CN114891902A - 一种基于液滴数字pcr快速检测五种烈性病原菌的引物探针组合及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于液滴数字PCR快速检测五种烈性病原菌的引物探针组合及其应用方法。所述引物探针组合包括五对引物对和相应的六条探针；其中一种病原菌采用两条不同荧光标记的探针检测，另外四种病原菌分别用一条单色荧光标记的探针检测，即可在数字PCR二维散点图上分析五种不同靶标烈性细菌基因的扩增情况。实验证明，所述引物探针组合能够特异性地扩增与检测鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原体，实现五靶标联检，而各引物对之间不会发生交叉反应，而且对于每种靶标都具有较高的检测灵敏度；同时，五靶标联检能够有效减少样本用量、缩短检测时间，从而有效提升烈性病原体的检测效率。

Description

一种基于液滴数字PCR快速检测五种烈性病原菌的引物探针 组合及其应用方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种基于液滴数字PCR快速检测五种烈性病原菌的引物探针组合及其应用方法。
背景技术
近年来，有关人感染鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis，以下简称“鼠疫菌”)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis，以下简称“炭疽菌”)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei，以下简称“类鼻疽菌”)和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis，以下简称“土拉菌”)等高致病烈性病原体的事件时有发生和报道，对公众健康和社会稳定造成了很大威胁。另一方面，这些烈性病原体也被国际公认为经典的生物战剂和生物恐怖剂，具有引发重大生物安全事件的潜在威胁。快速准确检测样本中的病原体，是传染病诊治以及生物安全事件应对的重要一步。目前，应用于烈性病原体的快速检测方法主要是基于核酸检测的荧光定量PCR法。该方法虽然能够较为灵敏和快速的检测病原体，但是在多靶标检测、样品耐受性、以及痕量检测方面仍存在一些不足。液滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是目前新一代的核酸检测技术，相较于传统的荧光定量PCR，数字PCR表现出更高的检测灵敏度、更好的样品耐受性，并且能够对靶标基因进行准确定量计数，已经成功应用于肿瘤基因检测和遗传疾病诊断等领域。然而，目前仍未有针对病原微生物，尤其是鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻菌和土拉菌等烈性病原体的ddPCR多重快速检测方法与检测试剂。其中主要原因之一是当前大部分的ddPCR仪器为双荧光通道，仅能够同时检测两个不同的靶标，在需要检测三个或更多细菌靶标时，多重检测能力受到限制。
因此，提供一种基于液滴数字PCR快速检测鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原菌的引物探针组合及其应用方法对本领域而言具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何利用双荧光通道数字PCR同时快速检测鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原菌。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了基于液滴数字PCR检测或辅助检测病原菌的组合物，所述组合物可由多重PCR引物对和探针组合物组成。
所述多重PCR引物对和探针组合物可由五对引物对和六条探针组成。所述六条探针的每个探针的核苷酸序列的5’端核苷酸上标记荧光基团，所述探针序列的3’端核苷酸上标记(荧光)淬灭基团。
上文所述病原菌可为鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和土拉弗朗西斯菌。所述五对引物对可分别特异结合于所述五种病原菌的基因组。所述五对引物对中的一对引物对能特异结合于所述五种病原菌中的一种病原菌的基因组。所述六条探针的两条探针可特异结合于所述五种病原菌中的一种病原菌。所述两条探针的名称可为探针A-T1和探针A-T2。所述六条探针的其余四条探针可分别特异结合于所述五种病原菌中的其余四种病原菌的基因组。所述其余四条探针中的一条探针能特异结合于所述其余四种病原菌中一种病原菌的基因组。所述探针A-T1和探针A-T2的5’端核苷酸上标记有不同的荧光基团。
