用PCR方法仅能检测样品 A1的浓度的替加环素耐药基因tet(X)，表明本发明的方法对替加环素耐药基因tet(X) 的检测的灵敏度更高。
2.替加环素耐药基因tet(X2)的灵敏度测试
取含有替加环素耐药基因tet(X2)的待测菌株，按照实施例2中的方法和反应体系进行替加环素耐药基因tet(X2)的LAMP检测，检测结果为蓝色，如图4中1所示。
分别将实施例2中的反应体系中的待测物的基因组DNA作为样品B1，并对其进行10倍系列稀释，分别得到替加环素耐药基因tet(X2)含量的不同稀释倍数的稀释液作为样品B2-B11。将实施例2中的反应体系中基因组DNA 1μL替换为上述样品 B1-B11，其他反应条件不变，进行LAMP检测，结果如图4A中1-11所示，其中标号 1-3的样品的检测结果为蓝色，编号4-11的样品的检测结果为紫色。并将样品B1-B11 按照He T,Wang R,Liu D,etal.Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes inanimals and humans[J].Nature microbiology,2019: 1中的方法进行PCR检测，结果如图4中B所示。图4表明，本发明的引物组合可以检测出样品B3的浓度的替加环素耐药基因tet(X2)，但是使用PCR方法仅能检测样品 B2的浓度的替加环素耐药基因tet(X2)，表明本发明的方法对替加环素耐药基因tet(X2) 的检测的灵敏度更高。
3.替加环素耐药基因tet(X3)的灵敏度测试
取含有替加环素耐药基因tet(X3)的待测菌株，按照实施例2中的方法和反应体系进行替加环素耐药基因tet(X3)的LAMP检测，检测结果为蓝色，如图5A中1所示。
分别将实施例2中的反应体系中的待测物的基因组DNA作为样品C1，并对其进行10倍系列稀释，分别得到替加环素耐药基因tet(X3)含量的不同稀释倍数的稀释液作为样品C2-C11。将实施例2中的反应体系中基因组DNA 1μL替换为上述样品 C1-C11，其他反应条件不变，进行LAMP检测，结果如图5A中1-11所示，其中标号 1-4的样品的检测结果为蓝色，编号5-11的样品的检测结果为紫色。并将样品C1-C11 按照He T,Wang R,Liu D,etal.Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes inanimals and humans[J].Nature microbiology,2019: 1中的方法进行PCR检测，结果如图5中B所示。图5表明，本发明的引物组合可以检测出样品C4的浓度的替加环素耐药基因tet(X3)，但是使用PCR方法仅能检测样品 C3的浓度的替加环素耐药基因tet(X3)，表明本发明的方法对替加环素耐药基因tet(X3) 的检测的灵敏度更高。
4.替加环素耐药基因tet(X4)的灵敏度测试
取含有替加环素耐药基因tet(X4)的待测菌株，按照实施例2中的方法和反应体系进行替加环素耐药基因tet(X4)的LAMP检测，检测结果为蓝色，如图6A中1所示。
分别将实施例2中的反应体系中的待测物的基因组DNA作为样品D1，并对其进行10倍系列稀释，分别得到替加环素耐药基因tet(X4)含量的不同稀释倍数的稀释液作为样品D2-D11。将实施例2中的反应体系中基因组DNA 1μL替换为上述样品 D1-D11，其他反应条件不变，进行LAMP检测，结果如图6中A中1-11所示，其中标号1-4的样品的检测结果为蓝色，编号5-11的样品的检测结果为紫色。并将样品 D1-D11使用按照He T,Wang R,Liu D,etal.Emergence of plasmid-mediated high-level tigecycline resistance genes inanimals and humans[J].Nature microbiology,2019:1中的方法进行PCR检测，结果如图6中B所示。图6表明，本发明的引物组合可以检测出样品D3的浓度的替加环素耐药基因tet(X4)，但是使用PCR 方法仅能检测样品D2的浓度的替加环素耐药基因tet(X4)，表明本发明的方法对替加环素耐药基因tet(X4)的检测的灵敏度更高。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 用于检测替加环素高水平耐药基因tet(X)及其变体的LAMP引物和方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaaag cgggattgt 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 1167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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gattttcttc tgaaagaatt ttccgattgg gacgaacgct acaaagaatt gattcatacg 840
acgttgtcat ttgtaggatt ggctacacgg atatttcctt tagaaaagcc ttggaaaagc 900
aagcgcccat tacccataac aatgattggg gatgccgcac atttgatgcc gccttttgca 960
gggcagggag taaatagtgg gttggtggat gccttgatat tgtctgataa tctagccgat 1020
ggaaaattta atagcattga agaggctgtt aaaaattatg aacagcaaat gtttatctat 1080
ggcaaagaag cacaagaaga atcaactcaa aacgaaattg aaatgtttaa acccgacttt 1140
acgtttcagc aattgttaaa tgtataa 1167
<210> 7
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcgaatag atacagacaa acaaatgaat ttacttagtg ataagaacgt tgcaataatt 60
ggtggtggac ccgttggact gactatggca aaattattac agcaaaacgg catagacgtt 120
tcagtttacg aaagagacaa cgaccgagag gcaagaattt ttggtggaac ccttgaccta 180
cacaaaggtt caggtcagga agcaatgaaa aaagcgggat tgttacaaac ttattatgac 240
ttagccttac caatgggtgt aaatattgct gatgaaaaag gcaatatttt atccacaaaa 300
aatgtaaagc ccgaaaatcg atttgacaat cctgaaataa acagaaatga cttaagggct 360
atcttgttga atagtttaga aaacgacacg gttatttggg atagaaaact tgttatgctt 420
gaacctggta agaagaagtg gacactaact tttgagaata aaccgagtga aacagcagat 480
