CN112410444A - 一种用于肺炎克雷伯菌荧光raa检测的引物和探针序列及其应用 - Google Patents

一种用于肺炎克雷伯菌荧光raa检测的引物和探针序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列，根据根据肺炎克雷伯菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间，可以实现单管现场、快速检测，具有特异性强、灵敏度高以及检测速度快的优势。

Description

一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其 应用
技术领域
本发明属于体外核酸检测领域，尤其是涉及一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用。
背景技术
肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上，存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，以上叶较为多见。肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，大小0.5～0.8×1～2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛。有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，在普通琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。肺炎克雷伯菌感染引起的病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。细菌具有荚膜，在肺泡内生长繁殖时，引起组织坏死、液化、形成单个或多发性脓肿。病变累及胸膜、心包时，可引起渗出性或脓性积液。病灶纤维组织增生活跃，易于机化；纤维素性胸腔积液可早期出现粘连。在院内感染的败血症中，克雷伯杆菌以及绿脓杆菌和沙雷氏菌等均为重要病原菌，病死率较高。肺炎克雷伯菌作为公共卫生监测的一项重要内容，在传染病防控以及口岸卫生检疫有重要的意义。
目前，肺炎克雷伯菌检测方法的包括传统的检测方法、免疫学检测以及分子生物学检测方法等。传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到细菌的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于肺炎克雷伯菌的检测。目前，国内外已建立的肺炎克雷伯菌检测方法有实时PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。RAA技术不依赖于PCR仪器的便捷性能，且检测时间较PCR方法或荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至高于，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。在RAA反应过程中，肺炎克雷伯菌DNA通过利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以DNA为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20分钟。此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。目前，国内外还没有公开用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其试剂盒的相关内容。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高以及检测速度快的用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列，根据肺炎克雷伯菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，引物序列具体如下：
正向引物为5'-TGGCCGGTTGCGTACAGGTTGATCGTTATGA-3'；
反向引物：5'-AGGGAAGCGGTCACGTTGTAGATCTCACTGTCAC-3'；寡核苷酸探针：
5'-CAAACGAAAGGGCCGCAGAGCGCGATGA(FAM-dT)G(THF)G(BHQ-dT)CCTGACGCCATTG-3'；其中：FAM：6-羧基荧光素；THF：四氢呋喃；BHQ：黑洞淬灭剂；phosphate：3’进行磷酸化以中止延伸。
上述用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列在制备肺炎克雷伯菌荧光RAA检测试剂盒中的应用。
上述肺炎克雷伯菌荧光RAA检测试剂盒，该试剂盒包括RAA反应体系如下：RAA反应缓冲液25μl；10μM的正向引物2.1μl、10μM的反向引物2.1μl；10μM的探针0.6μl；DNA模板2μl；加15.5μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉(含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP等，RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)货号：F00001,江苏奇天基因科技有限公司)的反应管中，再次混匀，最后各管加入2.5μl 280mM醋酸镁溶液并混匀。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；
2、不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；
3、探针法荧光RAA技术特有的优势，即特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
综上所述，本发明首次公开了用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用，可以实现单管现场、快速检测，具有特异性强、灵敏度高以及检测速度快的优势。
说明书附图
图1为肺炎克雷伯菌检测标准株、临床分离株。
图中阳性扩增曲线分别为检测肺炎克雷伯菌标准株ATCC700603、临床分离样本NBKP2019020以及阳性对照，阴性为阴性对照，横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值，通过该图可以说明该检测方法能够检测到细菌标准菌株
图2为肺炎克雷伯菌检测方法的特异性实验数据。
图中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值，这10种特异性标准菌株均未有扩增曲线，说明该检测方法的特异性良好。
具体实施方式
