CN109897917A - 一种甲流、乙流及腺病毒多重核酸检测引物探针组及其试剂盒 - Google Patents
一种甲流、乙流及腺病毒多重核酸检测引物探针组及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测引物探针组及其试剂盒和相关应用。所述引物组的序列如SEQ ID NO：1‑3、5、6、8‑12所示；所述探针组的序列如SEQ ID NO：4、7、13所示。本发明还提供了一种包括上述引物探针组的用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测的试剂盒和多重核酸检测扩增反应液和检测方法。本发明的引物探针组针对甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒核酸同时检测具有高特异性和灵敏度；用本发明的引物探针组制备的试剂盒操作快速、方法简便、检测的特异性好、灵敏度高且可以一管多检，彻底解决了现有技术中试剂盒检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种甲流、乙流及腺病毒多重核酸检测引物探针组及其试剂盒和应用。
背景技术
呼吸道感染(Respiratorytract infection，RTI)是人类最常见的一类疾病，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。常见的病原体包括呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、副流感病毒等。
目前呼吸道病原体检测的主要方法包括：病原体分离培养法、免疫法和分子检测法等。病毒分离培养是目前病毒病原学检测的金标准，但是对标本中病毒采集、运输及保存条件要求均较高，且操作复杂、耗时长、不稳定、敏感性不高，不适合临床检测应用。免疫法的特异性高，但灵敏度较低，且往往不可用于疾病的早期诊断。实时荧光定量PCR技术是目前应用最广泛的分子检测法，该技术不仅实现了对核酸模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高等特点。
目前国内应用荧光PCR技术进行甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒核酸检测的试剂盒主要为单重核酸检测试剂盒及甲/乙流双重检测试剂盒，不能同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒，且操作时间较长，操作繁琐。
因此，亟需一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便的甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测引物探针组及其试剂盒和相关应用。
本发明的引物探针组包括用于靶序列扩增的上下游引物组和用于靶序列检测的探针组：
所述引物组的序列如SEQ ID NO：1-3、5、6、8-12所示；
所述探针组的序列如SEQ ID NO：4、7、13所示。
本发明还提供了一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测的试剂盒，包括核酸扩增反应缓冲液、浓度为100mM的dNTPs、Taq DNA聚合酶和M-MLV反转录酶，还包括上述引物探针组。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和内标；所述阳性对照为灭活的甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒的混合物；所述阴性对照为灭菌生理盐水；所述内标为噬菌体MS2。
优选的，所述试剂盒还包括用于所述内标片段扩增的上下游引物和用于检测所述内标的探针；所述用于所述内标片段扩增的上下游引物的序列分别如SEQ ID NO：14和15所示；所述用于检测所述内标的探针的序列如SEQ ID NO：16所示。
优选的，上述序列如SEQ ID NO：4的探针的5’端和3’端分别标记Texas Red和BHQ2；上述序列如SEQ ID NO：7的探针的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ1；上述序列如 SEQID NO：13的探针的5’端和3’端分别标记VIC和BHQ1。
本发明的第三个目的是提供了一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测扩增反应液，所述反应液由核酸扩增反应缓冲液、100mM浓度的dNTPs、Taq DNA聚合酶和M-MLV反转录酶和引物探针组组成；所述引物探针组如上所述；所述反应液各组分的配比如下：
本发明的第四个目的是提供了一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测的方法，将核酸扩增反应缓冲液、100mM浓度的dNTPs、Taq DNA聚合酶和M-MLV 反转录酶和引物探针组按以下反应体系的配比配制成核酸扩增反应混合液进行PCR反应；
所述引物探针组如前所述；所述反应体系的配比如下：
所述PCR反应按如下程序进行：