上述组合物中，所述六条探针可均为双标记探针：所述探针的5’端可标记荧光基团，所述荧光基团可为FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5。所述探针的3’端可标记(荧光)淬灭基团，所述(荧光)淬灭基团可为TAMARA、MGB、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。
所述六条探针中的探针A-T1和探针A-T2可为炭疽芽孢杆菌的检测探针。所述其余四条探针可分别为鼠疫耶尔森氏菌的检测探针、布鲁氏菌的检测探针、类鼻疽伯克霍尔德菌的检测探针和土拉弗朗西斯菌的检测探针。
所述鼠疫耶尔森氏菌的检测探针和所述类鼻疽伯克霍尔德菌的检测探针的5’端均可修饰荧光基团FAM基团，3’端均可修饰淬灭基团为BHQ-1。所述布鲁氏菌的检测探针和所述土拉弗朗西斯菌的检测探针的5’端均可修饰荧光基团HEX基团，3’端均可修饰淬灭基团为BHQ-1。所述探针A-T1和探针A-T2的3’端均可修饰淬灭基团BHQ-1。所述探针A-T1和探针A-T2中的一条检测探针5’端可修饰荧光基团FAM基团，另外一条检测探针的5’端可修饰荧光基团HEX基团。
上述组合物中，所述探针A-T1和探针A-T2的摩尔比可为1～1.5：1.5～1。所述探针A-T1和探针A-T2的摩尔比具体可为1:1。
上述组合物中，所述五对引物对可分别为引物对A、引物对B、引物对C、引物对D和引物对E。所述六条探针可分别为所述探针A-T1和A-T2、探针B-T、探针C-T、探针D-T和探针E-T。所述引物对A和所述探针A-T1和A-T2可用于检测炭疽芽孢杆菌；所述引物对B和所述探针B-T可用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌。所述引物对C和所述探针C-T可用于检测鼠疫耶尔森氏菌。所述引物对D和所述探针D-T可用于检测布鲁氏菌。所述引物对E和所述探针E-T可用于检测土拉弗朗西斯菌。
所述引物对A可为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。所述引物对B可为由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单链DNA组成的引物对。所述引物对C可为由序列表中序列5所示的单链DNA和序列6所示的单链DNA组成的引物对。所述引物对D可为由序列表中序列7所示的单链DNA和序列8所示的单链DNA组成的引物对。所述引物对E可为由序列表中序列9所示的单链DNA和序列10所示的单链DNA组成的引物对。
所述探针A-T1的核苷酸序列可为序列表中序列11。所述探针A-T2的核苷酸序列可为序列表中序列12。所述探针B-T的核苷酸序列可为序列表中序列13。所述探针C-T的核苷酸序列可为序列表中序列14。所述探针D-T的核苷酸序列可为序列表中序列15。所述探针E-T的核苷酸序列可为序列表中序列16。
上述组合物中，所述引物对A、引物对B、引物对C、引物对D和引物对E的摩尔比可为1:1:1:1:1。所述探针A-T1、探针A-T2、探针B-T、探针C-T、探针D-T和探针E-T的摩尔比可为1～1.5:1.5～1:1:2:2:3，具体可为1:1:1:2:2:3。
上文所述序列11的第1位核苷酸可修饰FAM荧光基团，第28位核苷酸可修饰BHQ-1淬灭基团。所述序列12的第1位核苷酸修饰HEX荧光基团，第28位核苷酸修饰BHQ-1淬灭基团。所述序列13的第1位核苷酸可修饰FAM荧光基团，第21位核苷酸修饰BHQ-1淬灭基团。所述序列14的第1位核苷酸可修饰FAM荧光基团，第22位核苷酸可修饰BHQ-1淬灭基团。所述序列15的第1位核苷酸修饰HEX荧光基团，第24位核苷酸可修饰BHQ-1淬灭基团。所述序列16的第1位核苷酸可修饰HEX荧光基团，第24位核苷酸可修饰BHQ-1淬灭基团。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定病原菌的试剂和/或试剂盒。所述试剂和/或试剂盒可含有上文所述的组合物。
所述病原菌可为炭疽芽孢杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏菌和/或土拉弗朗西斯菌。
上述试剂和/或试剂盒中，所述引物对的工作浓度可为700～1100nM。所述引物对的工作浓度具体可为900nM。
