CN104762392A - 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量pcr检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104762392A CN104762392A CN201510163845.7A CN201510163845A CN104762392A CN 104762392 A CN104762392 A CN 104762392A CN 201510163845 A CN201510163845 A CN 201510163845A CN 104762392 A CN104762392 A CN 104762392A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- probe
- primer
- bhq1
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量PCR检测方法，属于荧光定量PCR技术领域。本发明的检测方法：取样品的核酸10ul与15ul反应液配成25ul的反应体系，然后进行荧光定量PCR反应；如果FAM检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则含有大肠杆菌；如果HEX或VIC检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则含有肺炎克雷伯氏菌；如果CY5检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则含有不动杆菌。整个检测过程不到2个小时，采取闭管反应，检测完毕直接处理，避免开盖造成气溶胶污染。过程简单、检测时间短。
Description
技术领域
本发明涉及一种大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）和不动杆菌（Acinetobacter）的三重荧光定量PCR检测方法，属于荧光定量PCR技术领域。
背景技术
近年来，凭借独特的气候特点和优质丰富的饲料资源，山东省成为全国毛皮动物养殖第一大省，毛皮动物饲养量占全国饲养总量的55％以上。其中，水貂的饲养量占全国的80％以上，蓝狐的饲量养占全国的50%以上，经济效益可观，成为山东省的特色畜牧业。但是，随着毛皮动物养殖业的蓬勃发展，产业发展与资源约束的矛盾也日趋严重，带来了多种动物共患病的易发、高发和频发、抗生素滥用以及饲料源耐药基因的扩散等问题，细菌性疫病已经成为制约产业发展的关键性问题之一，主要表现为毛皮动物细菌病病原复杂、存在多重耐药性、诊断检测困难等。
临床监测结果表明，在毛皮动物细菌性疫病中，夏季高发的肺炎和冬季流行的腹泻是常见病多发病症。导致毛皮动物表现肺炎症的一般是肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌等，导致毛皮动物表现腹泻症的一般是大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌等。同时，大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌还能够穿过毛皮动物的血脑屏障，导致出现尖叫、暴躁等症状，致死率很高，给养殖户带来严重的经济损失。
对毛皮动物临床表现腹泻症状和肺炎症状的疫情控制，虽然仅根据样本细菌检测结果不能确认致病原因，但是样本细菌检测结果是对症治疗的关键步骤，因此，为了做到诊断检测的准确性和提高检测的及时性，建立快速检测和鉴定大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌三种细菌的方法具有重要意义。
在常规的细菌培养中，大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌在普通培养基上菌落形态相似，眼观不易分辨；采用经典的细菌形态观察方法——涂片镜检下菌体特点相似，很难区分。采用细菌的生化鉴定和16sRNA鉴定，约需3-4天的时间。同时，16sRNA鉴定还需要进行测序，成本也比较高。普通的PCR鉴定，灵敏度差，有时不能直接从样品中检测出细菌，而且容易污染，假阳性高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作过程简单、检测时间短且能避免开盖污染的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量PCR检测方法。
技术方案
大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量PCR检测方法，
取待测样品的核酸10ul与15ul反应液配成25ul的反应体系，然后进行荧光定量PCR反应，读取结果；
所述反应液的组成：
10μmol/L的K1-F：1μl，
10μmol/L的K1-R：1μl，
10μmol/L的T1：1μl，
10μmol/L的K2-F：1μl，
10μmol/L的K2-R：1μl，
10μmol/L的T2：1μl，
10μmol/L的K3-F：1μl，
10μmol/L的K3-R：1μl，
10μmol/L的T3:：1μl，
10×PCR ：2μl，
25mmol/L的MgCl2：1.7μl，
25mmol/L的dNTP：2μl，
Taq酶：0.3μl；
所述K1-F为：agacagagtgtgatatctac，如SEQ ID NO.1所示，
所述K1-R为：aagtagaacggtttgtggttaatca，如SEQ ID NO.2所示，
所述T1为：FAM-ggcgaacagttcctgattaacca-BHQ1，如SEQ ID NO.3所示，
所述K2-F为：cactg gcgcgaactg gaagggcccg ，如SEQ ID NO.4所示，
述K2-R为：cgcgccccagcggcgcgccaatcg，如SEQ ID NO.5所示，
所述T2为：HEX-atgaaacgacctgattgcattc -BHQ1，如SEQ ID NO.6所示，
所述K3-F为：tttgcttgta tcgttgtggc ttta，如SEQ ID NO.7所示，
所述K3-R为：gttttgttggccaagttactc，如SEQ ID NO.8所示，
所述T3为：CY5- cttcgttcgtttgctgaaag -BHQ1；如SEQ ID NO.9所示；
所述荧光定量PCR反应：
第一阶段：预变性50℃/2min；95℃/3min；