本发明的引物探针组针对甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒核酸同时检测具有高特异性和灵敏度；用本发明的引物探针组制备的试剂盒操作快速、方法简便、检测的特异性好、灵敏度高且可以一管多检，彻底解决了现有技术中试剂盒检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。
附图说明
图1为本发明的不同型别甲型流感病毒检测结果图，其中，编号代表为1：甲型H1N1； 2：新甲型H1N1；3：H7N9；4：季节性H3N2；5：季节性H1N1；
图2为本发明的不同型别乙型流感病毒检测结果图，其中，编号代表为1：B/Victoria； 2：B/Yamagata；
图3为本发明的不同型别腺病毒检测结果图，其中，编号代表为1：腺病毒4型；2：腺病毒1型；3：腺病毒3型；4：腺病毒7型；
图4为本发明的不同型别腺病毒检测结果图，其中，编号代表为1：腺病毒35型；2：腺病毒14型；3：腺病毒2型；4：腺病毒55型；
图5为本发明的交叉反应检测结果图，其中，编号代表为1：腺病毒；2：甲型流感病毒；3：乙型流感病毒；4：风疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、巨细胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、干酪乳杆菌、肺炎链球菌、肠炎沙门氏菌、乙型溶血性链球菌、普通变形杆菌、EB病毒；
图6为本发明的季节性H1N1样本灵敏度检测结果图，其中，编号代表为1： 2.5×103TCID50/L；2：2.5×102TCID50/L；3：2.5×101TCID50/L；4：阴性样本；
图7为本发明的B/Victoria型样本灵敏度检测结果图，其中，编号代表为1: 2.1×105TCID50/L；2：2.1×104TCID50/L；3：2.1×103TCID50/L；4：阴性样本；
图8为本发明的腺病毒7型灵敏度检测结果图，其中，编号代表为1：1.0×103TCID50/L； 2：1.0×102TCID50/L；3：1.0×101TCID50/L；4：阴性样本。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照本领域中常规实验方法进行。
实施例1：本发明的一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测的试剂盒的一个优选实施例
本发明的甲流、乙流及腺病毒核酸检测试剂盒，包括甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液，该核酸反应液包括：反应缓冲液、100mM的脱氧三磷酸核苷、Taq DNA酶、M-MLV 反转录酶、用于靶序列扩增的上下游引物以及用于靶序列检测的探针，其中用于靶序列扩增的上下游引物的序列为SEQ ID NO：1-3、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：8-12；用于靶序列检测的探针序列为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：13，上述三条探针的5’端和3’端分别标记Texas Red和BHQ2、FAM和BHQ1、VIC和BHQ1。本试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和内标，阳性对照为灭活的甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒混合物，阴性对照为灭菌生理盐水，内标为噬菌体MS2。
采用大肠杆菌噬菌体作为内标质控，设计一对检测内标序列的引物(SEQ ID NO：14 和15)及一条探针Taqman探针(SEQ ID NO：16)，探针5’和3’分别标记CY5和BHQ2，对靶序列的提取及扩增过程进行监控，避免假阴性。
本试剂盒中甲型流感病毒的检测靶区域为M1基因，乙型流感病毒的检测靶区域为NEP基因，腺病毒的检测靶区域为E1A基因。
引物探针的序列如下所示：
SEQ ID NO:1 5’-GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC-3’
SEQ ID NO:2 5’-CATCTTCAAGTCTCTGCGCGAT-3’
SEQ ID NO:3 5’-CTGCAATGACACTTTCCAGTCTCT-3’
SEQ ID NO:4 5’-CRTCAGGCCCCCTCAAAGCCG-3’
SEQ ID NO:5 5’-CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG-3’
SEQ ID NO:6 5’-GCTTATGGGAAGCACCACTTTG-3’
SEQ ID NO:7 5’-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-3’
SEQ ID NO:8 5’-GGTATTTAAACCTGACGAGTTCCGT-3’
SEQ ID NO:9 5’-GTATTTATACCCGGTGAGTTC-3’
