CN113528707A - 一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法。该试剂盒为基于MIRA荧光法的乙型流感病毒核酸检测试剂盒。其中，MIRA的引物是根据乙型流感病毒的特异病毒核蛋白(NP)保守序列设计的，本发明提供了一种快速、特异、灵敏、无需复杂仪器设备的核酸检测试剂盒及其使用方法。

Description

一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于分子诊断生物学技术领域，涉及一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

乙型流行性感冒(流感)病毒(B.parapertussis)是引起流感疾病发生和流行的主要病原之一，至今为止发现只有一个亚型，宿主特异性较强，至今发现其只能感染人和海豹，一般不引起世界范围内的大流行，但是它能够引起地区性、季节性的流行。其引发的症状与其他呼吸道传染疾病难以准确区分，需要实验室检测以支持后续工作。因此，准确鉴定和区分乙型流感病毒和其他病毒的种类对于确定和优化治疗方案以及抑制病原菌的传播具有重要意义。

近年来，分子生物学方法不断被应用到呼吸道病原体的快速检测中，呼吸道病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了呼吸道病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。

MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification)技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术，基本原理是：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。MIRA技术具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被应用于多种重要疾病病原体的检测中。

针对现有技术中存在的问题，本发明研发并评估了多酶快速恒温扩增荧光MIRA法作为乙型流感病毒核酸检测的试剂盒。

发明内容

因此，本发明为了解决上述技术问题中的至少一个，提供了一种用于乙型流感病毒检测的探针、试剂盒及其使用方法，该试剂盒能够节约反应时间，反应温度要求低。

根据本公开的第一方面，提供了一种引物组合，用于扩增包括乙型流感病毒基因序列的扩增片段，其特征在于，包括第一引物和第二引物，其中，

所述第一引物的序列为：

CTAACCCTGCTTGCTCGTAGTATGGTCGTT；

所述第二引物的序列为：

CATTGGAGCCCAAAACTGGAGCTTGATGGA。

在一些可能的实现方式中，还包括第三引物，所述第三引物的序列为：

AGTAGTGCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAATACCTCAACTAGGGTTCA。

根据本公开的第二方面，提供了一种探针组合，用于乙型流感病毒的核酸检测，其特征在于，包括所述第一引物、第二引物和荧光探针；所述荧光探针为经过位点修饰后的所述第三引物。

在一些可能的实现方式中，所述荧光探针序列为：

AGTAGTGCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAA/iHEXdT/A/idSp/C/iBHQ1dT/CAACTAGGGTTCA C3spacer。

根据本公开的第三方面，提供了一种试剂盒，用于乙型流感病毒的核酸检测，其特征在于，包括扩增反应试剂，所述扩增反应试剂中包括如权利要求3所述的探针组合。

在一些可能的实现方式中，还包括缓冲液、阳性质控品和阴性质控品。

在一些可能的实现方式中，所述阳性质控品为乙型流感病毒的分离培养物。

在一些可能的实现方式中，所述阴性质控品为生理盐水。

根据本公开的第四方面，提供了一种前述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

提取待测样本的核酸；

配制反应体系，向所述反应体系中加入所述核酸，进行MIRA扩增反应；

根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有乙型流感病毒。

在一些可能的实现方式中，MIRA扩增反应在温度设定为42℃的荧光检测器中进行。

在一些可能的实现方式中，所述试剂盒用于口咽拭子、鼻咽拭子核酸检测。

通过以上的技术方案可知，本发明具有优势如下：

能够节约反应时间，降低反应温度。具体地，MIRA反应只需要5～20min，加上样品处理以及准备时间，整个检测过程能够在1h之内完成，而且与常规PCR相比，不经过变温过程，逆转录和扩增同时进行，只需要在恒温42℃即可反应。

扩增所需的酶和引物探针等冻干成粉，能够在常温下保存。

操作更加简单、便携：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测出结果，不需要熟练的专业人员操作。

特异性强、灵敏度高，检测结果真实可靠。

在扩增反应试剂的Abuffer中添加了核酸外切酶III，切割扩增产物，降低产物污染的可能性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为MIRA荧光法检测乙型流感病毒的灵敏度示意图；

图2为MIRA荧光法检测乙型流感病毒的特异性示意图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

荧光MIRA引物、探针的设计

根据乙型流感病毒NP基因序列，采用DNAMAN软件比对找出特异区域，以特异序列为模板，根据MIRA扩增反应原理进行引物、探针的设计。

本实施例中使用的引物组合和探针序列如表1所示：

表1 引物与探针序列

其中，第一引物为MIRA-FB-F2、第二引物为MIRA-FB-R2、荧光探针为MIRA-FB-P1。其中荧光探针的idSP位点用于作为核酸外切酶的识别位点，荧光基团用HEX修饰，淬灭基团用BHQ1修饰，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。

