CN105087825A

CN105087825A - 常温等温快速检测埃博拉病毒的方法、试剂及引物和探针

Info

Publication number: CN105087825A
Application number: CN201510392226.5A
Authority: CN
Inventors: 刘国宪; 曹伟; 周国辉; 程奇
Original assignee: ZHEJIANG TAIJING BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Zhejiang Shan Shi Wo Knight Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-07-01
Also published as: CN105087825B

Abstract

常温等温快速检测埃博拉病毒的方法、试剂及引物和探针，本发明涉及一种在常温等温条件下，对埃博拉病毒进行快速、实时、灵敏,准确检测的方法，通过特异性引物、特异性荧光探针、6种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

Description

常温等温快速检测埃博拉病毒的方法、试剂及引物和探针

技术领域

本发明是埃博拉病毒检测领域的一项新的技术与应用，涉及一种在常温等温条件下，对埃博拉病毒进行快速、实时、特异性检测的方法，可在体外临床检测、食品安全、生物安全以及农业领域具有广阔的应用前景。

背景技术

埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)可以引起一种急性出血性、动物源性传染病——埃博拉出血热(Ebolahemorrhagicfever，EHF)。该病毒首次于1976年在苏丹南部和刚果民主共和国(旧称扎伊尔)的埃博拉河地区发现，因其引起病人全身性出血症状，故命名为埃博拉出血热。EBOV属丝状病毒科，呈长丝状体，单股负链RNA病毒，外有包膜，纯病毒粒子由一个螺旋形核糖核壳复合体构成，含负链线性RNA分子和4个毒粒结构蛋白。目前已鉴定的EBOV有5个亚型：埃博拉-扎伊尔型(Ebola-Zaire，EBOV-Z)、埃博拉-苏丹型(Ebola-Sudan，EBOV-S)、埃博拉-本迪布焦型(Ebola-Bundibugyo，EBOV-B)、埃博拉-莱斯顿型(EbolaReston，EBOV-R)和埃博拉-科特迪瓦型(EbolaCoast，EBOV-C)。其中EBOV-Z和EBOV-S对人类和非人类灵长类动物的致病性和致死率很高；EBOV-Z可高达90％的致死率。因此，快速检测埃博拉病毒方法的建立具有重大意义。

埃博拉病毒是高度危险的病原体，必须在专门的实验设备中进行病毒的分离与鉴定。在非洲疫区主要通过检测埃博拉病毒特异性IgM和IgG抗体以及检查病毒抗原或核酸等进行诊断。但是病人血液中的病毒特异性IgM抗体在发病后2～9天出现，IgG抗体在发病后6～18天出现，严重滞后了埃博拉病毒感染者的诊断，因而增加了对埃博拉病毒感染者隔离和治疗的难度，同时也增加了埃博拉病毒的传染范围。对部分急性期血清中特异性抗体滴度很低的患者，还需要同时进行病毒抗原或核酸的检测，不仅增加了诊断的时间而且增加了诊断的成本。虽然，也出现了RT-PCR，套式RT-PCR以及RT-LAMP等诊断埃博拉病毒的技术，但是这些技术对精密设备的高度依赖性，尤其是荧光定量PCR仪，使其主要集中在中心实验室内使用，未能帮助医务人员真正在现场实现埃博拉病毒的快速检测。此外，由于荧光定量PCR仪的高精密性，使得整个实验设置过程相对复杂，因此不但实验操作，而且结果的解读也都需要受过专业训练的技术人员才能完成。这些缺点更让荧光定量PCR难以在基层检测实验室或单位推广，因而资源匮乏的边远地区则更不便于使用。

分子生物学检测方法可以快速准确的进行病原体检测，可用于EBOV感染的早期诊断，目前国内外已经建立了一些EBOV的检测方法。例如：IgM捕获和IgGELISAs技术，RT-PCR技术，套式RT-PCR技术，RT-LAMP技术等等。目前这些技术耗时较长，而且对埃博拉病毒检测的灵敏度上有待进一步优化。