实施例1
针对于肺炎克雷伯菌的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光RAA探针：正向引物为5'-TGGCCGGTTGCGTACAGGTTGATCGTTATGA-3'；
反向引物：5'-AGGGAAGCGGTCACGTTGTAGATCTCACTGTCAC-3'；寡核苷酸探针：
5'-CAAACGAAAGGGCCGCAGAGCGCGATGA(FAM-dT)G(THF)G(BHQ-dT)CCTGACGCCATTG-3'；
其中：FAM：6-羧基荧光素；THF：四氢呋喃；BHQ：黑洞淬灭剂；phosphate：3’进行磷酸化以中止延伸。
实施例2
一种用于检测肺炎克雷伯菌的荧光RAA方法，包括以下步骤：
1、样本DNA的提取：肺炎克雷伯菌标准菌株及分离菌株在LB培养基中扩培18-24小时，采用DNA提取试剂(cador Pathogen 96QIAcube HT试剂盒，德国凯杰公司)提取DNA，进行分装备用，冻存于-80℃；
2、以待检测样本DNA为模板，加入RAA反应液、酶混合液等配成RAA反应体系，进行扩增反应，其中反应体系如下：25μl RAA反应缓冲液；正向引物、反向引物(10μM)各2.1μl；0.6μl探针(10μM)；2μlDNA模板；加15.5μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉(含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP等，RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)货号：F00001,江苏奇天基因科技有限公司)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μl 280mM醋酸镁溶液并混匀。将上述反应管放置于相应仪器中，在42℃反应20min。其中，RAA反应液中含用于检测肺炎克雷伯菌的正向引物：5'-TGGCCGGTTGCGTACAGGTTGATCGTTATGA-3'；反向引物：5'-AGGGAAGCGGTCACGTTGTAGATCTCACTGTCAC-3'；寡核苷酸探针：5'-CAAACGAAAGGGCCGCAGAGCGCGATGA(FAM-dT)G(THF)G(BHQ-dT)CCTGACGCCATTG-3'；其中：FAM：6-羧基荧光素；THF：四氢呋喃；BHQ：黑洞淬灭剂；phosphate：3’进行磷酸化以中止延伸。
3、实验结束后保存检测数据文件；
4、质量控制
阴性对照：FAM通道无扩增曲线，且无Tt值；阳性对照：FAM通道有扩增曲线，Tt值均≤8min；以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验；
5、结果判读
5.1当FAM通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定肺炎克雷伯菌阳性；
5.2当FAM通道无扩增曲线，且Tt值显示为Undet或No Tt，质量控制正常时，可判定肺炎克雷伯菌阴性。
实施例3
标准株、临床分离株检测实验
该实验验证该检测方法能否检测细菌标准株，采用上述实施例2方法检测经LB培养基扩培的处于对数生长期的肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC 7000603，浓度约为5×108CFU/ml，实验结果参考图1
实施例4
特异性实验
利用上述实施例2方法分别对沙门氏菌标准菌株ATCC 14028以及ATCC 35640、金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923以及ATCC 6538、单增李斯特菌标准菌株ATCC 13932以及ATCC 19111、大肠杆菌标准菌株ATCC 11775、大肠杆菌O157:H7标准菌株NCTC 12900分别进行荧光反应检测和RAA基础扩增。荧光反应扩增结果表明，只有肺炎克雷伯菌标准菌株、分离株检测出相应的特异性扩增曲线，其他细菌未见有相应的扩增，无交叉反应，实验结果参考图2。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波国际旅行卫生保健中心（宁波海关口岸门诊部）
<120> 一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tggccggttg cgtacaggtt gatcgttatg a 31
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agggaagcgg tcacgttgta gatctcactg tcac 34
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
caaacgaaag ggccgcagag cgcgatgaam dtgthgbhdt cctgacgcca ttg 53

Claims (4)

1.一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列，其特征在于：根据肺炎克雷伯菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，引物序列具体如下：
正向引物为5'-TGGCCGGTTGCGTACAGGTTGATCGTTATGA-3'；
反向引物：5'-AGGGAAGCGGTCACGTTGTAGATCTCACTGTCAC-3'；寡核苷酸探针：
5'-CAAACGAAAGGGCCGCAGAGCGCGATGA/FAM-dT/G/THF/G/BHQ-dT/CCTGACGCCATTG-3'；
其中：FAM：6-羧基荧光素；THF：四氢呋喃；BHQ：黑洞淬灭剂；phosphate：3’进行磷酸化以中止延伸。
2.一种根据权利要求1所述的用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列在制备肺炎克雷伯菌荧光RAA检测试剂盒中的应用。
3.一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的试剂盒，其特征在于：包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括有权利要求1所述的引物对和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：RAA反应体系如下：RAA反应缓冲液25μl；10μM的正向引物2.1μl、10μM的反向引物2.1μl；10μM的探针0.6μl；DNA模板2μl；加15.5μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉的反应管中，再次混匀，最后各管加入2.5μl280mM醋酸镁溶液并混匀。
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