CN108707682A

CN108707682A - 一种用于检测沙门氏菌活性的荧光raa引物、探针及检测方法

Info

Publication number: CN108707682A
Application number: CN201810645361.XA
Authority: CN
Inventors: 周冬根; 罗洁; 应清界; 俞雪钧
Original assignee: NINGBO INTERNATIONAL TRAVEL SANITARY HEALTH-CARE CENTER
Current assignee: NINGBO INTERNATIONAL TRAVEL SANITARY HEALTH-CARE CENTER
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2018-10-26

Abstract

本发明提供了一种用于检测粪便样品中沙门氏菌的荧光RAA引物和探针及检测方法，该荧光RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测粪便样本中的沙门氏菌，能在39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；该荧光RAA引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

Description

一种用于检测沙门氏菌活性的荧光RAA引物、探针及检测方法

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种用于检测粪便样品中沙门氏菌活性的荧光RAA引物和探针及检测方法。

背景技术

沙门氏菌病又称副伤寒，是各种动物由沙门氏菌属细菌引起疾病的总称，也是公共卫生学上重要的人畜共患病之一，人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病情和死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况。1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。

沙门氏菌是一种寄生于人和动物肠道内的革兰氏阴性无芽孢杆菌，绝大多数有鞭毛并能运动，对营养要求不高，耐胆盐，对外界的抵抗力较强，在自然界中广泛存在。其血清型多，分布广泛，在肠菌科中是一种重要的人畜共患病原菌，是食品、水源及畜产品的重要污染源，可引起人食物中毒、急性肠胃炎和动物腹泻等疾病。沙门氏菌是最常见的食源性致病菌，也是食物传播病原菌中研究最活跃的细菌。在食物中毒中，由沙门氏菌引起的中毒病例，约占细菌性食物中毒的40％。由于绝大多数沙门氏菌对任何动物都有致病性，能引起人和多种动物的肠道感染，是污染禽肉、禽蛋等动物性食品的主要病原菌，常引起人食物中毒。

沙门氏菌作为食品检测的一项重要指标，在公共卫生、口岸检疫和畜牧兽医上有重要的意义。目前，沙门氏菌检测方法的包括传统的检测方法、免疫学检测以及分子生物学检测方法等。

传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到细菌的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于沙门氏菌的检测。目前，国内外已建立的沙门氏菌检测方法有实时PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。

发明内容

本发明目的是提供一种用于重组酶介导核酸扩增技术检测沙门氏菌活性的荧光RAA引物和荧光探针以及使用该荧光RAA引物和荧光探针对沙门氏菌活性的检测方法，该检测方法可以快速、定性检测粪便样本中的沙门氏菌活性。

本发明的一个目的是提供一种用于检测沙门氏菌的引物对，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述具有相同功能具体包括能用于检测或特异性扩增沙门氏菌基因组中的特异保守区域核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测沙门氏菌的探针，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5'-CTCKATTGTCACKGTGGTYCAGTTTATCGNTMTNACCAAAGGTTCA-3'，

其中，所述N代表任意核苷酸或任意修饰后的核苷酸，所述M代表具环状结构的化合物；

2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述N代表携带有荧光素基团FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸FAM-dT或携带有荧光淬灭基团BHQ的胸腺嘧啶脱氧核苷酸BHQ-dT，所述M代表四氢呋喃。

具体的，所述探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测沙门氏菌的组合物，所述组合物包括下述1)和2)：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针。

本发明的还一个目的是提供一种用于检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针；

3)本发明所述组合物。

具体的，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为21：21：6。

本发明的再一个目的是提供一种沙门氏菌的检测方法，所述检测方法不包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针；

3)本发明所述组合物。

具体的，所述检测方法还包括下述1)-2)中的至少一种：

1)当所述检测方法同时使用了所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为21：21：6；

2)提取待检测样品的DNA作为模板，进行RAA反应，所述RAA反应的反应温度包括37-39℃，再具体的，为39℃；反应时间包括20分钟以上。

本发明的又一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在检测沙门氏菌中的应用，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。

本发明的还一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在制备检测沙门氏菌相关产品中的应用。

本发明的有益效果包括：

本发明目的是提供一种用于重组酶介导核酸扩增技术检测沙门氏菌活性的荧光RAA引物和荧光探针以及该荧光RAA引物和荧光探针在检测沙门氏菌活性中的应用，该荧光RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测血清样本中的沙门氏菌活性。

本发明提供的荧光RAA引物和荧光探针，应用该荧光RAA引物和荧光探针检测沙门氏菌时，不依赖于昂贵的PCR仪器，且检测时间较PCR方法或荧光PC R显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至更高。

在RAA反应过程中，沙门氏菌DNA通过利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以DNA为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20分钟.此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。RAA技术不依赖于PCR仪器的便捷性能，且检测时间较PCR方法或荧光荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至更高，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。

本发明可以实现单管现场、快速检测沙门氏菌活性，与其它检测技术相比具有以下优点：

1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；

2、不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37-39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；

3、本发明提供的荧光RAA引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为灵敏度实验结果图。

图2为特异性实验结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于检测沙门氏菌的荧光RT-RAA引物、探针的设计

针对于沙门氏菌的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光RAA探针，其序列分别是：

正向引物，如序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列：

5'-ATTGGCGATAGCCTGGCRGTGGGTTTTGTTGTC-3'

反向引物，如序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列：

5'-TACCGGGCATACCATCCAGAGAAAAWCGDGCCGC-3'

寡核苷酸探针，如序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列：

5'-CTCKATTGTCACKGTGGTYCAGTTTATCG(FAM-dT)T(THF)T(BHQ-dT)ACCAAAG GTTCA-3'；

其中：

FAM-dT表示携带有荧光素基团FAM(6-Carboxyfluorescein)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；