常温恒温核酸扩增技术利用荧光探针的高特异性结合重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA核酸扩增技术)的快速、高灵敏度和高通量等特点，可以建立一种快速检测EBOV的方法RAA核酸扩增技术是一种恒温核酸扩增技术。在37℃恒温下，来自于大肠杆菌的recA重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。通常在30min内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。目前国内外应用RAA核酸扩增技术建立了一些致病微生物的新型检测方法，例如登革病毒、肠道沙门氏菌、结核分支杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等等，该技术在埃博拉病毒检测方面尚未发现报道。

因此本发明所提供的方法在埃博拉病毒检测领域具有一定的开拓性，可以为临床埃博拉出血热病的快速诊断和监测奠定坚实的基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种更能满足现场核酸快速检测埃博拉病毒的引物、探针、试剂和方法。

本发明的第一个目的是提供常温等温快速检测埃博拉病毒的引物和探针。

常温等温快速检测埃博拉病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列为：

NP-3-F：CATATGATGAAGGATGAGCCTGTAGTTTTCAG；

NP-3-R：CAGGATTGCCATGAATTTATTCCTGTGATTC；

NP-Probe：TCCACCATGGCTCACTGAAAAAGAGGCCA(F)G(H)A(B)GATGAGAATAGATTTG—SpacerC3；

其中，F为荧光基团，H为四氢呋喃位点，B为粹灭基团，3’末端为SpacerC3修饰。

常温等温，是指在某一恒定温度下进行孵育，温度为20℃-42℃，接近常温，并且是均一恒定的温度。

本发明的特异性引物，是针对埃博拉病毒的核蛋白(nuclearprotein，NP)基因设计的寡核苷酸。有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30-35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

本发明的特异性荧光探针(如图1所示)，是针对埃博拉病毒的NP基因设计的寡核苷酸长链。寡核苷酸单链专一性识别埃博拉病毒的NP基因序列的某一区域，不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有四个修饰位点，距离5’端的30-35nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2-4nt；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG或C3-spacer，用于抑制聚合酶从该位点开始延伸；探针的Tm值不作为设计的主要考虑因素；荧光基团的种类较多，例如FAM、Cy3、HEX、TexasRed、JOE、VIC、TAMRA或Cy5等，淬灭基团可选择BHQ1或BHQ2，以最大限度地降低背景荧光噪音为原则。

本发明的第二个目的是提供用于常温等温快速检测埃博拉病毒的试剂。

常温等温快速检测埃博拉病毒的试剂，其特征在于，所述试剂包括聚乙二醇、Tris、乙酸钾、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、脱氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白、反转录酶、核酸外切酶、权利要求1所述的引物及探针。

进一步地，所述试剂为冻干粉，由以下方法制成：将试剂在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2-10小时，最后10-18℃干燥1-2小时。冷冻干燥处理，是一种将反应混合物在超低温条件下进行干燥处理的过程，目的是便于反应混合物的存储和运输，减少在长途运输过程中酶活性降低的几率。将反应混合物分装于反应管中，在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，其过程分为主干燥(-20～-45℃，2-10小时)和终末干燥(10-18℃，1-2小时)两个阶段，两个阶段的干燥时间取决于冻干样品的数量；冷冻干燥后的成品需为白色干性粉末并依附在反应管壁，加水重悬后可完全溶解，无任何颗粒状残留物。

本发明试剂中的6种工程酶分别为，重组酶，单链DNA结合蛋白，DNA聚合酶，辅助蛋白，反转录酶和核酸外切酶，是一系列具备特定功能的基因工程酶，具有以下特征：(1)每种基因工程酶都来源于自然界常见菌中，具备所需的特定的功能，通过基因工程改造、重组构建、发酵表达、破碎纯化以及活性检测等一系列流程后，变成可工业化生产的高纯度、高活性的酶蛋白；(2)每种酶在扩增反应过程中的作用不同，相互合作在常温恒温的条件下实现核酸的体外快速扩增；(3)重组酶，来源于噬菌体或细菌，例如T4噬菌体重组酶uvsX，大肠杆菌(E.coli)重组酶RecA；(4)单链DNA结合蛋白，来源于T4或E.coli的gp32；(5)DNA聚合酶的来源较多，例如Phi-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)、Bst聚合酶或者E.coli的DNA聚合酶IKlenow大片段；(6)辅助蛋白，来源于T4噬菌体uvsY蛋白；(7)核酸外切酶，来源于E.coli的核酸外切酶exoIII或exoIV；(8)反转录酶，来源于莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV)或禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV)；(9)每种酶蛋白在反应体系中的最适浓度范围分别为：重组酶，220-280ng/μl；单链DNA结合蛋白，200-250ng/μl；DNA聚合酶，100-150ng/μl；辅助蛋白，70-100ng/μl；核酸外切酶，80-120ng/μl；反转录酶，150-200ng/μl。