上述试剂和/或试剂盒中，所述探针的工作浓度可为如下：检测所述炭疽菌的所述探针的工作浓度可为400～900nM，具体可为500nM。检测所述类鼻疽菌的所述探针的工作浓度可为200～300nM，具体可为250nM。检测所述鼠疫菌的所述探针的工作浓度为400～600nM，具体可为500nM。检测所述布鲁氏菌的所述探针的工作浓度可为400～600nM，具体可为500nM。检测所述土拉菌的所述探针的工作浓度可为600～900nM，具体可为750nM。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定病原菌的系统。所述系统可含上文所述的试剂和/或试剂盒。
上述系统还可含有数字PCR系统。所述数字PCR系统可为荧光通道数量大于等于2的数字PCR系统。所述数字PCR系统具体可为Bio-Rad QX200 Droplet Reader数字PCR系统。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测病原菌的方法。所述方法可包括用上文所述的组合物，或上文所述的试剂或试剂盒或上文所述的系统对待测样品进行液滴数字PCR，根据液滴数字PCR产物确定或辅助确定待测样品是否为所述病原菌或，是否含有所述病原菌或，是否感染所述病原菌，所述病原菌可为炭疽芽孢杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏菌和/或土拉弗朗西斯菌。
上述方法中，所述液滴数字PCR中采用的PCR体系中所述引物对A、引物对B、引物对C、引物对D和引物对E的摩尔比可为1:1:1:1:1。所述探针A-T1、探针A-T2、探针B-T、探针C-T、探针D-T和探针E-T的摩尔比可为1～1.5:1.5～1:1:2:2:3，具体可为1:1:1:2:2:3。
上述方法中，所述引物对的工作浓度可为700～1100nM。所述引物对的工作浓度具体可为900nM。所述探针的工作浓度可为如下：检测所述炭疽菌的所述探针的工作浓度可为400～900nM，具体可为500nM。检测所述类鼻疽菌的所述探针的工作浓度可为200～300nM，具体可为250nM。检测所述鼠疫菌的所述探针的工作浓度为400～600nM，具体可为500nM。检测所述布鲁氏菌的所述探针的工作浓度可为400～600nM，具体可为500nM。检测所述土拉菌的所述探针的工作浓度可为600～900nM，具体可为750nM。
上文所述的组合物在制备检测或辅助检测炭疽芽孢杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏菌和/或土拉弗朗西斯菌产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。所述待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品(如土壤)、食品(如冷冻食品或新鲜食品)。
上文所述液滴数字PCR扩增中的退火温度可为55～63℃，如60℃。
所述液滴数字PCR采用的扩增反应条件可为：94～98℃预变性8～12min，94～95℃变性30～40s，55～63℃60～90s下进行35～40个循环。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种能够基于液滴数字PCR快速检测鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原菌的引物探针组合。所述引物探针组合包括五对引物对和相应的六条探针；其中一个靶标采用了两条不同荧光标记的探针进行检测，另外四个靶标分别用一条单色荧光标记的探针进行检测；该引物探针组合仅采用两种荧光标记(如FAM和HEX)，即可在数字PCR二维散点图上分析五种不同靶标烈性细菌基因的扩增情况。
(2)本发明中提供的利用所述引物探针组合进行以上五种烈性病原菌检测的方法，各引物对之间不会发生交叉反应。
本命发明实施例中实验证明，当所述引物对的摩尔比为1:1:1:1:1，所述探针的摩尔比为1:1:1:2:2:3时，所述引物探针组合能够特异性地扩增与检测炭疽菌、类鼻疽菌、鼠疫菌、布鲁氏菌和/或土拉菌五种烈性病原体，实现五靶标联检，而各引物对之间不会发生交叉反应，而且对于每种靶标都具有较高的检测灵敏度；同时，五靶标联检能够有效减少样本用量、缩短检测时间，从而有效提升检测效率。
附图说明
图1为五重ddPCR检测得到的液滴分布图。(A)为最佳探针工作浓度下的五重ddPCR检测得到的液滴分布图；(B)为ddPCR反应体系中鼠疫菌和土拉菌检测探针终浓度调整后检测得到的液滴分布图；(C)为ddPCR反应体系中炭疽菌两条检测探针浓度比例调整后检测得到的液滴分布图。
