CN111621579A - 常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于副溶血弧菌检测技术领域，提供了一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物和探针。本发明还提供一种包括上述引物和探针的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂和方法。本发明可以在常温等温条件下，对副溶血性弧菌进行快速、实时、特异性检测。通过特异性引物、特异性荧光探针、4种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

Description

常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法

技术领域

本发明涉及副溶血弧菌检测技术领域，尤其涉及一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)隶属弧菌科，弧菌属，革兰阴性嗜盐菌，多形态杆菌或稍弯曲弧菌，1950年，被日本Fujino等学者首次分离得到，命名为副溶血性溶血巴斯德氏菌。1955年，Takikawa等由于发现它具有耐盐性，鉴定为嗜盐菌，直至1963年Sakazaki等将其定名为副溶血弧菌。

副溶血性弧菌为多形态菌，常见的有弧状、卵圆状、棒状或丝状，多为不规则分布，偶尔成对，有鞭毛，不产芽胞与荚膜。该菌长约1.4-2.4μm，宽约0.5-0.8μm。副溶血性弧菌有两种鞭毛形式：丛生鞭毛和单端鞭毛。能够在0.5～8.0％盐度和5～44℃范围内生长，其最佳生长盐度和温度分别为3％和35℃。最佳生长pH为7.7。根据抗原结构可将副溶血性弧菌分为13个群(O抗原)和65个型(K抗原)。由于该菌是一种嗜盐性菌，在无盐环境下不能生长。因此副溶血性弧菌一般存在于海产品中。

副溶血性弧菌中的致病性基因—耐热直接溶血素(tdh)和溶血相关的溶血素(trh)被确认为主要的毒力基因。其中，tdh具有直接的溶血活性，它可以使多种哺乳动物的红细胞发生溶血现象，能够破坏溶酶体和细胞膜，并在细胞膜上形成小孔通道使细胞内外离子浓度发生不正常的变化，从而使细胞发生病理和形态学的改变，进而导致细胞的膨胀甚至死亡。trh具有与tdh相似的免疫原性和生物活性，也会导致相似的生理学病变，故将其命名为耐热直接溶血相关毒素。

副溶血弧菌广泛分布于沿海国家和地区和河口海区的海水以及鱼、虾、蟹、贝类等生物体中，其致病性受宿主的生理状及水体环境条件等综合因素的影响较大，主要通过消化道感染，属于肠道条件致病菌的一种。病人主要通过食用生的或未充分加热的海产品而出现恶心、呕吐、腹泻、发热等胃肠炎反应，严重者可引起全身痉挛、脱水、循环系统衰竭、败血症等症状而致死亡。

目前对副溶血性弧菌检测的方法：细菌培养法、显色培养法、免疫学方法、多管发酵法、核酸扩增检测法、核酸杂交法等。分子生物学检测方法可以快速准确的进行病原体检测，可用于VP的诊断，目前国内外已经建立了一些VP的检测方法。例如：IgM捕获和IgGELISAs技术，PCR技术，套式PCR技术，LAMP技术等等。这些技术耗时相对较长，而且对副溶血弧菌检测的灵敏度上有待进一步优化。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法，其可以常温等温条件下，对副溶血性弧菌进行快速、实时、特异性检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物和探针，上下游引物和探针的序列具体如下：

上游引物VP-4-F：CAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAAC

下游引物VP-4-R：GTAAACAAGGTGTTTGCTGGTTTGTAGTTCTTC

探针VP-Probe：

CATCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGC(F)G(H)(B)TCTTAGGTCACTTCTC—SpacerC3。

本发明所述的常温等温，是指维持在某一特定的温度，温度为22-42℃，接近常温，温度保持恒定。

本发明的特异性引物，是针对副溶血性弧菌的不耐热溶血毒素(TLH)基因设计的单链DNA。有两条单链DNA组成一对引物，特异性地识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30-35核苷酸(nt)之间，引物中无回文结构、连续重复序列和内部二级结构区；引物设计不考虑Tm值；最佳引物对需通过试验优化筛选出，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