实施例

一种基于MIRA荧光法检测乙型流感病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒内设有：Abuffer、B buffer、第一引物、第二引物、荧光探针、ddH₂O、阴性质控品、阳性质控品。

其中，参照磁珠法核酸提取试剂盒的说明书，提取乙型流感病毒患者的核酸作为阳性质控品。

其中，成品的所述试剂盒中包括以下：

试剂名称	含量
		A buffer	1.6mL×1管
B buffer	150uL×1管
		正对照模板	100uL×1管
正对照引物探针Mix	200uL×1管
		阴性对照模板	100uL×1管
ddH<sub>2</sub>O	1mL×1管

其中，所述扩增反应试剂单管分装，为干粉形态。试剂份数为48份/盒。

荧光MIRA反应体系的建立

多酶恒温快速扩增MIRA荧光法反应体系如下表所示：

试剂	用量(μL)
		A buffer	29.4
探针和引物MIX	4.6
		ddH<sub>2</sub>O和DNA模板	13.5
B buffer	2.5
		总体积	50

操作步骤：提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。

1)每个干粉反应管加入29.4μL A buffer(注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响)；

2)每个反应管分别加入4.6μL探针引物MIX(引物和探针浓度为10μM，上游引物：下游引物：探针＝10：10：3)；

3)向反应管中依次加入10.5μL ddH2O和5μL核酸模板(可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的ddH2O体积，至模板与ddH2O总体积为13.5μL)；

4)最后向反应管中加入2.5μL B buffer并充分混合(对于多个反应，建议将Bbuffer加至反应管的盖子内侧，请务必上下颠倒反应管8-10次混匀)；

5)混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。

其中，荧光检测程序设置为：恒温42℃；每30s采集一次FAM通道和HEX通道(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值；反应时间20mins。

试验1多酶恒温快速扩增MIRA荧光法检测乙型流感病毒核酸的灵敏度。

以包含乙型流感病毒NP核酸序列的质粒为模板，进行10倍梯度稀释，使稀释后的终浓度分别为1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10copies/μL、0copies/μL，以生理盐水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光MIRA反应，每个浓度重复3次试验。

图1为试验1的结果。由图1可知：本试验中1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10copies/μL结果均为阳性，即荧光MIRA法检测试剂盒的灵敏度达到10copies/μL。

试验2多酶恒温快速扩增MIRA荧光法检测乙型流感病毒核酸的特异性

为评价本发明提供的试剂盒的检测特异性，实验从临床样本中筛选了一组常见的呼吸道病原体，如甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、人腺病毒、肺炎支原体、人冠状病毒以及百日咳鲍特菌。上述样本采用西安天隆科技有限公司《核酸提取或纯化试剂》(陕西械备20140007)提取。

图2为试验2的结果。由图2可知，本试验提供的试剂盒检测常见呼吸道病原体结果均为阴性，Victoria和Yamagata乙型流感病毒检测阳性。结果说明该荧光MIRA法具有良好的检出效果和特异性。

尽管已经通过优选实施例进一步详细说明和描述了本发明，但是本发明不限于所公开的示例，并且本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下从其中得出其他变型。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种引物组合，用于扩增包括乙型流感病毒基因序列的扩增片段，其特征在于，包括第一引物和第二引物，其中，

所述第一引物的序列为：

CTAACCCTGCTTGCTCGTAGTATGGTCGTT；

所述第二引物的序列为：

CATTGGAGCCCAAAACTGGAGCTTGATGGA。

2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，还包括第三引物，所述第三引物的序列为：

AGTAGTGCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAATACCTCAACTAGGGTTCA。

3.一种探针组合，用于乙型流感病毒的核酸检测，其特征在于，包括所述第一引物、第二引物和荧光探针；所述荧光探针为经过位点修饰后的所述第三引物。

4.如权利要求3所述的探针组合，其特征在于，所述荧光探针序列为：

AGTAGTGCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAA/iHEXdT/A/idSp/C/iBHQ1dT/CAACTAGGGTTCAC3spacer。

5.一种试剂盒，用于乙型流感病毒的核酸检测，其特征在于，包括扩增反应试剂，所述扩增反应试剂中包括如权利要求3所述的探针组合。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液、阳性质控品和阴性质控品。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为乙型流感病毒的分离培养物。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为生理盐水。

9.一种如权利要求5～8任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测样本的核酸；

配制反应体系，向所述反应体系中加入所述核酸，进行MIRA扩增反应；

根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有乙型流感病毒。

10.根据权利要求9所述试剂盒的使用方法，其特征在于，MIRA扩增反应在温度设定为42℃的荧光检测器中进行。

11.根据权利要求10所述试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂盒用于口咽拭子、鼻咽拭子核酸检测。

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