图2为多重ddPCR检测灵敏度。(A)代表不同浓度鼠疫菌ddPCR检测结果；(B)代表不同浓度类鼻疽菌ddPCR检测结果；(C)代表不同浓度布鲁氏菌ddPCR检测结果；(D)代表不同浓度土拉菌ddPCR检测结果；(E)代表不同浓度炭疽菌ddPCR检测结果。横坐标为细菌浓度的对数值Log(CFU/mL)，纵坐标为拷贝数/反应的对数值Log(Copies/reaction)，LOB为阴性对照(空白检测限)。
图3为单重实时荧光PCR检测灵敏度。(A)代表不同浓度鼠疫菌扩增曲线，(B)代表不同浓度类鼻疽菌扩增曲线，(C)代表不同浓度炭疽菌扩增曲线，(D)代表不同浓度布鲁氏菌扩增曲线，(E)代表不同浓度土拉菌扩增曲线，NTC代表阴性对照。横坐标为荧光PCR循环值Cycles，纵坐标为相对荧光强度RFU。
图4为多重ddPCR检测特异性结果的液滴分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)为本实验室保存，相关文献：Hua F,Zhang P,Zhang F,et.al.Development andevaluation of an up-converting phosphor technology-based lateral flow assayfor rapid detection of Francisella tularensis.Sci Rep.2015Nov 26；5:17178.
布鲁氏菌(Brucella spp.)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)为本实验室保存，相关文献：Zhang P,LiuX,Wang C,et.al.Evaluation of up-converting phosphor technology-based lateralflow strips for rapid detection of Bacillus anthracis Spore,Brucella spp.,andYersinia pestis.PLoS One.2014Aug 21；9(8):e105305.doi:10.1371/journal.pone.0105305.
本发明实施例中假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、痢疾杆菌和大肠埃希菌七种病原菌的来源如下：
假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)和大肠埃希菌(Escherichia coli O157:H7)为本实验室保存，相关文献：Zhang P,Liu X,Wang C,et.al.Evaluation of up-converting phosphortechnology-based lateral flow strips for rapid detection of Bacillusanthracis Spore,Brucella spp.,and Yersinia pestis.PLoS One.2014Aug 21；9(8):e105305.doi:10.1371/journal.pone.0105305.
痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)为本实验室保存，相关文献：Hua F,Zhang P,Zhang F,et.al.Development and evaluation of an up-converting phosphortechnology-based lateral flow assay for rapid detection of Francisellatularensis.Sci Rep.2015Nov 26；5:17178.
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为本实验室保存，相关文献：Zhao Y,Li Y,Zhang P,et.al.Cell-based fluorescent microsphere incorporated withcarbon dots as a sensitive immunosensor for the rapid detection ofEscherichia coli O157 in milk.Biosens Bioelectron.2021May 1；179:113057.doi:10.1016/j.bios.2021.113057.Epub 2021Feb 2.