参见图1，荧光基团和淬灭基团之间相距1-4nt，exo是一种核酸外切酶，能够识别THF与碱基不匹配位点，进行酶切反应，使得荧光基团和淬灭基团分离开，荧光基团发射的荧光信号不会被淬灭基团吸收，这样荧光信号得以被检测出。本发明的特异性荧光探针，是针对副溶血性弧菌的TLH基因设计的寡核苷酸长链。寡核苷酸单链专一性识别副溶血性弧菌的TLH基因序列的某一区域，不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有四个修饰位点，距离5’端的30-35nt的中部位置标记一个空间位阻(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为1-4nt；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG或C3-spacer，用于抑制DNA聚合酶从3’末端开始延伸；探针的Tm值不作为设计的主要考虑因素；荧光基团的种类较多，例如FAM、Cy3、HEX、ROX、JOE、VIC、TAMRA或Cy5等，淬灭基团可选择BHQ1或BHQ2(最大限度地降低背景荧光噪音为原则)。

为实现上述目的，本发明还提供一种常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，包括如上所述的引物和探针。

根据本发明的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，所述试剂包括聚乙二醇、Tris、乙酸钠、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸、海藻糖、甘露醇、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶和核酸外切酶。

根据本发明的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，所述试剂的制备方法包括：将反应液在-80℃条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂；

将预冻试剂先置于-35～-45℃环境下干燥2～10小时，再置于10～18℃环境下干燥1～2小时，得到冻干粉。

根据本发明的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，在反应液中，各组份的浓度范围如下：重组酶520-725ng/μl；单链DNA结合蛋白100-200ng/μl；DNA聚合酶350-450ng/μl；核酸外切酶300-400ng/μl。

本发明所述的试剂为固体状况，通过真空冷冻干燥获得。冷冻干燥处理是一种将液体试剂在超低温条件下进行干燥处理，使液体中的水分升华，直接得到固体试剂的过程，固体试剂便于存储和运输，减少运输过程中酶活性降低的几率。具体的说，本发明将反应混合物分装于反应管中，在-80℃条件下预冻70-100分钟，预冻结束后放入真空冷冻干燥仪中进行干燥，其过程分为主干燥(-30～-40℃，2-10小时)和终末干燥(10-20℃，1-2小时)两个阶段，两个阶段的干燥时间取决于样品的数量；冷冻干燥后的成品需为白色固体并依附在反应管壁，加入液体后可迅速溶解，无任何颗粒状残留物。

本发明试剂中的4种工程酶分别为：重组酶recA，单链DNA结合蛋白，DNA聚合酶和核酸外切酶，是一系列具备特定功能的基因工程酶，具有以下特征：(1)每种基因工程酶都来源于自然界常见菌中，具备所需的特定的功能，通过基因工程改造、重组构建、发酵表达、纯化以及活性检测等一系列流程后，变成可工业化生产的高纯度、高活性的酶蛋白；(2)每种酶在扩增反应过程中的作用不同，它们的相互合作可以在常温恒温的条件下快速扩增目标核酸片段；(3)重组酶recA，来源于大肠杆菌(E.coli)；(4)单链DNA结合蛋白，来源于T4或E.coli的gp32；(5)DNA聚合酶的来源较多，例如Phi-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)、Bst聚合酶或者E.coli的DNA聚合酶I Klenow大片段；(6)核酸外切酶，来源于E.coli的核酸外切酶exo III或exo IV；(7)每种酶蛋白在反应体系中的最适浓度范围分别为：重组酶，520-725ng/μl；单链DNA结合蛋白，100-200ng/μl；DNA聚合酶，350-450ng/μl；核酸外切酶，300-400ng/μl。

试剂中的其它组分，是维持酶促反应最适条件的多种化合物的混合物，具体的：(1)这些组分的最适浓度范围分别为：聚乙二醇(PEG)，4-5％；Tris，20-30mM；乙酸钠(NaAc)，200-240mM；二硫苏糖醇(DTT)，8-10mM；酸磷酸腺苷(ATP)，8-10mM；磷酸肌酸二钠盐(Creatine phosphate disodium salt，PCr)，80-100mM；磷酸肌酶(Creatine kinase，CK)，80-120ng/μl；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，450-500μM；海藻糖(Trehalose)，10-12％；甘露醇(Mannitol)，40-50ng/μl；(2)这些组分为反应提供酶的辅因子、盐离子浓度、酸碱度、能量、原料，真空冷冻干燥处理过程和存储阶段中提供保护剂。