SEQ ID NO:105’-GGTATTTATACCTCAGGGTTTGTGT-3’
SEQ ID NO:11 5’-CGCGGAGGAGAAAACTCTTC-3’
SEQ ID NO:125’-GCTCGGAGGAGAAAACTCTA-3’
SEQ ID NO:13 5’-AAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCG-3’
SEQ ID NO:145’-ACAAACCAGCATCCGTAG-3’
SEQ ID NO:155’-TGCCCAAACAACGACG-3’
SEQ ID NO:165’-TGGCAACCTCCTCTCTGGCTACCGA-3’
实施例2利用实施例1中的试剂盒对样本进行检测的实验方法的建立
利用本发明实施例1中的试剂盒建立对样本检测的方法，PCR反应体系的配比如下所示：
本发明的检测方法为实时荧光RT-PCR，将RNA逆转录与DNA扩增相结合。
1、实时荧光RT-PCR反应过程可分为以下几个阶段：
(1)cDNA合成；
(2)预变性：预变性的时间和长度取决于靶序列的长度及碱基组成，预变性的温度一般为90～105℃，时间一般为1～10min，预变性的目的为使双链核苷酸序列彻底分离为单链；
(3)变性，温度一般为90～105℃，时间一般为10～30s；
(4)退火，使各引物、探针与甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒及内标核酸的靶序列相结合。退火温度可采用45～65℃，这与引物探针的设计、特异性与扩增效率的平衡有关。退火的时间可以是10～60s；
(5)延伸，引物与模板结合，在DNA聚合酶的作用下开始合成新的DNA双链，延伸温度一般为40～80℃，延伸时间可以是10s～5min。
基于上述反应条件，我们以以下反应条件为最佳。
2、荧光检测通道选择：
(1)选择Texas Red通道检测甲型流感病毒核酸；
(2)选择FAM通道检测乙型流感病毒核酸；
(3)选择VIC通道检测腺病毒核酸；
(4)选择CY5通道，检测内标核酸；
(5)参比荧光(Passive Reference)设置为none。
3、结果分析
使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行反应，反应结束自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(可以根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整空白对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。
(1)每一个检测批次均需设置阴性对照和阳性对照以进行质量控制。以下要求需在同一实验中同时满足，否则当次实验无效。
阴性对照：在FAM、Texas Red、VIC荧光通道荧光信号均无明显增长，且无明显S型扩增曲线；在CY5荧光通道荧光信号有明显的增长，呈典型的S型扩增曲线，且Ct值≤30.0。
阳性对照：在FAM、Texas Red、VIC荧光通道荧光信号均有明显增长，且均呈典型的S型曲线，Ct值≤30.00；在CY5荧光通道荧光信号有明显的增长，呈典型的S型曲线，且 Ct值≤30.00。
(2)在阳性对照、阴性对照和内标对照结果均正常的情况下按照表1进行结果分析：
表1
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性；“Undetermined”表示无扩增。
待测样本扩增曲线呈典型S型曲线，但浓度过高而导致内标对照无扩增，待测样本可直接判为阳性。也可将待测样本进行10倍稀释重新检测。
实施例3本发明试剂盒性能实验
1、检测准确性实验
(1)甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液配制
采用实施例1的方法制备甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液。
(2)核酸提取
使用广东和信健康科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤穗械备20150194号)对不同型别的甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒样本进行核酸的提取，同步提取阴性对照及阳性对照。
(3)核酸检测
将5μL上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对不同型别的甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒的样本进行检测，甲型流感病毒检测结果如图1所示(1号曲线为甲型H1N1，2号曲线为新甲型H1N1，3号曲线为H7N9，4号曲线为季节性H3N2， 5号曲线为季节性H1N1)，乙型流感病毒检测结果如图2所示(1号曲线为B/Victoria型， 2号曲线为B/Yamagata型)，腺病毒检测结果如图3及图4所示(图3中1号曲线为腺病毒4型，2号曲线为腺病毒1型，3号曲线为腺病毒3型，4号曲线为腺病毒7型；图4中 1号曲线为腺病毒35型，2号曲线为腺病毒14型，3号曲线为腺病毒2型，4号曲线为腺病毒55型)。由图1、图2、图3和图4的结果，表明本发明试剂盒可特异性检出：甲型流感病毒季节性H1N1型，甲型H1N1型、季节性H3N2型、甲型H7N9、新甲型H1N1；乙型流感病毒Yamagata型、Victoria型；腺病毒1型、2型、3型、4型、7型、14型、35 型、55型，具体数据见表2，表2为准确性实验结果表。