实施例1、基于液滴数字PCR快速检测五种烈性病原菌的方法的建立
1.1引物设计与探针合成
根据文献检索，得到鼠疫菌、炭疽菌和土拉菌这三种病原体的染色体特异基因的扩增引物对和检测探针；布鲁氏菌、类鼻疽菌两种菌，根据其染色体特异基因，由PrimerExpress 3.0软件序列设计得到相应的扩增引物对和检测探针，具体如表1所示。
表1.用于检测五种烈性病原体的引物和探针序列
Figure BDA0003603247770000061
Figure BDA0003603247770000071
所用引物及探针均由上海生工生物科技有限公司合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化。所用荧光探针均为双标记探针：5’端标记荧光基团；3’端标记淬灭基团。
五种病原菌中一种病原菌采用了两条不同荧光标记的探针进行检测，另外四种病原菌分别用一条单色荧光标记的探针进行检测。其中，炭疽菌采用两条荧光探针检测，其中一条5’端修饰荧光基团FAM基团，另外一条5’端修饰荧光基团HEX基团，3’端淬灭基团均为BHQ-1(即序列表中序列11的第1位核苷酸修饰FAM荧光基团、第28位核苷酸修饰BHQ-1淬灭基团，序列12的第1位核苷酸修饰HEX荧光基团、第28位核苷酸修饰BHQ-1淬灭基团)；类鼻疽菌和鼠疫菌的检测探针5’端修饰荧光基团FAM基团，3’端淬灭基团为BHQ-1(即序列13的第1位核苷酸修饰FAM荧光基团、第21位核苷酸修饰BHQ-1淬灭基团，序列表中序列14的第1位核苷酸修饰FAM荧光基团、第22位核苷酸修饰BHQ-1淬灭基团)；布鲁氏菌和土拉菌的检测探针5’端修饰荧光基团HEX基团，3’端淬灭基团为BHQ-1(即序列表中序列15的第1位核苷酸修饰HEX荧光基团、第24位核苷酸修饰BHQ-1淬灭基团，序列16的第1位核苷酸修饰HEX荧光基团、第24位核苷酸修饰BHQ-1淬灭基团)。
1.2细菌基因组模板制备
将过夜培养的鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种菌菌株的细菌培养物灭活后，利用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen 51304)分别提取DNA，最终用100μL TEbuffer洗脱得到五种菌的DNA。
1.3ddPCR反应体系配制
ddPCR反应体系总体积为20μL，其中待检样本DNA2μL，不足体积由超纯水补齐，具体反应体系与成分浓度如表2所示：
表2.ddPCR反应体系主要组分终浓度
ddPCR组分 终浓度(20μL)
ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)(Bio-Rad) 2×
五对靶标扩增引物 900nM(每条引物)
鼠疫菌探针(5’FAM，3’BHQ-1) 500nM
类鼻疽菌探针(5’FAM，3’BHQ-1) 250nM
炭疽菌探针-1(5’FAM，3’BHQ-1) 250nM
炭疽菌探针-2(5’HEX，3’BHQ-1) 250nM
布鲁氏菌探针(5’HEX，3’BHQ-1) 500nM
土拉菌探针(5’HEX，3’BHQ-1) 750nM
1.4液滴生成
将步骤1.3配制好的ddPCR扩增体系混匀后，加入液滴发生器(Bio-RadQX200Droplet)的样品孔中，并在油孔中加入70μL微滴生成油，覆盖垫圈，放入液滴发生器中制备微滴；
1.5PCR扩增
转移40μL微滴至96孔PCR板，封膜后于Bio-Rad T100 PCR仪进行多重ddPCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性10min，95℃30sec，60℃1min，40个循环；
1.6结果判读
扩增完成后，将PCR反应板转移至Bio-Rad QX200 Droplet Reader，按照仪器和软件操作说明进行微滴计数及荧光信号检测；同时，利用QuantaSoft Analysis Proversion1.0.596软件对液滴进行分类与计数；最后，利用二维散点图分别对所述五种靶标菌检测生成的液滴团簇进行定位与划分，如图1中(A)所示，五种靶标菌检测结果能够很好的区分开，不会互相影响。
实施例2、ddPCR反应体系中鼠疫菌和土拉菌检测探针终浓度的调整检测
采用实施例1中建立的基于液滴数字PCR快速检测方法检测鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原菌，其中与实施例1的区别在于：本实施例中，将ddPCR反应体系中的鼠疫菌检测探针终浓度由500nM调节为350nM，将土拉菌的检测探针终浓度由750nM调节为600nM，其余步骤均与实施例1保持一致。
所得二维散点图结果如图1中(B)所示，类鼻疽和鼠疫菌的液滴团簇难以区分开，土拉菌和布鲁氏菌的液滴团簇也不能清晰地区分。