试剂中的其它组分，是维持酶促反应最适条件的多种化合物的混合物，(1)这些组分的最适浓度范围分别为：聚乙二醇(PEG)，2-4％；Tris，20-40mM；乙酸钾(KAc)，100-140mM；酸磷酸腺苷(ATP)，2-4mM；磷酸肌酸二钠盐(Creatinephosphatedisodiumsalt，PCr)，40-60mM；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，250-300μM；蔗糖，5-8％；甘油，20-40％；(2)这些组分为反应提供酶的辅因子、盐离子浓度、酸碱度、反应所需能量、扩增所需原料，冻干处理过程和存储阶段中提供保护剂。

本发明的第三个目的是提供一种常温等温快速检测埃博拉病毒的方法。

常温等温快速检测埃博拉病毒的方法，其特征在于，所述方法是在装有权利要求2、3或4所述试剂的反应管中加待检样本、双蒸水和缓冲液，置于一温控设备中孵育15-25分钟，再通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测；所述常温的温度为20℃-42℃，扩增过程中保持均一恒定温度；整个检测过程反应管保持密闭。

本发明检测核酸目标物的方法，是一种在常温等温条件下，通过特异性引物、特异性荧光探针、6种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测的方法，通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，并有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

常温等温条件，是指不依赖精确控温的高端精密仪器完成反应的核酸扩增方式。本发明的方法不需要PCR过程中的反复的温度升降，可以在简易的温控设备上实现扩增反应，例如金属浴、水浴或者恒温箱；反应温度可以设置在20-42度之间；由于反应温度影响着酶的催化速率而与反应速率成一定的相关性，因此对于核糖核酸(RNA)，荧光反应的最佳温度在37-42度之间，针对不同来源的目标待检物，最适温度需经过优化试验才能确定。

具备荧光检测功能的仪器，指可以同时实时检测多个核酸目标物的荧光信号的设备与平台，具有荧光检测通道，具有加热模块，可以维持反应所需的常温等温条件；还可以具有触屏式或可PC端控制的操作界面，以便实验参数的设置、数据分析以及反应过程的实时观测等一系列操作。

本发明的检测方法适合应用于多种荧光检测设备，检测方法的结果可以通过不同类型的荧光检测设备进行判读。待检样本的阳性、阴性判定：以前3分钟内每个样本检测的荧光值的均值计算出样本的标准偏差值，该样本的检测阈值线为前3分钟样本检测荧光均值加上三倍该样本的标准偏差值(单位：荧光强度，mV)；当扩增曲线与阈值线相交后，并在随后的1分钟内曲线斜率大于30mV/分钟，则可视为阳性扩增；如果扩增曲线与该阈值线在反应时间内无任何交点，则视为阴性扩增。

本发明的采用闭管检测，一次性加样后，整个检测过程反应管保持密闭，能有效防止气溶胶所引起的假阳性干扰。

本发明检测方法的工作原理(如图2所示)，是一种借助酶促反应打开核酸物质的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。引物特异地结合在RNA模板上，在反转录酶的作用下合成一条互补的cDNA链，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交链；然后重组酶与引物形成复合物，该复合物在辅助蛋白质的协助下，非特异地结合在RNA-DNA杂交链上；在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板RNA-DNA杂交双链结构被打开，进而利于重组酶-引物复合物在DNA链上滑行并扫描，一旦复合物上的引物找到匹配区域通过碱基互补配对原则结合在DNA链上，重组酶从引物上脱落，同时DNA聚合酶结合在该区域DNA链上，沿着引物的3’端进行子链的延伸；因为DNA聚合酶的链置换活性，新合成的子链替代同源母链的位置，与母链形成双链结构；由于上下游引物的限制，重组酶-引物复合物在下一轮扩增起始阶段，大大缩短了扫描匹配区域需要的时间，因而可以更快地合成新的子链；当双链DNA被打开之后，特异性荧光探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此荧光探针嵌入新生成的子链中；在新生成的DNA双链中，由于荧光探针的嵌入，在荧光探针的四氢呋喃位点出现未与母链配对的碱基，核酸外切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的荧光基团和粹灭基团分离，使荧光基团的荧光信号得以释放，同时切出了3’端的修饰基团，DNA聚合酶以此为起点继续延伸子链。新合成的双链DNA链上携带有荧光基团，因此荧光检测设备记录的荧光信号与生成子链的数量呈一一对应关系，所以新方法记录的荧光信号也是积累的荧光。