表2
注：“Undetermined”表示无扩增。
2、与其他病原体的交叉反应实验
(1)甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液配制
通过采用实施例1的方法制备甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液。
(2)核酸提取
使用广东和信健康科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤穗械备20150194号)对风疹病毒(1×105TCID50/mL)、腮腺炎病毒(1×105TCID50/mL)、麻疹病毒(1×105TCID50/mL)、金黄色葡萄球菌(1×106CFU/mL)、大肠埃希氏菌(1×106 CFU/mL)、铜绿假单胞菌(1×106CFU/mL)、肠道病毒71型(1×105TCID50/mL)、柯萨奇病毒A16型(1×105TCID50/mL)、呼吸道合胞病毒A型(1×105TCID50/mL)、呼吸道合胞病毒B型(1×105TCID50/mL)、副流感病毒1型(1×105TCID50/mL)、副流感病毒 2型(1×105TCID50/mL)、副流感病毒3型(1×105TCID50/mL)、巨细胞病毒(1×105 TCID50/mL)、肺炎支原体(1×105TCID50/mL)、肺炎衣原体(1×106CCU/mL)、流感嗜血杆菌(1×106CFU/mL)、脑膜炎奈瑟菌(1×106CFU/mL)、干酪乳杆菌(1×106CFU/mL)、肺炎链球菌(1×106CFU/mL)、肠炎沙门氏菌(1×106CFU/mL)、乙型溶血性链球菌(1×106 CFU/mL)、普通变形杆菌(1×106CFU/mL)、EB病毒(1×105TCID50/mL)样本进行核酸的提取，同步提取阴性对照及阳性对照。
(3)核酸检测
将5μL上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对风疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2 型、副流感病毒3型、巨细胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、干酪乳杆菌、肺炎链球菌、肠炎沙门氏菌、乙型溶血性链球菌、普通变形杆菌、EB 病毒等病原体进行检测，检测结果如图5所示(1号曲线为腺病毒，2号曲线为甲型流感病毒，3号曲线为乙型流感病毒，4号曲线为风疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3 型、巨细胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、干酪乳杆菌、肺炎链球菌、肠炎沙门氏菌、乙型溶血性链球菌、普通变形杆菌、EB病毒)，图5结果表明本试剂盒与以上病原体均无交叉反应，说明本发明试剂盒特异性较高，具体数据见表 3，表3为交叉反应实验结果。
表3
| 病原体 | 检测结果 | 病原体 | 检测结果 |
| 风疹病毒 | 阴性 | 肺炎支原体 | 阴性 |
| 腮腺炎病毒 | 阴性 | 肺炎衣原体 | 阴性 |
| 麻疹病毒 | 阴性 | 副流感病毒1型 | 阴性 |
| 金黄色葡萄球菌 | 阴性 | 副流感病毒2型 | 阴性 |
| 大肠埃希氏菌 | 阴性 | 副流感病毒3型 | 阴性 |
| 铜绿假单胞菌 | 阴性 | 脑膜炎奈瑟菌 | 阴性 |
| 肠道病毒71型 | 阴性 | 干酪乳杆菌 | 阴性 |
| 柯萨奇病毒A16型 | 阴性 | 肺炎链球菌 | 阴性 |
| 呼吸道合胞病毒A型 | 阴性 | 肠炎沙门氏菌 | 阴性 |
| 呼吸道合胞病毒B型 | 阴性 | 乙型溶血性链球菌 | 阴性 |
| 流感嗜血杆菌 | 阴性 | 普通变形杆菌 | 阴性 |
| 巨细胞病毒 | 阴性 | EB病毒 | 阴性 |
3、病原体干扰实验
(1)甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液配制
通过采用实施例1的方法制备甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液。
(2)核酸提取
取甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒的低浓度样本，浓度值均为103TCID50/mL左右，作为干扰试验的基础样本，同时也是干扰试验的对照样本(control)，同时将腮腺炎病毒(1×105TCID50/mL)、麻疹病毒(1×105TCID50/mL)、金黄色葡萄球菌(1×106CFU/mL)、大肠埃希氏菌(1×106CFU/mL)、铜绿假单胞菌(1×106CFU/mL)、呼吸道合胞病毒A型(1×105TCID50/mL)、副流感病毒1型(1×105TCID50/mL)、副流感病毒3型(1×105TCID50/mL)、肺炎支原体(1×105TCID50/mL)、流感嗜血杆菌(1×106 CFU/mL)、脑膜炎奈瑟菌(1×106CFU/mL)、干酪乳杆菌(1×106CFU/mL)、肺炎链球菌(1×106CFU/mL)、肠炎沙门氏菌(1×106CFU/mL)、乙型溶血性链球菌(1×106CFU/mL)、 EB病毒(1×105TCID50/mL)加入到对应病毒样本中，作为病原体干扰实验的实验样本(test)。使用广东和信健康科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤穗械备 20150194号)对以上实验样本及对照样本同时进行核酸的提取，每个样本进行3次平行操作。
(3)核酸检测
将5μL上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
判断标准：干扰率(％)小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，则可判断为通过。
干扰率计算公式：
试验表明，当样本中含有腮腺炎病毒(1×105TCID50/mL)、麻疹病毒(1×105TCID50/mL)、金黄色葡萄球菌(1×106CFU/mL)、大肠埃希氏菌(1×106CFU/mL)、铜绿假单胞菌(1×106CFU/mL)、呼吸道合胞病毒A型(1×105TCID50/mL)、副流感病毒 1型(1×105TCID50/mL)、副流感病毒3型(1×105TCID50/mL)、肺炎支原体(1×105 TCID50/mL)、流感嗜血杆菌(1×106CFU/mL)、脑膜炎奈瑟菌(1×106CFU/mL)、干酪乳杆菌(1×106CFU/mL)、肺炎链球菌(1×106CFU/mL)、肠炎沙门氏菌(1×106CFU/mL)、乙型溶血性链球菌(1×106CFU/mL)、EB病毒(1×105TCID50/mL)等其他病原体时，本发明试剂盒检测结果不会受到明显干扰，具体数据见表4，表4为病原体干扰实验结果表：
表4
4、对潜在外源物质的抗干扰性
(1)甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液配制
通过采用实施例1的方法制备甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液。
(2)核酸提取
取甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒的低浓度样本，浓度值均为103TCID50/mL左右，作为干扰试验的基础样本，同时也是干扰试验的对照样本(control)，同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到对应病毒样本中，作为干扰物质的实验样本(test)。使用广东和信健康科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤穗械备20150194 号)对以上实验样本及对照样本同时进行核酸的提取，每个样本进行3次平行操作。
(3)核酸检测
将5μL上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
判断标准：干扰率(％)小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，则可判断为通过。
干扰率计算公式：
试验表明，当样本中含有肾上腺素、地塞米松、布地奈德、利巴韦林、盐酸羟甲唑啉、丙酸倍氯米松、对乙酰氨基酚等药物时，本发明试剂盒检测结果不会受到明显干扰，具体见数据表5，表5为外源物质的抗干扰性实验结果表。
表5
5、灵敏度实验
(1)甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液配制
通过采用实施例1的方法制备甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液。
(2)核酸提取
使用广东和信健康科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤穗械备20150194号)分别对国家参考品甲型流感病毒(季节性H1N1)2.5×101～2.5×103TCID50/L样本、国家参考品乙型流感病毒(B/Victoria)2.1×103～2.1×105TCID50/L样本、腺病毒7型 1.0×101～1.0×103TCID50/L样本及阴性样本进行核酸的提取。
(3)核酸检测