因此，对ddPCR反应体系中鼠疫菌和土拉菌检测探针终浓度进行调整后，实施例1中建立的基于液滴数字PCR快速检测方法将无法清晰的辨识鼠疫菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌这四种靶标菌。
实施例3、ddPCR反应体系中炭疽菌检测探针终浓度的调整检测
采用实施例1中建立的基于液滴数字PCR快速检测方法检测鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原菌，其中与实施例1的区别在于：本实施例中，炭疽菌的两条检测探针浓度调整为：炭疽菌探针-1(5’FAM，3’BHQ-1)由250nM调整为150nM，炭疽菌探针-2(5’HEX，3’BHQ-1)由250nM调整为350nM，即ddPCR反应体系中两条探针的浓度比例由1：1调整为3：7，但两条探针总浓度(500nM)不变；其余步骤均与实施例1保持一致。
所得二维散点图结果如图1中(C)所示，更改炭疽菌的两条检测探针在ddPCR反应体系中的工作浓度比例后，炭疽菌与布鲁氏菌(图1的(C)中的布氏菌)的液滴团簇不能清晰地区分开，其检测结果无法清晰辨识这两种菌。
实施例4、灵敏度试验
将过夜培养的鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种菌菌株的细菌培养物灭活后，用生理盐水10倍梯度稀释得到101～108CFU/mL的不同浓度的菌悬液；分别取1mL五种菌的菌悬液加入至0.25g土壤，室温放置12h，分别得到五种菌的模拟土壤样本共40份(每种靶标菌各8份)；另取1mL生理盐水与0.25g土壤混合，室温放置12h，作为阴性对照样本。
五种菌的模拟土壤样品以及阴性对照样本均使用土壤基因组DNA提取试剂盒(TIANGENTM)提取目的细菌DNA，用100μL TE buffer洗脱。使用实施例1中的基于液滴数字PCR多重检测方法进行ddPCR体系灵敏度评价实验和模拟样本试验，并以传统的单重实时荧光PCR方法作为对照进行比较评价。
每种靶标菌对应的单重实时荧光PCR方法所用引物和探针与ddPCR所用引物和探针序列保持一致(表1)，检测探针均5’端修饰荧光基团FAM基团，3’端修饰BHQ-1基团。
五种靶标菌单重实时荧光PCR反应体系均为20μL体系，其中待检样本DNA2μL，不足体积由超纯水补齐，具体组分与浓度如表3所示：
表3.单靶标实时荧光PCR反应体系的配制
单重实时荧光PCR主要组分 终浓度
iTaq Universal Probes Supermix(Bio-Rad) 2×
扩增引物 400nM(每条引物)
检测探针 200nM
实时荧光PCR实验在Bio-Rad CFX Opus 96实时荧光仪上进行，采用FAM荧光信号通道检测。反应条件：95℃初始变性5min，95℃变性10s，60℃退火(采集荧光)40个循环。
多重ddPCR检测结果如图2所示，实施例1中建立的多重ddPCR检测模拟土壤样本中的鼠疫菌、类鼻疽菌、布鲁氏菌和土拉菌的最低检测浓度均为101CFU/mL(图2的(A)-(D))，炭疽菌的最低检测浓度为103CFU/mL(图2的(E))。
单重实时荧光PCR检测结果如图3所示，鼠疫菌、类鼻疽菌和炭疽菌的最低检出浓度为104CFU/mL(图3的(A)-(C))，布鲁氏菌和土拉菌的最低检出浓度为103CFU/mL(图3的(D)和(E))。
整体而言，实施例1中建立的五种靶标细菌多重ddPCR反应的最低检测浓度要比单重实时荧光PCR低10～1000倍，说明本发明所建立的多重ddPCR检测体系相较于传统的实时荧光PCR方法具有明显的检测灵敏度优势。
实施例5、特异性试验
采用实施例1中建立的基于液滴数字PCR快速检测方法检测鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原菌，其中与实施例1的区别在于，本实施例中，选取五种靶标菌以外的七种常见病原菌(包括：假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、痢疾杆菌和大肠埃希菌)进行特异性实验检测。具体步骤为：在过夜培养十二种病原菌并灭活后，利用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen 51304)提取十二种病原菌细菌的DNA，最终用100μL TE buffer洗脱，并用Nanodrop仪器测定DNA浓度。将所得DNA作为ddPCR反应体系模板，使用实施例1表2的多重ddPCR体系进行ddPCR体系特异性评价。
所得二维散点图结果如图4所示，假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、痢疾杆菌和大肠埃希菌七种菌所产生的液滴团簇均不能与阴性液滴对照团簇区分，判定七种菌所产生的液滴团簇为ddPCR阴性，因此，实施例1中建立的基于液滴数字PCR快速检测方法对于鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原菌的检测具有很好的特异性。
