CN109355428A - 常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒 - Google Patents

常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒 Download PDF

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曹伟
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Abstract

本发明公开了一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒。本发明通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

Description

常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒。
背景技术
伪狂犬病病毒(Pseudo rabies virus，PRV)是引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要特征的病毒。伪狂犬病于1813年首次被报道出来，其病原于1910年被证明是病毒。PRV在分类学上属于疱疹病毒科、疱疹病毒亚科、水疱病毒属成员，病毒粒子为椭圆形或圆形，二十面体立体对称。病毒基因组由长独特区(Unique longregion，UL)、短独特区(Unique short region，US)以及颠倒重复区(IRS)(位于US两侧的末端重复序列(Terminal repeat，TR)与内部重复序列(Internal repeat，IR)组成)。其基因组为线状双链DNA，大小约180kb，可编码70～100种蛋白或多肽。目前已有被发现并测序的11种糖蛋白：gB，gC，gD，gE，gG，gH，gI，gL，gM，gN，gK，它们均为HSV-1的同源蛋白。gB、gD、gH、gL是体外复制所必需的糖蛋白基因，其余为非必需糖蛋白。gB作为病毒的重要囊膜蛋白，对于病毒的感染起到关键作用。伪狂犬病可引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎及怀孕母猪流产、死胎为主要症状的一种重要传染病。能引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病尤其是猪的伪狂犬病，已成为危害当今养猪业的最严重的传染病之一。因此，建立快速检测伪狂犬病病毒方法具有重大意义。
人们通过多种方法检测PRV，如血清学检测方法，分子生物学技术，限制性核酸内切酶分析等，其中分子生物学技术(核酸探针技术和聚合酶链式反应技术)具有特异性强、灵敏度高等优点越来越被人们重视和发展。与本发明相比，这些技术对精密设备高度依赖，尤其是荧光定量PCR仪，使其主要集中在中心实验室内使用，未能帮助医务人员真正在现场实现伪狂犬病病毒的快速检测。此外，由于荧光定量PCR仪的高精密性，使得整个实验设置过程相对复杂，因此不但实验操作，而且结果的解读也都需要受过专业训练的技术人员才能完成。这些缺点更让荧光定量PCR难以在基层检测实验室或单位推广，因而资源匮乏的边远地区则更不便于使用。
综上，本发明针对现有伪狂犬病病毒病毒检测的缺陷及市场需求，开发出一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒。本发明采用的常温恒温核酸扩增技术是利用荧光探针的高特异性结合重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA核酸扩增技术)的快速、高灵敏度和高通量等特点，建立一种快速检测PRV的方法。即在37℃恒温下，来自于大肠杆菌的recA重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。通常在30min内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。目前国内外应用RAA核酸扩增技术建立了一些致病微生物的新型检测方法，例如登革病毒、肠道沙门氏菌、结核分支杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等等，该技术在伪狂犬病病毒检测方面尚未发现报道。因此本发明所提供的方法在伪狂犬病病毒检测领域具有一定的开拓性，可以为伪狂犬病的快速诊断和监测奠定坚实的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物和探针。
本发明的另一目的在于提供一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的试剂。
本发明的再一目的是提供一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒。
为了实现本发明的目的之一，本发明采取以下技术方案：
一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物和探针，其上下游引物和探针的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，具体如下：
