CN112760395A - 一种基于荧光rma法多重检测肠道致病菌的引物探针组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于分子生物学技术领域，具体为一种基于荧光RMA法多重检测肠道致病菌的引物探针组、试剂盒及其检测方法，包括检测沙门氏菌的引物和探针、检测志贺氏菌的引物和探针、以及检测副溶血弧菌的引物和探针。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学技术领域，具体为一种基于荧光RMA法多重检测肠道致病菌的引物探针组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
肠道致病菌是指除大肠正常菌群之外可以导致疾病发生的菌种，主要有沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、艰难梭菌(Clostridium difficile)及大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)等。当致病菌进入体内大量繁殖会引起机体的一系列肠道反应，严重威胁着人类的健康，同时肠道致病菌引起的传染病是危害公共卫生安全的主要因素。在临床中对肠道致病菌实施快速正确的检验，对医生迅速获得患者感染信息、快速明确诊断疾病、及时采取合理有效的治疗措施以及防止抗生素的滥用方面有着重要的意义。
目前肠道致病菌的检测主要有以下几种方法：培养法、免疫学方法、分子生物学方法等。培养法步骤繁琐且需要数天才能得到结果，灵敏度偏低，容易发生错检和漏检。免疫学方法也存在需对样品进行浓缩来提高菌液浓度以及结果的假阳性率偏高等问题。分子生物学检测方法存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点。重组酶介导扩增(RecombinaseMediated Amplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现肠道致病菌的快速检测。
本发明在荧光RMA法的基础上开发了联合检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌三种常见肠道致病菌的试剂盒，大大缩短了检测时间，为肠道致病菌的诊断提供了更敏感、更快速的方法。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法多重检测肠道致病菌的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于荧光RMA法多重检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌的引物探针组，包括检测沙门氏菌的引物和探针、检测志贺氏菌的引物和探针、以及检测副溶血弧菌的引物和探针，其中：
(1)沙门氏菌引物和探针序列为：
上游引物：
5’-GAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTG-3’；
下游引物：
5’-AATCAGGAAATTTCGCTTCCAGTTGGTCCAGCA-3’；
探针：
5’-AGAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATG(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)GCGGAACGCGCTTGA(C3-spacer)-3’。
(2)志贺氏菌引物和探针序列为：
上游引物：
5’-AGGCAATTCAGGCAAGACAGTAAGGCGATTACC-3’；
下游引物：
5’-ATTGAGAACAGGCTCCCGGGTATCCAGACAT-3’；
探针：
5’-TGATGGAAGCTCTGGTAACGTCTCCAGAC(JOE-dT)A(THF)(BHQ1-dT)AAAACGTGCCGAGAGT(C3-spacer)-3’。
(3)副溶血弧菌引物和探针序列为：
上游引物：
5’-TTCATGTTGATGACACTGCCAGATGCGACGA-3’；
下游引物：
5’-AATCGACAGACGATGAGCGGTTGATGTCCAAAC-3’；
探针：
5’-AGACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGG(CY5-dT)(THF)(BHQ2-dT)CGTGAACGCAAGTGA(C3-spacer)-3’。
优选的，所述沙门氏菌的检测探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；所述志贺氏菌的检测探针上标记的荧光报告基团是JOE，荧光淬灭基团是BHQ1；所述副溶血弧菌的检测探针上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。
一种基于荧光RMA法多重检测肠道致病菌的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。
所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。
所述标准阳性质粒为含有沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌基因片段的重组质粒，用于沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌核酸检测的阳性对照。
所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
一种基于荧光RMA法多重检测肠道致病菌的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的DNA，待测样本为患者粪便、肛拭子、呕吐物和分离培养物。
(2)设计用于沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌检测的引物对及探针。
(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述肠道致病菌检测用的引物对和探针进行荧光RMA扩增反应。扩增反应在温度设定为42℃的实时荧光检测仪中进行，反应时间为20min。
(4)结果分析：在荧光RMA扩增反应过程中，通过实时荧光采集，在扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌的阴、阳性。若待检样本包含沙门氏菌，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含志贺氏菌，则标记JOE的探针产生荧光信号；若待检样本包含副溶血弧菌，则标记CY5的探针产生荧光信号。这样，同一反应管内可确定三种病原体。
本申请能在同一反应管内同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌三种常见肠道致病菌的核酸，同时采用冻干工艺，提高试剂稳定性，只需一次加样、一步操作，节省检测时间，降低检测成本，同时减少患者不便，减轻患者经济负担。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1荧光RMA法检测沙门氏菌的灵敏度实验；
图2荧光RMA法检测志贺氏菌的灵敏度实验；
图3荧光RMA法检测副溶血弧菌的灵敏度实验；
图4荧光RMA法检测沙门氏菌的特异性实验；
图5荧光RMA法检测志贺氏菌的特异性实验；
图6荧光RMA法检测副溶血弧菌的特异性实验。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、阳性标准质粒的制备
提取沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌的DNA，作为模板，对沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒。
2、荧光RMA引物与探针的设计
针对沙门氏菌invA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血弧菌tlh基因的分别设计了荧光RMA引物与探针，具体如表1所示：
表1引物与探针序列
注：沙门氏菌检测探针的荧光基团用FAM修饰，志贺氏菌检测探针的荧光基团用JOE修饰，副溶血弧菌检测探针的荧光基团用CY5修饰，淬灭基团用BHQ1/2修饰，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。
3、荧光RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的病原体DNA模板加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于实时荧光检测仪中，在42℃反应20min，每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照；