本发明具有以下技术特点：

1)常温等温反应：与主要的几种核酸扩增技术相比，常温等温反应大大降低了对仪器加热模块的要求，也减少了对制冷模块的需求，因此使得反应仪器的选择面更加宽广。另外，对于配套检测仪器的设计可以趋于小型化、可携带化和操作简便化发展，而且对于检测操作的要求更加简单、便捷，因此可应用的区域和领域更加广阔。

2)反应快速：常温等温核酸扩增技术是利用多种工程酶在特定的溶液环境下，最大限度的模拟生物体内的核酸扩增反应，大大缩短了扩增过程所需的时间。相对于荧光定量PCR，扩增反应时间由1.5-2小时缩短至15-25分钟，明显提高了扩增效率。

3)一步法扩增：对于以RNA为模板的待检源，大多数检测技术均为两步法，先以RNA为模板扩增出cDNA，然后对得到的cDNA进行纯化或其他方式的处理，再进行扩增检测，因此在纯化转移过程中会出现污染，从而造成假阳性结果；对于常温等温技术，可以实现以RNA为模板的一步核酸扩增，无需中途纯化或者添加试剂，因此不仅避免的中途操作的污染，也缩短了检测所需的时间。

4)实时检测：与粹灭基团分离的荧光基团和新合成的子链在数量上是一一对应的，随着扩增反应的推进荧光信号是累积的。由于检测仪器采集荧光信号存在一定的时间间隔，因此随着时间的变化，检测的荧光信号是一个变化的过程，从而实现实时监测的效果。

5)定性与定量检测：通过采集的荧光信号绘制的扩增曲线可以用于对检测结果的判定。定性检测可以根据扩增曲线的线性快速判断，S型曲线表示阳性样本，平直曲线表示阴性样本；半定量检测可以根据扩增曲线与阈值线相交的时间，初步判断不同待检样本中目标核酸浓度的高低，例如时间值小的样本中目标核酸量高于时间值大的样本中目标核酸量；定性检测可以根据已知浓度的样本绘制标准曲线来实现。

6)特异性和灵敏度：每对引物和荧光探针只能与目标核酸物进行特异性结合，因此检测准确而且专一。已有实验数据表明，在25分钟内，对埃博拉病毒检测的灵敏度都高达1×10²拷贝/μl，达到～0.3fg/μl的检测级别。

7)检测过程简易：主要反应组分配制后分装至反应管中，并冻干成干粉状态。反应前期准备只需要添加待检样本、双蒸水和缓冲液，混匀后即可启动扩增反应，所以对实验技能要求较低，一般实验人员即可完成操作。扩增反应完成后结果的定性判定也较为简单易懂，根据图形的形状可以作出判断，因此新方法也适合于基层检测机构的推广。

8)应用范围广：具有常温、等温、快速、灵敏、特异、操作简便等特点，新方法适用多种荧光检测设备，例如荧光定量PCR、酶标仪、ESEQuantTubeScanner、OptigeneGenieIII等，也可适用于将来的微流控分子检测平台。

附图说明

图1是荧光探针结构图。

图中，荧光基团和粹灭基团之间相距2-4nt，exo是一种核酸外切酶，能够识别THF位点，进行酶切反应，粹灭基团从荧光探针上脱落下来，荧光基团发射的荧光信号得以被检测出。