上游引物：GCCGCCTGGTGCGAGCTGCAGAACAAGGACC；
下游引物：CCAGCGGGCGGCTGTAGCACGTGCCGCGCTC；
探针：
CCATCTCGCGGTGCGTGGAGGTGCGCGGCGGCG[F]G[H][B]CGTGCAGAACTCCATG—SpacerC3；
其中，F为荧光基团，H为四氢呋喃位点，B为猝灭基团，3’末端为SpacerC3修饰。
本发明中的等温常温，是指在接近常温保持均一恒定的温度下进行孵育。优选的，所述常温指温度范围为20℃-42℃。
本发明的特异性引物，是针对伪狂犬病病毒的糖蛋白(glycoprotein，gb)基因设计的寡核苷酸。有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在26-35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。
本发明的特异性荧光探针是针对伪狂犬病病毒的gB基因设计的寡核苷酸长链。寡核苷酸单链专一性识别伪狂犬病病毒的gB基因序列的某一区域，不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-55nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有四个修饰位点，距离5’端的30-35nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个猝灭基团，两个基团的间距为2-4nt；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG或C3-spacer，用于抑制聚合酶从该位点开始延伸；探针的Tm值不作为设计的主要考虑因素；荧光基团的种类较多，例如FAM、Cy3、HEX、TexasRed、JOE、VIC、TAMRA或Cy5等，淬灭基团可选择BHQ1或BHQ2，以最大限度地降低背景荧光噪音为原则。
为了实现本发明的目的之二，本发明采取以下技术方案：
一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的试剂，包含上述引物和探针。
进一步地，所述试剂还包括反应液，所述反应液包括聚乙二醇(PEG)、Tris、乙酸钾、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、脱氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白和核酸外切酶。
上述反应液经冻干后保存，常温恒温快速检测伪狂犬病病毒时再溶于双蒸水使用。所述冻干条件为：在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2-10小时。
冷冻干燥处理，是一种将反应混合物在超低温条件下进行干燥处理的过程，目的是便于反应混合物的存储和运输，减少在长途运输过程中酶活性降低的几率。将反应混合物分装于反应管中，在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，其过程分为主干燥(-20～-45℃，2-10小时)和终末干燥(10-18℃，1-2小时)两个阶段，两个阶段的干燥时间取决于冻干样品的数量；冷冻干燥后的成品需为白色干性粉末并依附在反应管壁，加水重悬后可完全溶解，无任何颗粒状残留物。。
本发明反应液中的5种工程酶：重组酶，单链DNA结合蛋白，DNA聚合酶，辅助蛋白和核酸外切酶，是一系列具备特定功能的基因工程酶。上述5种基因工程酶都来源于自然界常见菌中，具备所需的特定的功能，通过基因工程改造、重组构建、发酵表达、破碎纯化以及活性检测等一系列流程后，变成可工业化生产的高纯度、高活性的酶蛋白。
优选的，所述重组酶来源于噬菌体或细菌；更优选的，所述重组酶选自T4噬菌体重组酶uvsX或大肠杆菌(E.coli)重组酶RecA。
优选的，所述单链DNA结合蛋白选自T4或E.coli的gp32。
优选的，所述DNA聚合酶选自Phi-29聚合酶、枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)、Bst聚合酶或E.coli的DNA聚合酶IKlenow大片段。
优选的，所述辅助蛋白为T4噬菌体uvsY蛋白。
优选的，所述核酸外切酶选自E.coli的核酸外切酶exoIII或exoIV。
进一步地，上述反应液中5种工程酶的浓度分别为：重组酶210-290ng/μl；单链DNA结合蛋白190-270ng/μl；DNA聚合酶80-160ng/μl；辅助蛋白60-110ng/μl；核酸外切酶70-130ng/μl。
反应液中的其它组分，为反应提供酶的辅因子、盐离子浓度、酸碱度、反应所需能量、扩增所需原料，冻干处理过程和存储阶段中提供保护剂。
进一步地，反应液中各组分浓度为：聚乙二醇(PEG)2-4％；Tris 20-40mM；乙酸钾(KAc)100-140mM；酸磷酸腺苷(ATP)2-4mM；磷酸肌酸二钠盐(Creatinephosphatedisodiumsalt，PCr)40-60mM；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)250-300μM；蔗糖5-8％；甘油20-40％。