为实现上述目的，本发明还提供一种通过如上所述试剂实现的常温等温快速检测副溶血弧菌的方法，所述方法包括：

在装有所述试剂的反应管中加待检样本、双蒸水和缓冲液；

置于一温控设备中孵育15～25分钟，再通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测。

根据本发明的常温等温快速检测副溶血弧菌的方法，所述温控设备保持一恒定温度值，且该恒定温度值在20-39℃范围内。

所述常温的温度为20-39℃，扩增过程中保持均一恒定温度；整个检测过程反应管保持密闭。

本发明检测核酸目标物的方法，是一种在常温等温条件下，通过特异性引物、特异性荧光探针、4种工程酶、其它化学组分的共同作用下，利用具备荧光检测功能的仪器实现核酸目标物的快速检测的方法，检测过程为封闭式可以有效防止气溶胶污染；可以兼容常见的荧光检测设备。

常温等温条件，是指不依赖精确控温的精密仪器完成核酸扩增的反应。本发明的方法只需要维持恒定温度，可以在简易的温控设备上实现扩增反应，例如金属浴、水浴或者恒温箱；反应温度可以设置在20-39℃之间；由于温度正相关于酶的催化速率，针对于DNA而言，荧光反应的最佳温度在37-39度之间。

具备荧光检测功能的仪器，指可以同时实时检测多个位点的荧光信号的设备或平台，具有荧光检测通道，具有加热模块，可以维持反应所需的常温等温条件。

本发明的检测方法适合应用于多种荧光检测设备，检测方法的结果可以通过不同类型的荧光检测设备进行判读。结果判读方式：前3分钟样本检测的荧光值的均值计算出样本的标准偏差值，该样本的检测阈值线为前3分钟样本检测荧光均值加上三倍该样本的标准偏差值(单位：荧光强度，mV)；当扩增曲线与阈值线相交后，并在随后的1分钟内曲线斜率大于30mV/分钟，则可视为阳性扩增；如果扩增曲线与该阈值线在反应时间内无任何交点，则视为阴性扩增。

本发明采用闭管检测，一次性加样后，整个检测过程反应管保持密闭，能有效防止气溶胶所引起的假阳性干扰，反应结束后防止扩增子扩散污染环境。

参见图2，本发明的反应第一步，重组酶与引物结合形成酶-引物复合体，开始模板扫描；第二步，找到匹配区域后，在单链结合蛋白的帮助下，进行重组反应，使得引物与母链互补配对；第三步，酶-引物复合体解体，重组酶脱落，DNA聚合酶进入引物的3’端区域，开始从3’端进行子链延伸；第四步，如此循环，子链的不断积累；第五步，荧光探针找到匹配区域进行重组，核酸外切酶识别双链状态下的THF位点，酶促反应启动，荧光基团与淬灭基团分离；第六步，探针被核酸外切酶切后，荧光释放，荧光检测设备读取荧光信号。本发明检测方法的工作，是一种借助酶促反应打开双链核酸的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。在37-39℃恒温下，重组酶与引物形成复合物，该复合物非特异地结合在DNA链上并检索同源区域；找到匹配区域后，在单链DNA结合蛋白的辅助下进行同源重组，重组酶从引物上脱落，同时DNA聚合酶结合引物的3’端并进行子链的延伸；因为DNA聚合酶的链置换活性，新合成的子链替代同源母链的位置，与母链形成双链结构；由于上下游引物的限制，重组酶-引物复合物在下一轮扩增起始阶段，缩短了匹配时间，可以快速地合成新的子链；当双链DNA被打开之后，特异性荧光探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此荧光探针嵌入新生成的子链中；在新生成的DNA双链中，由于荧光探针的嵌入，在荧光探针的THF区域出现未与母链配对的碱基，核酸外切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团的荧光信号得以释放。每合成一条扩增子都会有荧光探针的结合，因此荧光检测设备记录的荧光信号与生成子链的数量呈一一对应关系，所以新方法记录的荧光信号也是积累的荧光。

本发明具有以下技术优势：

1)常温等温反应：与常规的PCR技术相比，常温等温反应降低了对仪器加热模块的要求，也减少了对制冷模块的需求，因此仪器的选择面更加宽广。对于配套荧光仪器的设计可以趋于小型化与便携化，而且对于使用者的操作要求更加简易，可以应用于多种场景。

2)反应快速：多酶恒温快速扩增技术是利用多种工程酶在特定的溶液环境下，模拟生物体内的核酸扩增反应的过程，大大缩短了扩增过程所需的时间。相对于荧光定量PCR，扩增反应时间由1.5-3小时缩短至10-25分钟，明显提高了扩增效率。