图2是反应原理图。

图中，第一步，引物特异性结合在RNA的匹配区域，反转录酶沿着引物的3’端进行延伸，形成一条RNA-DNA杂交链；第二步，重组酶与引物分别形成起始复合物，开始模板扫描；第三步，引物找到匹配区域后，进行结合；第四步，在单链结合蛋白的帮助下，DNA聚合酶进入形成的气泡区，开始从3’端进行子链延伸，并在聚合酶的作用下，替换模板；第五步，在子链延伸过程中，荧光探针找到匹配区域，核酸外切酶E识别双链状态下的THF位点，酶切启动，荧光基团与淬灭基团分离；第六步，探针被E酶切后，荧光释放，子链继续从探针的3’端进行合成，并延伸，新双链生成；指数扩增的实现依赖于ATP提供能量，使第6步不断循环继续。

图3是引物对扩增效果影响的电泳图谱。M为Marker，1、2为引物NP-1，3、4为NP-2，5、6为NP-3，CK为对照组。

图4是DNA扩增灵敏度实验的电泳图谱。M为Marker，1-6为引物NP-2在不同的模版浓度下的扩增效果(模板浓度分别为：1、2：30pg；3、4：3pg；5、6：0.3pg)，7-12为引物NP-3在不同模版浓度下的扩增效果(模板浓度分别为：7、8：30pg；9、10：3pg；11、12：0.3pg)。

图5是荧光RT-RAA的灵敏度实验示意图。

图6是样品检测的荧光信号增加曲线图。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

实施例1：引物的筛选

参考GenBank上已公布的20条EBOVNP基因序列，本申请发明人对EBOV的NP的基因组、蛋白结构与功能等信息进行了较为深入的研究，而且在EBOV中NP基因的含量较高，本发明选择EBOV的NP基因作为目的基因。大量实验表明，不同的引物对恒温扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对EBOV-Z亚型的NP基因初步设计了三对不同的引物：NP-1、NP-2和NP-3(如表1所示)，这些序列可以和EBOV-S亚型NP基因的相应序列特异性结合。

表1：引物和探针的序列

图3是引物对扩增效果影响的电泳图谱。从图3上可以看出，不同的引物对扩增效果是有影响的，使用引物NP-1进行DNA扩增实验时出现非特异性条带，引物NP-2和NP-3扩增效果较好，对照组扩增效果正常。因此，引物NP-1不符合特异性扩增的要求，也不利于进一步的荧光反转录RAA检测。

为了选择更好的引物进行荧光反转录RAA检测。分别针对引物NP-2和NP-3进行模版梯度稀释的灵敏度试验。DNA扩增灵敏度实验的电泳图谱如图4所示。从图4上可以看出，在较低模版浓度时，引物NP-3扩增的目标条带比引物NP-2的亮度高，也就是说使用引物NP-3进行EBOV-Z亚型NP基因扩增试验的灵敏度更高。

根据上述的实验结果，选择引物NP-3作为荧光检测实验的引物。根据引物NP-3对应的DNA序列，设计了一条TaqMan荧光探针NP-3-Probe(探针序列如表3所示)。

NP-3-Probe：TCCACCATGGCTCACTGAAAAAGAGGCCA(F)G(H)A(B)GATGAGAATAGATTTG—SpacerC3

其中：F为荧光基团(Fluorophore)，H为四氢呋喃位点(THFresidue)，B为粹灭基团(Quencher)，3’末端为SpacerC3修饰。

实施例2：荧光反转录RAA检测

本实施例用于说明在Twista仪器上进行的常温恒温荧光反应。

1.根据NCBIGenBank上已经公布埃博拉-扎伊尔型病毒(EBOV-Z)NP基因序列，全基因合成了埃博拉-扎伊尔型病毒的NP基因。

2.基于引物与荧光探针设计原则，依据埃博拉病毒NP基因序列设计了一对引物(NP-3-F和和NP-3-R)和一条荧光探针(NP-Probe)，序列如表2所示：

表2埃博拉病毒NP基因的引物和探针的序列

*(F)为荧光基团(Fluorophore)，(H)为四氢呋喃位点(THFresidue)，(B)为粹灭基团(Quencher)，3’末端为SpacerC3修饰(Biotin-TEG)。

3.冻干粉反应单元组分为

表3冻干粉反应单元组分

4.扩增反应体系为

表4反应体系配制

5.扩增反应程序：39度恒温，25分钟。

用RNaseFreedH₂O对EBOV-Z亚型的NP基因模版进行10倍梯度稀释,用RAA荧光检测试剂盒进行荧光实验,结果判断标准为荧光检测进行25min内有荧光信号的增加曲线,判断为阳性.如图5所示,该方法可以检测出10²个拷贝/μL的EBOV-Z亚型NP基因的DNA模版为阳性.从图5上可以看出,10⁸个拷贝/μL的高水平DNA模板量在4min左右就检测出增加的荧光信号,即使是最低的10²个拷贝/μL的DNA模板量在19min也可以检测出荧光信号的增加.而且在整个荧光检测过程中,阴性反应一直保持着较低的水平.