为了实现本发明的目的之三，本发明采取以下技术方案：
一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的试剂。
本发明检测方法的工作原理：是一种借助酶促反应打开核酸物质的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。引物与重组酶结合形成复合物，重组酶-引物复合物在DNA链上滑行并扫描，一旦复合物上的引物找到匹配区域通过碱基互补配对原则结合在DNA链上，重组酶从引物上脱落，同时DNA聚合酶结合在该区域DNA链上，沿着引物的3’端进行子链的延伸；因为DNA聚合酶的链置换活性，新合成的子链替代同源母链的位置，与母链形成双链结构；由于上下游引物的限制，重组酶-引物复合物在下一轮扩增起始阶段，大大缩短了扫描匹配区域需要的时间，因而可以更快地合成新的子链；当双链DNA被打开之后，特异性荧光探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此荧光探针嵌入新生成的子链中；在新生成的DNA双链中，由于荧光探针的嵌入，在荧光探针的四氢呋喃位点出现未与母链配对的碱基，核酸外切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的荧光基团和猝灭基团分离，使荧光基团的荧光信号得以释放，同时切出了3’端的修饰基团，DNA聚合酶以此为起点继续延伸子链。新合成的双链DNA链上携带有荧光基团，因此荧光检测设备记录的荧光信号与生成子链的数量呈一一对应关系，所以新方法记录的荧光信号也是积累的荧光。
本发明检测核酸目标物的方法，是一种在常温等温条件下，通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测的方法，通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，并有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。
常温等温条件，是指不依赖精确控温的高端精密仪器完成反应的核酸扩增方式。本发明的方法不需要PCR过程中的反复的温度升降，可以在简易的温控设备上实现扩增反应，例如金属浴、水浴或者恒温箱；反应温度可以设置在20-42度之间；由于反应温度影响着酶的催化速率而与反应速率成一定的相关性，因此对于脱氧核糖核酸(DNA)，荧光反应的最佳温度在37-42度之间，针对不同来源的目标待检物，最适温度需经过优化试验才能确定。
具备荧光检测功能的仪器，指可以同时实时检测多个核酸目标物的荧光信号的设备与平台，具有荧光检测通道，具有加热模块，可以维持反应所需的常温等温条件；还可以具有触屏式或可PC端控制的操作界面，以便实验参数的设置、数据分析以及反应过程的实时观测等一系列操作。
本发明的检测方法适合应用于多种荧光检测设备，检测方法的结果可以通过不同类型的荧光检测设备进行判读。待检样本的阳性、阴性判定：以前3分钟内每个样本检测的荧光值的均值计算出样本的标准偏差值，该样本的检测阈值线为前3分钟样本检测荧光均值加上三倍该样本的标准偏差值(单位：荧光强度，mV)；当扩增曲线与阈值线相交后，并在随后的1分钟内曲线斜率大于30mV/分钟，则可视为阳性扩增；如果扩增曲线与该阈值线在反应时间内无任何交点，则视为阴性扩增。
本发明的采用闭管检测，一次性加样后，整个检测过程反应管保持密闭，能有效防止气溶胶所引起的假阳性干扰。
本发明具有以下技术特点：
1)常温等温反应：与主要的几种核酸扩增技术相比，常温等温反应大大降低了对仪器加热模块的要求，也减少了对制冷模块的需求，因此使得反应仪器的选择面更加宽广。另外，对于配套检测仪器的设计可以趋于小型化、可携带化和操作简便化发展，而且对于检测操作的要求更加简单、便捷，因此可应用的区域和领域更加广阔。
2)反应快速：常温等温核酸扩增技术是利用多种工程酶在特定的溶液环境下，最大限度的模拟生物体内的核酸扩增反应，大大缩短了扩增过程所需的时间。相对于荧光定量PCR，扩增反应时间由1.5-2小时缩短至15-25分钟，明显提高了扩增效率。
3)实时检测：与猝灭基团分离的荧光基团和新合成的子链在数量上是一一对应的，随着扩增反应的推进荧光信号是累积的。由于检测仪器采集荧光信号存在一定的时间间隔，因此随着时间的变化，检测的荧光信号是一个变化的过程，从而实现实时监测的效果。
4)定性与定量检测：通过采集的荧光信号绘制的扩增曲线可以用于对检测结果的判定。定性检测可以根据扩增曲线的线性快速判断，S型曲线表示阳性样本，平直曲线表示阴性样本；半定量检测可以根据扩增曲线与阈值线相交的时间，初步判断不同待检样本中目标核酸浓度的高低，例如时间值小的样本中目标核酸量高于时间值大的样本中目标核酸量；定性检测可以根据已知浓度的样本绘制标准曲线来实现。
5)特异性和灵敏度：每对引物和荧光探针只能与目标核酸物进行特异性结合，因此检测准确而且专一。实验数据表明，在25分钟内，对伪狂犬病病毒检测的灵敏度高达1×102拷贝/μl，达到0.3fg/μL的检测级别。
6)检测过程简易：主要反应组分配制后分装至反应管中，并冻干成干粉状态。反应前期准备只需要添加待检样本、双蒸水和缓冲液，混匀后即可启动扩增反应，所以对实验技能要求较低，一般实验人员即可完成操作。扩增反应完成后结果的定性判定也较为简单易懂，根据图形的形状可以作出判断，因此新方法也适合于基层检测机构的推广。