将5μL上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对国家参考品甲型流感病毒(季节性H1N1)2.5×101～2.5×103TCID50/L样本、国家参考品乙型流感病毒(B/Victoria) 2.1×103～2.1×105TCID50/L样本、腺病毒7型1.0×101～1.0×103TCID50/L样本进行检测，甲型流感病毒检测结果如图6所示(1号曲线、2号曲线、3号曲线分别为季节性H1N1的 2.5×103TCID50/L、2.5×102TCID50/L、2.5×101TCID50/L样本，4号曲线为阴性样本)，乙型流感病毒检测结果如图7所示(1号曲线、2号曲线、3号曲线分别为B/Victoria型的2.1×105TCID50/L、2.1×104TCID50/L、2.1×103TCID50/L样本，4号曲线为阴性样本)，腺病毒检测结果如图8所示(1号曲线、2号曲线、3号曲线分别为腺病毒7型1.0×103TCID50/L、 1.0×102TCID50/L、1.0×101TCID50/L样本，4号曲线为阴性样本)，表明本试剂盒可检出2.5×101TCID50/L浓度以上季节性H1N1的样本，2.1×103TCID50/L浓度以上B/Victoria型样本及1.0×101TCID50/L浓度以上腺病毒7型样本，说明本发明试剂盒灵敏度较高，具体数据见表6，表6为灵敏度实验结果表：
表6
注：“Undetermined”表示无扩增。
6、本发明方法与上海之江甲、乙型流感病毒核酸联合测定试剂盒(荧光PCR法)检测甲、乙流效果比较
(1)甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液配制
通过采用实施例1的方法制备甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液。
(2)核酸提取
取不同型别的甲型流感病毒及乙型流感病毒样本，使用QIAGEN生产的QIAampViral RNAMini Kit(货号52904)对病毒样本进行核酸的提取。
(3)核酸检测
将5μL上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测；同时采用上海之江生产的甲、乙型流感病毒核酸联合测定试剂盒(荧光PCR法)进行以上样本的检测，试剂配制方法见下表7，表7为上海之江甲、乙型流感病毒核酸联合测定试剂盒(荧光PCR法)试剂配制方法。
表7
用上海之江甲、乙型流感病毒核酸联合测定试剂盒(荧光PCR法)扩增反应程序如下：
(4)结果分析
结果表明本发明方法检测的结果与上海之江试剂盒检测结果无显著差异。但是，核酸检测过程本发明方法所需时间较短，可以很好的节约时间。具体检测结果如下表8，表8为本发明方法与上海之江试剂盒检测结果对比表。
表8
注：“Undetermined”表示无扩增。
7、本发明方法与深圳普瑞康腺病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)检测腺病毒效果比较
(1)甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液配制
通过采用实施例1的方法制备甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液。
(2)核酸提取
取不同型别的腺病毒样本，使用深圳普瑞康生产的腺病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)中的样本处理试剂对病毒样本进行核酸的提取。
(3)核酸检测
将5μL上步提取得到的样本核酸加入到甲流、乙流及腺病毒核酸扩增反应液中，按照实施例2中检测方法进行检测；同时采用深圳普瑞康生产的腺病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)进行以上样本的检测，试剂配制方法见下表9，表9为深圳普瑞康腺病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)试剂配制方法表。
表9
| 组分名称 | 1人份用量 |
| PCR反应液A | 26μL |
| PCR反应液B | 1μL |
| 样本核酸 | 3μL |
| 总计 | 30μL |
深圳普瑞康腺病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)扩增反应程序如下：
(4)结果分析
结果表明本发明方法检测的结果的Ct值比深圳普瑞康试剂盒检测结果的Ct值更小，灵敏度较高。且核酸检测过程本发明方法所需时间较短，可以很好的节约时间。具体检测结果如下表10，表10为本发明方法与普瑞康试剂盒检测结果对比表。
表10
注：“Undetermined”表示无扩增。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广东和信健康科技有限公司
<120> 一种甲流、乙流及腺病毒多重核酸检测引物探针组及其试剂盒
<160> 1
<210> 1
<211> 27
<212> SEQ ID NO:1
<213> DNA
<400> 1
GAGGTCGAAA CGTATGTTCT CTCTATC 27
<210> 1
<211> 22
<212> SEQ ID NO:2
<213> DNA
<400> 2
CATCTTCAAG TCTCTGCGCG AT 22
<210> 1
<211> 24
<212> SEQ ID NO:3
<213> DNA
<400> 3
CTGCAATGAC ACTTTCCAGT CTCT 24
<210> 1
<211> 21
<212> SEQ ID NO:4
<213> DNA
<400> 4
CRTCAGGCCC CCTCAAAGCC G 21