ttggttattc ttgccaatgg tggaatgtcg aaaataagga gctttgttac cgacacgcaa 540
gttgaagaaa ccggtacttt caacatccaa gctgatattc ttcaaccgga aataaactgt 600
cccggatttt ttcagctatg caacggcaac cgattaatgg cgggacatca gggcatttta 660
ttgtttgcca atcccaataa taatggtgca ttgtatttag gaattagttt taaaacgccc 720
gatgaatgga aaaataaaat tcccttagat tttcaggaca gaaacagcgt tgccgatttt 780
ttattgaaaa gattttccaa atggagtgaa gtttacaaac aattaatacg ttcggtatca 840
acatttcaat gcttgcccac aaggaaattt cctttgaaca atgattggaa aagtaaccgt 900
ccattaccca taacaatgat tggcgatgct gctcatttga tgtcgccttt tgcaggacag 960
ggtgtaaata cgggattatt ggatgctttg atattgtctg aaaaccttac aaacggagaa 1020
tttacaagta ttgaaaatgc catcgaaaac tacgaacaac aaatgtttgt ttatgcaaaa 1080
gatacgcagg acgaatcgac agaaaacgaa accgaaatgt ttagtcccaa tttttcgttt 1140
caaaaattat tgaatctata a 1161
<210> 8
<211> 1158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgagcaata aagaaaaaca aatgaattta cttagtgata agaacgttgc aataattggt 60
ggtggacccg ttggactgac tatggcaaaa ttattacagc aaaacggcat agacgtttca 120
gtttacgaaa gagacaacga ccgagaggca agaatttttg gtggaaccct tgacctacac 180
aaaggttcag gtcaggaagc aatgaaaaaa gcgggattgt tacaaactta ttatgactta 240
gccttaccaa tgggtgtaaa tattgctgat gaaaaaggca atattttatc cacaaaaaat 300
gtaaagcccg aaaatcgatt tgacaatcct gaaataaaca gaaatgactt aagggctatc 360
ttgttgaata gtttagaaaa cgacacggtt atttgggata gaaaacttgt tatgcttgaa 420
cctggtaaga agaagtggac actaactttt gagaataaac cgagtgaaac agcagatctg 480
gttattattg ccaatggtgg aatgtctaaa gtaagaaaat ttgttaccga cacggaagtt 540
gaagaaacag gtactttcaa tatacaagcc gatattcatc atccagaggt gaactgtcct 600
ggattttttc agctatgcaa tggaaaccgg ctaatggctg ctcatcaagg taatttatta 660
tttgcgaatc ctaataataa tggtgcattg cattttggaa taagttttaa aacacctgat 720
gaatggaaaa accaaacgca ggtagatttt caaaacagaa atagtgtcgt tgattttctt 780
ctgaaagaat tttccgattg ggacgaacgc tacaaagaac tgattcgtgt gacatcatct 840
tttgtagggt tagcgacacg aatatttccc ttaggtaagt cttggaaaag taagcgtcca 900
ttacccataa cgatgattgg agatgctgct catttgatgc ctccttttgc aggacaaggc 960
gtaaacagcg ggttgatgga tgccttgata ttgtcggata atctgaccaa tgggaaattt 1020
aacagcattg aagaggctat tgaaaattat gaacagcaaa tgtttatcta tggcaaagaa 1080
gcacaagaag aatcaactca aaacgaaatt gaaatgttta aacccgactt tacgtttcag 1140
caattgttaa atgtataa 1158

Claims (9)

1.鉴定或辅助鉴定替加环素耐药基因的成套引物，由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA和名称为BIP的单链DNA组成；
所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA；
所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA；
所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA；
所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的DNA。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，所述替加环素耐药基因为tet(X)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)中的至少一种。
3.鉴定或辅助鉴定替加环素耐药基因的试剂，含有权利要求1所述成套引物与M；所述M为DNA聚合酶、反应缓冲液、甜菜碱、dNTP、Mg2+和/或羟基萘酚蓝。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的试剂，所述替加环素耐药基因为tet(X)、tet(X2)、tet(X3)和tet(X4)中的至少一种。
6.权利要求1或2所述成套引物的制备方法，包括将权利要求1中所述FIP、所述BIP、所述F3和所述B3分别单独包装的步骤。
7.权利要求3-5任一所述试剂的制备方法，包括将权利要求1中所述FIP、所述BIP、所述F3和所述B3分别单独包装的步骤。
8.权利要求1或2所述成套引物在制备鉴定或辅助鉴定替加环素耐药基因试剂或试剂盒中的应用。
9.权利要求1或2所述成套引物或权利要求3-5中任一所述试剂在鉴定或辅助替加环素耐药基因中的应用。
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