3)实时检测：与猝灭基团分离的荧光基团和新合成的子链在数量上是一一对应的，随着扩增反应的推进荧光信号是累积的，荧光仪采集的荧光信号是一个变化的过程，从而实现实时监测的效果。

4)定性与定量检测：通过采集的荧光信号绘制的扩增曲线可以用于对检测结果的判定。定性检测可以根据扩增曲线的线性快速判断，S型曲线表示阳性样本，平直曲线表示阴性样本；半定量检测可以根据扩增曲线与阈值线相交的时间，初步判断不同待检样本中目标核酸浓度的高低，例如时间值小的样本中目标核酸量高于时间值大的样本中目标核酸量；定性检测可以根据已知浓度的拷贝数绘制标准曲线，计算出未知样本的核酸的拷贝数。

5)特异性和敏感性：每对引物和荧光探针只能与目标核酸物进行特异性结合，因此检测准确而且专一。已有实验数据表明，在20分钟内，对副溶血性弧菌检测的灵敏度都高达1×102拷贝/μl的检测级别。

6)检测过程简易：主要反应组分配制后分装至反应管中，经过真空冷冻干燥后制成固体状态。反应前期准备只需要添加待检样本核酸和缓冲液，混匀后即可启动扩增反应，所以对实验技能要求较低，简单培训实验人员即可完成操作。扩增反应完成后结果的定性判定也较为简单易懂，根据图形的形状可以做出判断。

7)应用范围广：具有常温、等温、快速、灵敏、特异、操作简便等特点，新方法适用多种荧光检测设备，例如荧光定量PCR、酶标仪、ESEQuant Tube Scanner、恒温荧光仪等，也可应用于微流控检测平台。

附图说明

图1是本发明的荧光探针结构示意图；

图2是本发明的反应原理图；

图3是引物对扩增效果影响的电泳图谱；

图4是扩增灵敏度实验的电泳图谱；

图5是扩增灵敏度实验的荧光图谱；

图6是特异性的荧光图谱；

图7为样本检测的荧光图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：引物的筛选

参考GenBank上已公布的VP tlh基因序列，本申请发明人对VP的TLH的基因组与功能等信息进行了较为深入的研究，所有的VP分离株都含有不耐热溶血素，这种溶血素是VP所特有的，因此它的编码基因tlh基因场被作为检测VP的靶基因。大量实验表明，不同的引物对恒温扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，针对VP的tlh基因设计了四对不同的引物：VP-1、VP-2、VP-3、VP-4，如下表一所示。

表一

图3是本发明引物对扩增效果影响的电泳图谱。从图3上可以看出，不同的引物对扩增效果是有影响的，其中引物VP-4的亮度最佳，扩增效率最佳。然后针对引物VP-4进行梯度测试，结果显示如图4所示，模板浓度为102copies/μL(图中泳道7和8)时也有微弱条带出现，引物VP-4的敏感性较佳。

根据上述的实验结果，选择引物VP-4作为荧光检测实验的引物。根据引物VP-4对应的基因序列，设计了一条荧光探针VP-Probe，探针序列如下。

VP-Probe：

CATCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGC(F)G(H)(B)TCTTAGGTCACTTCTC—SpacerC3；

其中，F为荧光基团，H为四氢呋喃，B为淬灭基团，3’末端标记C3间臂。

实施例二：荧光检测

本实施例用于说明在荧光仪器上进行的常温恒温荧光反应。

1.根据NCBI GenBank上已经公布副溶血性弧菌(VP)tlh基因序列，基于引物与荧光探针设计原则，依据副溶血性弧菌tlh基因序列设计了一对引物(VP-4-F和VP-4-R)和一条荧光探针(VP-Probe)，序列下如表二所示：

表二

其中，F为荧光基团，H为四氢呋喃，B为淬灭基团，3’末端标记C3间臂。

2.扩增反应体系为：

表三

*备注：冻干粉试剂包含上述必要的酶和辅助组分。

3.扩增反应程序：39度恒温，20分钟。

用RNase Free dH2O对VP模板进行10倍梯度稀释，用MIRA荧光检测试剂盒进行荧光实验，结果判断标准为荧光检测进行20min内有荧光信号的增加曲线，判断为阳性。如图5所示，1-6为引物VP-4在不同的模版浓度下的扩增效果(模板浓度分别为：1、2为104copies/μL；3、4为103copies/μL；5、6为102copies/μL；NTC为阴性对照)。该方法可以检测出102copies/μL的VP tlh基因的DNA模版为阳性。从图5上可以看出，104copies/μL的水平DNA模板量在7min左右就检测出增加的荧光信号，浓度更低的102copies/μL的DNA模板量在11min也可以检测出荧光信号的增加。而且在整个荧光检测过程中，阴性反应一直保持着较低的水平。