<210> 1
<211> 21
<212> SEQ ID NO:5
<213> DNA
<400> 5
CCCTGCTTGC TCGTAGTATG G 21
<210> 1
<211> 22
<212> SEQ ID NO:6
<213> DNA
<400> 6
GCTTATGGGA AGCACCACTT TG 22
<210> 1
<211> 23
<212> SEQ ID NO:7
<213> DNA
<400> 7
CGTTGTTAGG CCCTCTGTGG CGA 23
<210> 1
<211> 25
<212> SEQ ID NO:8
<213> DNA
<400> 8
GGTATTTAAA CCTGACGAGT TCCGT 25
<210> 1
<211> 21
<212> SEQ ID NO:9
<213> DNA
<400> 9
GTATTTATAC CCGGTGAGTT C 21
<210> 1
<211> 25
<212> SEQ ID NO:10
<213> DNAA
<400> 10
GGTATTTATA CCTCAGGGTT TGTGT 25
<210> 1
<211> 20
<212> SEQ ID NO:11
<213> DNA
<400> 11
CGCGGAGGAG AAAACTCTTC 20
<210> 1
<211> 20
<212> SEQ ID NO:12
<213> DNA
<400> 12
GCTCGGAGGA GAAAACTCTA 20
<210> 1
<211> 25
<212> SEQ ID NO:13
<213> DNA
<400> 13
AAGAGGCCAC TCTTGAGTGC CAGCG 25
<210> 1
<211> 18
<212> SEQ ID NO:14
<213> DNA
<400> 14
ACAAACCAGC ATCCGTAG 18
<210> 1
<211> 16
<212> SEQ ID NO:15
<213> DNA
<400> 15
TGCCCAAACA ACGACG 16
<210> 1
<211> 25
<212> SEQ ID NO:16
<213> DNA
<400> 16
TGGCAACCTC CTCTCTGGCT ACCGA 25
Claims (9)
1.一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括用于靶序列扩增的上下游引物组和用于靶序列检测的探针组：
所述引物组的序列如SEQ ID NO：1-3、5、6、8-12所示；
所述探针组的序列如SEQ ID NO：4、7、13所示。
2.一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测的试剂盒，包括核酸扩增反应缓冲液、浓度为100mM的dNTPs、Taq DNA聚合酶和M-MLV反转录酶，其特征在于，还包括如权利要求1所述的引物探针组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和内标；
所述阳性对照为灭活的甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒的混合物；
所述阴性对照为灭菌生理盐水；
所述内标为噬菌体MS2。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于所述内标基因扩增的上下游引物和用于检测所述内标基因的探针；
所述用于所述内标基因扩增的上下游引物的序列分别如SEQ ID NO：14和15所示；
所述用于检测所述内标基因的探针的序列如SEQ ID NO：16所示。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO：4的探针的5’端和3’端分别标记Texas Red和BHQ2；
所述序列如SEQ ID NO：7的探针的5’端和3’端分别标记FAM和BHQ1；
所述序列如SEQ ID NO：13的探针的5’端和3’端分别标记VIC和BHQ1。
6.一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测扩增反应液，其特征在于，所述反应液包含如权利要求1所述引物探针组。
7.根据权利要求6所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测扩增反应液，其特征在于，所述反应液还包含以下组分：核酸扩增反应缓冲液、浓度为100mM的dNTPs、Taq DNA聚合酶和M-MLV反转录酶；所述反应液各组分的终浓度如下：
8.一种甲型流感病毒、乙型流感病毒及腺病毒多重核酸检测的方法，其特征在于，所述方法为：将核酸扩增反应缓冲液、100mM浓度的dNTPs、Taq DNA聚合酶和M-MLV反转录酶和引物探针组按以下反应体系的终浓度配制成核酸扩增反应混合液进行PCR反应；
所述引物探针组如权利要求1所述；
所述反应体系的配比如下：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR反应按如下程序进行：
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