实施例6、模拟土壤样本试验
将过夜培养的鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种菌菌株的细菌培养物灭活后，制备15份细菌菌液样本，具体为：随机选取两种靶标细菌菌液进行混合，制备得到3份双靶标混合菌液样本；随机选取三种靶标菌液进行混合，制备得到2份三靶标混合菌液样本；单一靶标菌液样本5份(每种靶标菌各1份)；阴性对照样本(生理盐水)5份。共计15份待检测样本，除阴性对照样本外，其余每种细菌的终浓度均为103CFU/mL。
将15份待检测样本，分别取1mL样本液加入至0.25g土壤，室温放置12h，得到15份模拟土壤样本。模拟土壤样品均使用土壤基因组DNA提取试剂盒(TIANGENTM)提取目的细菌DNA，用100μL TE buffer洗脱。使用实施例1中的基于液滴数字PCR多重检测方法进行土壤模拟样本试验。
结果如表4所示，实施例1中建立的基于液滴数字PCR多重检测方法能够准确检测出15份模拟土壤样本中的10份阳性模拟样本(10/10,100％)；并且，该方法也可准确检出其中的3份双靶标混合菌液样本和2份三靶标混合菌液样本。因此，实施例1中建立的基于液滴数字PCR多重检测方法可用于土壤样本中鼠疫菌、炭疽菌、布鲁氏菌、类鼻疽菌和土拉菌五种烈性病原菌的同步筛查。
表4.数字PCR多重检测体系对15份模拟土壤样本检测结果(拷贝数/反应)
Figure BDA0003603247770000111
注：“√”表示样本设计中存在该靶标细菌，检测结果与实际情况一致。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种基于液滴数字PCR快速检测五种烈性病原菌的引物探针组合及其应用方
法
<130> GNCSQ220044
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
gggtgtaatg tgaagtaact cgcta 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
aaaccgctgt aagaatggaa ttacg 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
cgatctcgtc aaggtgtcgg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
ttgacctgga tggcaaagaa g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
ggacggcatc acgattctct 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
cctgaaaact tggcagcagt t 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
tcagggcggt gatttgaac 19
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
gcgcgcctcg ttgatc 16
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
gcagggcgag caccatt 17
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
atcttgcatg gtcaccactt ga 22
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
cgttgtaaca tcggcttaga gaaccaca 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
cgttgtaaca tcggcttaga gaaccaca 28
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
ttgcctcagt cacgcgcacg t 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
ccctcgaatc gctggccaac tg 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
tggtcaatga taatccctcc gccg 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
cgatatttgc ctgttagcac tcct 24