实施例三：特异性测试

用于测试所筛选引物的特异性，选择几种其他菌种，用引物VP-4-F、VP-4-R和VP-Probe检测，验证是否会出现非特异性扩增，判读假阳性结果。分别选择霍乱弧菌、鲍氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌和铜绿假单胞菌，以VP标准株ATCC33847为对比。结果如图6所示，该图中，1为VP标准株ATCC33847，2为霍乱弧菌，3为鲍氏志贺菌，4为鼠伤寒沙门菌，5为铜绿假单胞菌，NTC为阴性对照引物。可以看出，VP-4-F、VP-4-R和VP-Probe特异性较佳，未出现假阳性判读结果。

实施例四：不同血清型样本测试

由于副溶血性弧菌分为13个群(O抗原)，较佳的引物需要涵盖所有的血清类型。验证引物VP-4-F、VP-4-R和VP-Probe是否出现假阴性判读。利用收集到的不同血清型样本进行测试，当前收集到的样本类型有O1型样本、O3型样本、O4型样本、O7型样本、O9型样本和O10型样本。结果如图7所示，引物VP-4-F、VP-4-R和VP-Probe覆盖面较佳，未出现假阴性判读结果。

综上所述，本发明涉及一种在常温等温条件下，对副溶血性弧菌进行快速、实时、特异性检测的方法，通过特异性引物、特异性荧光探针、4种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 潍坊安普未来生物科技有限公司

<120> 常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法

<130> WF

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gctgacaatc gcttctcata caaccacacg atc 33

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

caccaacccc tgttagcgcg atgtattggt tc 32

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgcttctcat acaaccacac gatctggagc aac 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gtagttcttc gccagttttg cgtaggttaa g 31

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cacacgatct ggagcaacga cgcagcaatg cag 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gtacgaagaa acttgctcac caacccctgt tag 33

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

caacgacgca gcaatgcagc cagatcaaat caac 34

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gtaaacaagg tgtttgctgg tttgtagttc ttc 33

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

catcacaatg gcgcttccct aacccgaaca gcgtcttagg tcacttctc 49

Claims (8)

1.一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物和探针，其特征在于，上下游引物和探针的序列具体如下：

上游引物VP-4-F：CAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAAC

下游引物VP-4-R：GTAAACAAGGTGTTTGCTGGTTTGTAGTTCTTC

探针VP-Probe：

CATCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGC(F)G(H)(B)TCTTAGGTCACTTCTC—Spacer C3。

2.一种常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，其特征在于，所述试剂包括聚乙二醇、Tris、乙酸钠、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸、海藻糖、甘露醇、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶和核酸外切酶。

4.根据权利要求3所述的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，其特征在于，所述试剂的制备方法包括：

将反应液在-80℃条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂；

将预冻试剂先置于-35～-45℃环境下干燥2～10小时，再置于10～18℃环境下干燥1～2小时，得到冻干粉。

5.根据权利要求3所述的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，其特征在于，在反应液中，各组份的浓度范围如下：

重组酶520-725ng/μl；单链DNA结合蛋白100-200ng/μl；DNA聚合酶350-450ng/μl；核酸外切酶300-400ng/μl。

6.根据权利要求5所述的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂，其特征在于，在反应液中，各组份的浓度范围如下：

聚乙二醇，4-5％；Tris，20-30mM；乙酸钠，200-240mM；二硫苏糖醇，8-10mM；酸磷酸腺苷，8-10mM；磷酸肌酸二钠盐，80-100mM；磷酸肌酶，80-120ng/μl；脱氧核糖核苷三磷酸，450-500μM；海藻糖，10-12％；甘露醇，40-50ng/μl。

7.一种通过如权利要求3～6任一项所述试剂实现的常温等温快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，所述方法包括：

在装有所述试剂的反应管中加待检样本、双蒸水和缓冲液；

置于一温控设备中孵育15～25分钟，再通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测，检测过程保持反应管密闭。

8.根据权利要求7所述的常温等温快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，所述温控设备保持一恒定温度值，且该恒定温度值在20-39℃范围内。

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