CN112725541A - 一种基于荧光rma法检测肠道病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种基于荧光rma法检测肠道病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于生物技术检测领域，具体为一种基于荧光RMA法检测肠道病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法，引物探针组包括检测柯萨奇病毒A16型的引物和探针、检测肠道病毒71型的引物和探针；所述柯萨奇病毒A16型的检测探针1上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述肠道病毒71型的检测探针2上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。

Description

一种基于荧光RMA法检测肠道病毒的引物探针组、试剂盒及其 检测方法
技术领域
本申请属于生物技术检测领域，具体为一种基于荧光RMA法检测肠道病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
手足口病是一种由肠道病毒(Enterovirus，EV)感染引起的儿童常见传染病，主要的病原体是柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)。婴幼儿及学龄前儿童易感，少部分的手足口病例可并发严重的神经系统疾病，包括脑膜炎、病毒性脑炎、心肌炎等，甚至导致死亡。而CA16感染引起的手足口病与EV71感染所引起的手足口病在临床症状等方面难以区别，因此准确鉴别两种病毒并对疾病的诊疗和预后判断有重要的临床意义。
目前肠道病毒的检测主要有以下几种方法：病毒分离、血清学检测、分子生物学方法等。病毒分离技术操作难度大、周期长，容易导致污染，不适合临床使用。常规的血清学方法检测抗体仅是一个反映感染的间接指标，不能替代直接的病原学检测，无法明确诊断感染病毒的种类。实时荧光PCR法需要经历变温过程，扩增反应时间长，且需要昂贵的仪器设备，以及对检测人员的技术要求较高，不适用于现场快速检测及基层普及应用。重组酶介导扩增(Recombinase MediatedAmplification,RMA)技术，是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的等温核酸扩增技术，被认为是可替代PCR的核酸检测技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平，可实现肠道病毒的快速检测。
本发明在荧光RMA法的基础上开发了同时检测柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)的试剂盒，大大缩短了检测时间，为肠道病毒的分型诊断提供了更敏感、更快速的方法。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法检测肠道病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于荧光RMA法检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型引物探针组，包括检测柯萨奇病毒A16型的引物和探针、检测肠道病毒71型的引物和探针，其中：
(1)柯萨奇病毒A16型(CA16)引物和探针序列为：
CA16-F：
5’-TACAATGCCCACCACGGGTACACAGAATACAGA-3’；
CA16-R：
5’-CAAGCAAACGAATCTCTGGAAGTGGGTTTCGGA-3’；
CA16-P：
5’-AGCCAAACCCAATGGCGAGCTAGTCCCACAA(VIC-dT)(THF)AC(BHQ1-dT)GCAGTACATGTATGT(C3-spacer)-3’。
(2)肠道病毒71型(EV71)引物和探针序列为：
EV71-F：
5’-AAACACCCAAGTGAGCAGTCATCGCTTAGACAC-3’；
EV71-R：
5’-TCTATCTCCCCAACTAAGCCTGCTCTGCTGAAG-3’；
EV71-P：
5’-ACCAGCACTTCAAGCCGCCGAAATCGGAGC(CY5-dT)(THF)CG(BHQ2-dT)CGAATGCTAGTGAT(C3-spacer)-3’。
优选的，所述柯萨奇病毒A16型的检测探针1上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述肠道病毒71型的检测探针2上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。
一种基于荧光RMA法检测肠道病毒的试剂盒，该试剂盒中包括有：含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。
优选的，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。
优选的，所述扩增反应试剂包括柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型引物探针组、M-MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。
优选的，所述标准阳性质粒为含有CA16和EV71基因片段的重组质粒，用于CA16和EV71核酸检测的阳性对照。
优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
优选的，所述试剂盒可以检测的样品为患者粪便、肛拭子、呕吐物、疱疹液或病毒分离培养物等。
一种基于荧光RMA法检测肠道病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的RNA。
(2)设计用于CA16和EV71检测的引物对及探针。
(3)以提取的待测样本RNA作为模板，加入上述CA16和EV71检测用的引物对和探针进行荧光RMA扩增反应。扩增反应在温度设定为42℃的实时荧光检测仪中进行，反应时间为20min。
(4)结果分析：在荧光RMA扩增反应过程中，通过实时荧光采集，在扩增结束后，根据是否产生荧光信号判断CA16和EV71的阴、阳性。若待检样本包含CA16，则标记VIC的探针产生荧光信号；若待检样本包含EV71，则标记CY5的探针产生荧光信号。这样，同一反应管内可同时确定两种肠道病毒。
有益效果：(1)本发明能在同一反应管内同时检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型，提高了检测效率；(2)整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法气溶胶污染造成的假阳性结果；(3)采用冻干工艺，提高试剂稳定性，只需一次加样、一步操作，节省检测时间，降低检测成本，同时减少患者不便，减轻患者经济负担。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1荧光RMA法检测柯萨奇病毒A16型的灵敏度实验；
图2荧光RMA法检测肠道病毒71型的灵敏度实验；
图3荧光RMA法检测柯萨奇病毒A16型的特异性实验；
图4荧光RMA法检测肠道病毒71型的特异性实验。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、阳性标准质粒的制备
提取CA16和EV71的RNA为模板，对CA16和EV71的特异性基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒。
2、荧光RMA引物与探针的设计
针对CA16和EV71的VP1基因分别设计了荧光RMA引物与探针，具体如表1所示：
表1引物与探针序列
Figure BDA0002956355250000051
注：CA16检测探针的荧光基团用VIC修饰、淬灭基团用BHQ1修饰，EV71检测探针的荧光基团用CY5修饰、淬灭基团用BHQ2修饰，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。
3、荧光RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的病原体RNA模板加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，将上述反应管放置于实时荧光检测仪中，在42℃反应20min。每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照；
所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态；
所述扩增反应试剂包括柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型引物探针组、M-MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；
所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；
所述标准阳性质粒为含有CA16和EV71基因片段的重组质粒，用于CA16和EV71核酸检测的阳性对照；
所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应；
4、结果判读
根据是否产生相应的荧光信号，分析待测样本中是否含有CA16和EV71。仅产生标记VIC的荧光信号表示为CA16阳性；仅产生标记CY5的荧光信号表示为EV71阳性；
5、荧光RMA法检测CA16和EV71的灵敏度分析
将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括5×104、5×103、5×102、5×101和5拷贝/反应)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光RMA反应，每个浓度重复3次试验。根据图1-2可知，5×104-5×101结果均为阳性。即，荧光RMA法检测试剂盒的灵敏度达到5×101个拷贝/反应；
6、荧光RMA法检测CA16和EV71的特异性分析
用建立的荧光RMA方法分别检测柯萨奇病毒A16型(CA16)、肠道病毒71型(EV71)、埃可病毒(ECHO)、轮状病毒(RV)、诺如病毒(NV)等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图3-4可知，若仅标记VIC的探针产生荧光信号，则检测为CA16阳性，而对EV71和其他病原体检测为阴性；若仅标记CY5的探针产生荧光信号，则检测为EV71阳性，而对CA16和其他病原体检测为阴性。说明该荧光RMA法具有良好的检出效果和特异性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
<120> 一种基于荧光RMA法检测肠道病毒的引物探针组、试剂盒及其检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 柯萨奇病毒(Coxsackie virus A16)
<400> 1
tacaatgccc accacgggta cacagaatac aga 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 柯萨奇病毒(Coxsackie virus A16)
<400> 2
caagcaaacg aatctctgga agtgggtttc gga 33
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 柯萨奇病毒(Coxsackie virus A16)
<400> 3
agccaaaccc aatggcgagc tagtcccaca attactgcag tacatgtatg t 51
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 肠道病毒71型(Enterovirus 71)
<400> 4
aaacacccaa gtgagcagtc atcgcttaga cac 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 肠道病毒71型(Enterovirus 71)
<400> 5
tctatctccc caactaagcc tgctctgctg aag 33
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 肠道病毒71型(Enterovirus 71)
<400> 6
accagcactt caagccgccg aaatcggagc ttcgtcgaat gctagtgat 49