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态；
所述扩增反应试剂包括RMA引物对及检测探针组、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；
所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；
所述标准阳性质粒为含有沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌基因片段的重组质粒，用于沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌核酸检测的阳性对照；
所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应；
4、结果判读
根据是否产生相应的荧光信号，分析待测样本中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌。仅产生标记FAM的荧光信号表示为沙门氏菌阳性；仅产生标记JOE的荧光信号表示为志贺氏菌阳性；仅产生标记CY5的荧光信号表示为副溶血弧菌阳性；
5、荧光RMA法检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌的灵敏度分析
将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括105、104、103、102和101拷贝/反应)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光RMA反应，每个浓度重复3次试验。根据图1-3可知，105-102结果均为阳性。即，荧光RMA法检测试剂盒的灵敏度达到102个拷贝/反应；
6、荧光RMA法检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌的特异性分析
用建立的荧光RMA方法分别检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、艰难梭菌及大肠埃希氏菌等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图4-6可知，若仅标记FAM的探针产生荧光信号，则检测为沙门氏菌阳性，而对志贺氏菌、副溶血弧菌和其他病原体检测为阴性；若仅标记JOE的探针产生荧光信号，则检测为志贺氏菌阳性，而对沙门氏菌、副溶血弧菌和其他病原体检测为阴性；若仅标记CY5的探针产生荧光信号，则检测为副溶血弧菌阳性，而对沙门氏菌、志贺氏菌和其他病原体检测为阴性。说明该荧光RMA法具有良好的检出效果和特异性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
<120> 一种基于荧光RMA法多重检测肠道致病菌的引物探针组、试剂盒及其检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella)
<400> 1
gagggcctgg acgataacag catcgtattg ttg 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella)
<400> 2
aatcaggaaa tttcgcttcc agttggtcca gca 33
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(Salmonella)
<400> 3
agagggggag aaactccggg agcttggcta tgtgttgcgg aacgcgcttg a 51
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 志贺氏菌(Shigella)
<400> 4
aggcaattca ggcaagacag taaggcgatt acc 33
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 志贺氏菌(Shigella)
<400> 5
attgagaaca ggctcccggg tatccagaca t 31
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 志贺氏菌(Shigella)
<400> 6
tgatggaagc tctggtaacg tctccagact attaaaacgt gccgagagt 49
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 7
ttcatgttga tgacactgcc agatgcgacg a 31
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 8
aatcgacaga cgatgagcgg ttgatttgat gtccaaac 38
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
<400> 9
agacgctaac ttctgcgcca gaagagcacg gtttcgtgaa cgcaagtga 49
Claims (2)
1.一种基于荧光RMA法多重检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌的引物探针组，其特征在于，包括检测沙门氏菌的引物和探针、检测志贺氏菌的引物和探针、以及检测副溶血弧菌的引物和探针，其中：
(1)沙门氏菌引物和探针序列为：
上游引物：
5’-GAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTG-3’；
下游引物：
5’-AATCAGGAAATTTCGCTTCCAGTTGGTCCAGCA-3’；
探针：
5’-AGAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATG(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)GCGGAACGCGCTTGA(C3-spacer)-3’。
(2)志贺氏菌引物和探针序列为：
上游引物：
5’-AGGCAATTCAGGCAAGACAGTAAGGCGATTACC-3’；
下游引物：
5’-ATTGAGAACAGGCTCCCGGGTATCCAGACAT-3’；
探针：
5’-TGATGGAAGCTCTGGTAACGTCTCCAGAC(JOE-dT)A(THF)(BHQ1-dT)AAAACGTGCCGAGAGT(C3-spacer)-3’。
(3)副溶血弧菌引物和探针序列为：
上游引物：
5’-TTCATGTTGATGACACTGCCAGATGCGACGA-3’；
下游引物：
5’-AATCGACAGACGATGAGCGGTTGATGTCCAAAC-3’；
探针：
5’-AGACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGG(CY5-dT)(THF)(BHQ2-dT)CGTGAACGCAAGTGA(C3-spacer)-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于荧光RMA法多重检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌的引物探针组，其特征在于，所述沙门氏菌的检测探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；所述志贺氏菌的检测探针上标记的荧光报告基团是JOE，荧光淬灭基团是BHQ1；所述副溶血弧菌的检测探针上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。
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| CN202110224757.9A CN112760395A (zh) | 2021-03-01 | 2021-03-01 | 一种基于荧光rma法多重检测肠道致病菌的引物探针组、试剂盒及其检测方法 |
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- 2021-03-01 CN CN202110224757.9A patent/CN112760395A/zh active Pending
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