实施例3：荧光反转录RAA检测甲型流感病毒

本实施例用于说明荧光反转录RAA检测实际样本的可行性。

1.根据NCBIGenBank上已经公布甲型流感病毒基质蛋白的基因序列，进行序列同源性分析，找出一段高同源性的基因序列，如下所示：

5’-ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATAGCGCAGAGACTTGAAGATGTTTTTGCAGGGAAAAACACCGATCTTGAGGCACTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTCAATGGGAA-3’

2.基于引物与荧光探针设计原则，根据上述甲型流感病毒基质蛋白的保守序列设计了一对引物(FluA-M-F和FluA-M-R)和一条荧光探针(FluA-M-Probe)，序列如表5所示：

表5甲型流感病毒基质蛋白基因的引物和探针的序列

*(F)为荧光基团，(H)为四氢呋喃位点，(B)为粹灭基团，3’末端为SpacerC3修饰。

3.冻干粉反应单元组分为

表6冻干粉反应单元组分

4.扩增反应体系为

表7反应体系配制

5.扩增反应程序：39度恒温，25分钟。

使用RNA提取试剂盒提取患者咽洗液中的RNA，用RAA荧光检测试剂盒进行荧光实验,结果判断标准为荧光检测进行25min内有荧光信号的增加曲线,判断为阳性.如图6所示,四个阳性检体检测均为阳性sample1,sample2,sample3的检出时间10min左右，sample4的检出时间18min左右，阳性、阴性对照正常。

SEQUENCELISTING

<110>浙江泰晶生物科技有限公司

<120>常温等温快速检测埃博拉病毒的方法、试剂及引物和探针

<130>

<160>7

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

catatgatgaaggatgagcctgtagttttcag32

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caggattgccatgaatttattcctgtgattc31

<210>3

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tccaccatggctcactgaaaaagaggccagagatgagaatagatttg47

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gaaatagtttaaagacaaattgctcggaatc31

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ctcaagattgtttacttgatacactgggatg31

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gaacgaaatcagcttccagcaaacaaacgcg31

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gtcggatcatcatcttgatggccaggattgtc32

Claims

1.常温等温快速检测埃博拉病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列为：

NP-3-F：CATATGATGAAGGATGAGCCTGTAGTTTTCAG；

NP-3-R：CAGGATTGCCATGAATTTATTCCTGTGATTC；

NP-Probe：TCCACCATGGCTCACTGAAAAAGAGGCCA(F)G(H)A(B)GATGAGAATAGA

TTTG—SpacerC3；

2.常温等温快速检测埃博拉病毒的试剂，其特征在于，所述试剂包括聚乙二醇、Tris、乙酸钾、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、脱氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白、反转录酶、核酸外切酶和权利要求1所述的引物及探针。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂为冻干粉，由以下方法制成：将试剂在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2-10小时，最后10-18℃干燥1-2小时。

4.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，在反应体系中，重组酶的浓度范围是220-280ng/μl；单链DNA结合蛋白的浓度范围是200-250ng/μl；DNA聚合酶的浓度范围是100-150ng/μl；辅助蛋白的浓度范围是70-100ng/μl；核酸外切酶的浓度范围是80-120ng/μl；反转录酶的浓度范围是150-200ng/μl。

5.常温等温快速检测埃博拉病毒的方法，其特征在于，所述方法是在装有权利要求2、3或4所述试剂的反应管中加待检样本、双蒸水和缓冲液，置于一温控设备中孵育15-25分钟，再通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测；所述常温的温度为20℃-42℃，扩增过程中保持均一恒定温度；整个检测过程反应管保持密闭。