THF表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)连接子；

BHQ-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ(black hole quencher)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；

序列表中SEQ ID №：1-SEQ ID №：3中：

R表示所述核苷酸序列中的碱基为A或G；

W表示所述核苷酸序列中的碱基为A、T或U；

D表示所述核苷酸序列中的碱基为A、G、T或U；

K表示所述核苷酸序列中的碱基为G、T或U；

Y表示所述核苷酸序列中的碱基为T、U或C。

实施例2、一种用于检测沙门氏菌的荧光RAA方法的建立

(一)荧光RAA反应

1)粪便样品中DNA的提取：所述粪便样品中DNA的提取可以采用DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

2)采用实施例1设计的正向引物、反向引物和探针，以及RAA反应试剂盒(本实施例具体采用了江苏奇天基因生物科技有限公司的RAA基础试剂盒)，以本实施例步骤1)提取的粪便样品中DNA为模板，进行扩增反应，其中反应体系如下：

25μl RAA反应缓冲液(江苏奇天基因生物科技有限公司RAA基础试剂盒提供)；

实施例1设计的正向引物、反向引物(10μM)各2.1μL；

0.6μL实施例1设计的探针(10μM)；

1μL步骤1)提取的粪便样品中DNA模板；

加16.5μL双蒸水至47.5μL，混合均匀，然后加入到有干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司RAA基础试剂盒提供，含RAA反应所需要的酶)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μL 280mM醋酸镁溶液并混匀。

(二)荧光检测

将上述反应管放置于RAA F-6100荧光基因检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)，在39℃反应20min，进行荧光检测。

阴性对照：FAM通道无扩增曲线，且无Tt值；

阳性对照：FAM通道有扩增曲线，Tt值均≤8min

上述对阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。

样品检测结果判读：

当所检测的样品FAM通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定沙门氏菌阳性；

当所检测的样品FAM通道无扩增曲线，且Tt值显示为Undet或No Tt，质量控制正常时，可判定沙门氏菌阴性。

(三)灵敏度实验

标准品DNA的制备：沙门氏菌标准菌株及分离菌株在BPW培养基中扩培4－8小时，加入DNA提取液加热100℃5min，进行分装备用，冻存于-80℃。

该实验验证该检测方法的最低检测限，采用浓度为1.0×10⁷copies/mL、1.0×10⁶copies/mL、1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、1.0×10³copies/mL、1.0×10²copies/mL的阳性标准品DNA作为检测限参比品，RAA荧光反应过程、反应体系(除模板DNA浓度不同，其它均相同)均与本实施例步骤(一)和(二)相同。

通过该实验表明该检测方法的检测限达到1.0×10²copies/mL，具体实验结果如图1所示。

图1中10⁷拷贝、10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝分别表示浓度为1.0×10⁷copies/mL、1.0×10⁶copies/mL、1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、1.0×10³copies/mL、1.0×10²copies/mL的阳性标准品DNA的扩增曲线，阴性为阴性对照，横坐标表示反应时间，纵坐标mV表示荧光值。图1所示结果表明，该检测方法的检测限达到100copies/mL。

(四)特异性实验

该实验选择从食品中分离鉴定的大肠杆菌、志贺氏菌作为特异性参考品，沙门氏菌标准菌株ATCC15611、从食品中分离鉴定的沙门氏菌株1430和349为实验组菌株，进行本发明提供的RAA反应，RAA荧光反应过程、反应体系(除模板DNA种类由不同参考品和实验组菌株提供外，其它均相同)均与本实施例步骤(一)和(二)相同。

特异性实验结果如图2所示。

图2中横坐标表示反应时间，纵坐标mV表示荧光值。图2所示结果表明，2种特异性参考品均未有扩增曲线，只有沙门氏菌实验组菌株检测出相应的特异性扩增曲线，无交叉反应，说明该检测方法的特异性良好。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 宁波国际旅行卫生保健中心

<120> 一种用于检测沙门氏菌活性的荧光RAA引物、探针及检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attggcgata gcctggcrgt gggttttgtt gtc 33

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taccgggcat accatccaga gaaaawcgdg ccgc 34

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n=FAM-dT

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> m=THF

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> n=BHQ-dT

<400> 3

ctckattgtc ackgtggtyc agtttatcgn tmtnaccaaa ggttca 46

Claims

1.一种用于检测沙门氏菌的引物对，其特征在于，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID№：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

2.一种用于检测沙门氏菌的探针，其特征在于，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5'-CTCKATTGTCACKGTGGTYCAGTTTATCGNTMTNACCAAAGGTTCA-3'，

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列。

4.一种用于检测沙门氏菌的组合物，其特征在于，所述组合物包括下述1)和2)：

1)权利要求1所述的引物对；

2)权利要求2或3任一所述的探针。

5.一种用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)权利要求1所述的引物对；

2)权利要求2或3任一所述的探针；

3)权利要求4所述组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为21：21：6。

7.一种沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述检测方法不包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：

1)权利要求1所述的引物对；

2)权利要求2或3任一所述的探针；

3)权利要求4所述组合物。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括下述1)-2)中的至少一种：

2)提取待检测样品的DNA作为模板，进行RAA反应，所述RAA反应的反应温度包括37-39℃；反应时间包括20分钟以上。

9.权利要求1所述引物对、权利要求2或3任一所述探针、权利要求4所述组合物、权利要求5-6任一所述试剂盒、权利要求7-8任一所述检测方法在检测沙门氏菌中的应用，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。

10.权利要求1所述引物对、权利要求2或3任一所述探针、权利要求4所述组合物、权利要求5-6任一所述试剂盒、权利要求7-8任一所述检测方法在制备检测沙门氏菌相关产品中的应用。