Claims (9)

1.基于液滴数字PCR检测或辅助检测病原菌的组合物，所述组合物由多重PCR引物对和探针组合物组成；
所述多重PCR引物对和探针组合物由五对引物对和六条探针组成，所述六条探针的每个探针的核苷酸序列的5’端核苷酸上标记荧光基团，所述探针序列的3’端核苷酸上标记淬灭基团；
所述病原菌为鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和土拉弗朗西斯菌；所述五对引物对分别能特异结合于所述五种病原菌的基因组，所述五对引物对中的一对引物对能特异结合于所述五种病原菌中的一种病原菌的基因组；所述六条探针的两条探针能特异结合于所述五种病原菌中的一种病原菌，所述两条探针的名称为探针A-T1和探针A-T2；所述六条探针的其余四条探针分别能特异结合于所述五种病原菌其余四种病原菌的基因组，所述其余四条探针中的一条探针能特异结合于所述其余四种病原菌中一种病原菌的基因组；所述探针A-T1和探针A-T2的5’端核苷酸上标记有不同的荧光基团。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述探针A-T1和探针A-T2的摩尔比为1～1.5：1.5～1。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述五对引物对为引物对A、引物对B、引物对C、引物对D和引物对E；所述六条探针为所述探针A-T1和A-T2、探针B-T、探针C-T、探针D-T和探针E-T；所述引物对A和所述探针A-T1和A-T2用于检测炭疽芽孢杆菌；所述引物对B和所述探针B-T用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌；所述引物对C和所述探针C-T用于检测鼠疫耶尔森氏菌；所述引物对D和所述探针D-T用于检测布鲁氏菌；所述引物对E和所述探针E-T用于检测土拉弗朗西斯菌；
所述引物对A为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对B为由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对C为由序列表中序列5所示的单链DNA和序列6所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对D为由序列表中序列7所示的单链DNA和序列8所示的单链DNA组成的引物对；所述引物对E为由序列表中序列9所示的单链DNA和序列10所示的单链DNA组成的引物对；
所述探针A-T1的核苷酸序列为序列表中序列11；所述探针A-T2的核苷酸序列为序列表中序列12；所述探针B-T的核苷酸序列为序列表中序列13；所述探针C-T的核苷酸序列为序列表中序列14；所述探针D-T的核苷酸序列为序列表中序列15；所述探针E-T的核苷酸序列为序列表中序列16。
4.鉴定或辅助鉴定病原菌的试剂和/或试剂盒，其特征在于：所述试剂和/或试剂盒含有权利要求1-3中任一权利要求所述的组合物；
所述病原菌为鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和/或土拉弗朗西斯菌。
5.鉴定或辅助鉴定病原菌的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求4所述的试剂和/或试剂盒。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：所述系统还含有数字PCR系统。
7.检测或辅助检测病原菌的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求1-3中任一项所述的组合物，或权利要求4所述的试剂或试剂盒或权利要求5或6所述的系统对待测样品进行液滴数字PCR，根据液滴数字PCR产物确定或辅助确定待测样品是否为所述病原菌或，是否含有所述病原菌或，是否感染所述病原菌，所述病原菌为鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和/或土拉弗朗西斯菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述液滴数字PCR中采用的PCR体系中所述引物对A、引物对B、引物对C、引物对D和引物对E的摩尔比为1:1:1:1:1，所述探针A-T1、探针A-T2、探针B-T、探针C-T、探针D-T和探针E-T的摩尔比为1～1.5:1.5～1:1:2:2:3。
9.权利要求1-3中任一权利要求所述的组合物在制备检测或辅助检测鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和/或土拉弗朗西斯菌产品中的应用。
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