7)应用范围广：具有常温、等温、快速、灵敏、特异、操作简便等特点，新方法适用多种荧光检测设备，例如荧光定量PCR、酶标仪、ESEQuant Tube Scanner、Optigene GenieIII等，也可适用于将来的微流控分子检测平台。
附图说明
图1是引物对扩增效果影响的电泳图谱(M为Marker，1为引物PRV-gB-1，2为引物PRV-gB-2，3为引物PRV-gB-3，4为引物PRV-gB-4，CK为阴性对照组)。
图2是不同引物扩增灵敏度实验的电泳图谱(M为Marker，1-6为引物PRV-gB-4在不同的模板浓度下的扩增效果，模板浓度分别为：30fg/μL、30fg/μL、3fg/μL、3fg/μL、0.3fg/μL、0.3fg/μL；7-12为引物PRV-gB-3在不同的模板浓度下的扩增效果，模板浓度分别为：30fg/μL、30fg/μL、3fg/μL、3fg/μL、0.3fg/μL、0.3fg/μL。
图3是探针结构示意图。
图4是扩增反应灵敏度实验的荧光图。
图5是反应原理示意图。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
一、引物和探针的筛选
参考GenBank上已公布的30条PRV的gB基因序列，本申请发明人对PRV的gB的基因组、蛋白结构与功能等信息进行了较为深入的研究，而且在PRV中gB基因的含量较高，本发明选择PRV的gB基因作为目的基因。大量实验表明，不同的引物对恒温扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对PRV的gB基因初步设计了三对不同的引物：PRV-gB-1、PRV-gB-2、PRV-gB-3和PRV-gB-4(如表1所示)，这些序列可以和PRV的gB基因的相应序列特异性结合。
表1：引物和探针的序列
图1是引物对扩增效果影响的电泳图谱。从图1上可以看出，不同的引物对扩增效果是有影响的，使用引物PRV-gB-1、PRV-gB-2进行DNA扩增实验时出现非特异性条带，引物PRV-gB-3和PRV-gB-4扩增效果较好，阴性对照组扩增效果正常。因此，引物PRV-gB-1、PRV-gB-2不符合特异性扩增的要求，也不利于进一步的荧光BTNAA检测。
为了选择更好的引物进行荧光BTNAA检测。分别针对引物PRV-gB-3和PRV-gB-4进行模版梯度稀释的灵敏度试验。DNA扩增灵敏度实验的电泳图谱如图2所示。从图2上可以看出，在较低模版浓度时，引物PRV-gB-4扩增的目标条带比引物PRV-gB-3的亮度高，也就是说使用引物PRV-gB-4进行PRV的gB基因扩增试验的灵敏度更高。这里的模板浓度是根据伪狂犬病病毒部分序列合成的质粒模板的浓度。
根据上述的实验结果，选择引物PRV-gB-4作为荧光检测实验的引物。根据引物PRV-gB-4对应的DNA序列，设计了一条TaqMan荧光探针PRV-gB-4-Probe(探针示意图如图3所示)。
PRV-gB-4-Probe(SEQ ID NO.3)：
CCATCTCGCGGTGCGTGGAGGTGCGCGGCGGCG[F]G[H][B]CGTGCAGAACTCCATG—SpacerC3；
其中：F为荧光基团(Fluorophore)，H为四氢呋喃位点(THF residue)，B为猝灭基团(Quencher)，3’末端为SpacerC3修饰。
二、荧光检测(本实施例用于说明在Twista仪器上进行的常温恒温荧光反应。)
1.根据NCBI GenBank上已经公布伪狂犬病病毒(PRV)gB基因序列，全基因合成了伪狂犬病病毒的gB基因。
2.基于引物与荧光探针设计原则，依据伪狂犬病病毒gB基因序列设计了一对引物(PRV-gB-4F和PRV-gB-4R)和一条荧光探针(PRV-gB-4-Probe)，序列如表2所示：
表2伪狂犬病病毒gB基因的引物和探针的序列
*(F)为荧光基团(Fluorophore)，(H)为四氢呋喃位点(THF residue)，(B)为猝灭基团(Quencher)，3’末端为Spacer C3修饰(Biotin-TEG)。
3.反应液的准备：
将聚乙二醇(PEG)、Tris、乙酸钾、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、脱氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白和核酸外切酶组成的反应液进行冷冻干燥；冻干条件为：在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2-10小时，最后10-18℃干燥1-2小时，得到冻干粉；冻干粉中各组分的浓度为如表3所示。
表3冻干粉反应单元组分
4.扩增反应体系如表4所示。
表4反应体系配制
5.扩增反应程序：39度恒温，25分钟。
用双蒸水对PRV的gB基因模版进行10倍梯度稀释，用BTNAA荧光检测试剂盒进行荧光实验，结果判断标准为荧光检测进行25min内有荧光信号的增加曲线，判断为阳性。如图4所示，该方法可以检测出102个拷贝/μL的PRV的gB基因的DNA模版为阳性。从图4上可以看出，105个拷贝/μL的高水平DNA模板量在4min左右就检测出增加的荧光信号，即使是最低的102个拷贝/μL的DNA模板量在14min也可以检测出荧光信号的增加，而且在整个荧光检测过程中，阴性反应一直保持着较低的水平。