Claims (2)

1.一种基于荧光RMA法检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型引物探针组，其特征在于，包括检测柯萨奇病毒A16型的引物和探针、检测肠道病毒71型的引物和探针，其中：
(1)柯萨奇病毒A16型(CA16)引物和探针序列为：
CA16-F：
5’-TACAATGCCCACCACGGGTACACAGAATACAGA-3’；
CA16-R：
5’-CAAGCAAACGAATCTCTGGAAGTGGGTTTCGGA-3’；
CA16-P：
5’-AGCCAAACCCAATGGCGAGCTAGTCCCACAA(VIC-dT)(THF)AC(BHQ1-dT)GCAGTACATGTATGT(C3-spacer)-3’。
(2)肠道病毒71型(EV71)引物和探针序列为：
EV71-F：
5’-AAACACCCAAGTGAGCAGTCATCGCTTAGACAC-3’；
EV71-R：
5’-TCTATCTCCCCAACTAAGCCTGCTCTGCTGAAG-3’；
EV71-P：
5’-ACCAGCACTTCAAGCCGCCGAAATCGGAGC(CY5-dT)(THF)CG(BHQ2-dT)CGAATGCTAGTGAT(C3-spacer)-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于荧光RMA法检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型引物探针组，其特征在于，所述柯萨奇病毒A16型的检测探针1上标记的荧光报告基团是VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述肠道病毒71型的检测探针2上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。
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