本发明反应原理如图5所示。如图5，第一步，重组酶与引物分别形成起始复合物，开始模板扫描；第二步，引物找到匹配区域后，进行结合；第三步，在单链结合蛋白的帮助下，DNA聚合酶进入形成的气泡区，开始从3’端进行子链延伸，并在聚合酶的作用下，替换模板；第四步，在子链延伸过程中，荧光探针找到匹配区域，核酸外切酶E识别双链状态下的THF位点，酶切启动，荧光基团与淬灭基团分离；第五步，探针被E酶切后，荧光释放，子链继续从探针的3’端进行合成，并延伸，新双链生成；指数扩增的实现依赖于ATP提供能量，使第6步不断循环继续。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
序列表
<110> 宁波匠神生物科技有限公司
<120> 常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒
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cctgaacccc agcgccgtgg ccacggccgc g 31
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
gagctcctca tctcgcgcga cctcatcgag 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
cggccagcgc gtctcggcgc gcatgctcgg 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
ccccagctta aagtagcgcc ggtggttgcc 30

Claims (7)

1.一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物和探针，其特征在于，上下游引物和探针的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，具体如下：
上游引物：GCCGCCTGGTGCGAGCTGCAGAACAAGGACC；
下游引物：CCAGCGGGCGGCTGTAGCACGTGCCGCGCTC；
探针：
CCATCTCGCGGTGCGTGGAGGTGCGCGGCGGCG[F]G[H][B]CGTGCAGAACTCCATG—SpacerC3；
其中，F为荧光基团，H为四氢呋喃位点，B为猝灭基团，3’末端为SpacerC3修饰。
2.一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，该试剂还包括反应液，所述反应液包括聚乙二醇(PEG)、Tris、乙酸钾、三磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、脱氧核糖核苷三磷酸、蔗糖、甘油、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白和核酸外切酶。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述反应液经冻干后保存，常温恒温快速检测伪狂犬病病毒时再溶于双蒸水使用；所述冻干条件为：在-80℃条件下预冻3-4小时，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，先于-20～-45℃干燥2-10小时。
5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述重组酶选自T4噬菌体重组酶uvsX或大肠杆菌(E.coli)重组酶RecA；所述单链DNA结合蛋白选自T4或E.coli的gp32；所述DNA聚合酶选自Phi-29聚合酶、枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)、Bst聚合酶或E.coli的DNA聚合酶IKlenow大片段；所述辅助蛋白为T4噬菌体uvsY蛋白；所述核酸外切酶选自E.coli的核酸外切酶exoIII或exoIV。
6.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述反应液中各组分的浓度为：重组酶210-290ng/μl；单链DNA结合蛋白190-270ng/μl；DNA聚合酶80-160ng/μl；辅助蛋白60-110ng/μl；核酸外切酶70-130ng/μl；聚乙二醇(PEG)2-4％；Tris 20-40mM；乙酸钾(KAc)100-140mM；酸磷酸腺苷(ATP)2-4mM；磷酸肌酸二钠盐(Creatinephosphatedisodiumsalt，PCr)40-60mM；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)250-300μM；蔗糖5-8％；甘油20-40％。
7.一种常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6中任一项所述的试剂。
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