第二阶段：95℃ 15sec，60℃ 60sec，共40个循环，最后40℃ 10sec；
在第二阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；
所述读取结果：
如果FAM检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有大肠杆菌；
如果HEX或VIC检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有肺炎克雷伯氏菌；
如果CY5检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有不动杆菌。
一种上述方法所使用的引物和探针，其组成为：
用于扩增大肠杆菌特异序列的引物和探针：
上游引物K1-F：agacagagtgtgatatctac，如SEQ ID NO.1所示，
下游引物K1-R：aagtagaacggtttgtggttaatca，如SEQ ID NO.2所示，
探针T1：FAM-ggcgaacagttcctgattaacca-BHQ1，如SEQ ID NO.3所示；
用于扩增肺炎克雷伯氏菌特异序列的的引物和探针：
上游引物K2-F：cactg gcgcgaactg gaagggcccg ，如SEQ ID NO.4所示，
下游引物K2-R：cgcgccccagcggcgcgccaatcg，如SEQ ID NO.5所示，
探针T2：HEX-atgaaacgacctgattgcattc -BHQ1，如SEQ ID NO.6所示；
用于扩增不动杆菌特异序列的引物和探针：
上游引物K3-F：tttgcttgta tcgttgtggc ttta，如SEQ ID NO.7所示，
下游引物K3-R：gttttgttggccaagttactc，如SEQ ID NO.8所示，
探针T3：CY5- cttcgttcgtttgctgaaag -BHQ1，如SEQ ID NO.9所示。
在上述检测方法中，大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌三重荧光定量PCR检测方法采用细菌DNA柱式提取试剂盒，提取时间短，整个检测过程不到2个小时，采取闭管反应，检测完毕直接处理，避免开盖造成气溶胶污染。过程简单、检测时间短。
附图说明
图1-3为特异性实验的扩增结果图，图1中的“S”型曲线为大肠杆菌的扩增曲线；图2中的“S”型曲线为肺炎克雷伯氏菌的扩增曲线，图3中的“S”型曲线为不动杆菌的扩增曲线；图1-3中，直线为绿脓杆菌、弗式柠檬酸杆菌和沙门氏菌的阴性检测结果；
图4-6为重复性实验的扩增结果图，图4中的“S”型曲线为大肠杆菌不同菌株的扩增曲线；图5中的“S”型曲线为肺炎克雷伯氏菌不同菌株的扩增曲线，图6中的“S”型曲线为不动杆菌不同菌株的扩增曲线；图4-6中，直线为阴性对照的；
图7-9为灵敏度实验的扩增结果图，图7中的“S”型曲线为不同浓度的大肠杆菌的扩增曲线；图8中的“S”型曲线为不同浓度的肺炎克雷伯氏菌的扩增曲线，图9中的“S”型曲线为不同浓度的不动杆菌的扩增曲线；图7-9中直线为阴性对照的；图7中：从左到右的8条曲线中，第1-7条曲线分别对应的是稀释到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8浓度大肠杆菌的核酸；10-1-10-7浓度对应的核酸为阳性，10-8对应的核酸为阴性；10-7对应的菌落浓度为40 CFU/200uL；
图8中：从左到右的8条曲线中，第1-7条曲线分别对应的是稀释到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8浓度肺炎克雷伯氏菌的核酸；10-1-10-6浓度对应的核酸为阳性，10-7、10-8对应的核酸为阴性；10-6对应的细菌浓度为184CFU/200uL；
图9中：从左到右的8条曲线中，第1-7条曲线分别对应的是稀释到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8浓度不动杆菌的核酸；10-1-10-7浓度对应的核酸为阳性，10-8对应的核酸为阴性；10-7对应的细菌浓度为43CFU/uL。
具体实施方式
本具体实施方式中，所涉及的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia），记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物（主要是水貂）中分离鉴定得到的；现保存在山东省动物疫病预防与控制中心。
所涉及的大肠杆菌（Escherichia coli），记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物（主要是水貂）中分离鉴定得到的；现保存在山东省动物疫病预防与控制中心。
所涉及的不动杆菌（Acinetobacter），记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物（主要是水貂）中分离鉴定得到的；现保存在山东省动物疫病预防与控制中心。
所涉及绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物（主要是水貂）中分离鉴定得到的；现保存在山东省动物疫病预防与控制中心。
弗式柠檬酸杆菌（Freundii Citrobacter）记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物（主要是水貂）中分离鉴定得到的；现保存在山东省动物疫病预防与控制中心。
沙门氏菌（salmonella）记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物（主要是水貂）中分离鉴定得到的；现保存在山东省动物疫病预防与控制中心。
设计引物和探针
用于扩增大肠杆菌特异序列的引物和探针：
上游引物K1-F：agacagagtgtgatatctac，如SEQ ID NO.1所示，
下游引物K1-R：aagtagaacggtttgtggttaatca，如SEQ ID NO.2所示，
探针T1：FAM-ggcgaacagttcctgattaacca-BHQ1，如SEQ ID NO.3所示；
用于扩增肺炎克雷伯氏菌特异序列的的引物和探针：
上游引物K2-F：cactg gcgcgaactg gaagggcccg ，如SEQ ID NO.4所示，
下游引物K2-R：cgcgccccagcggcgcgccaatcg，如SEQ ID NO.5所示，
探针T2：HEX-atgaaacgacctgattgcattc -BHQ1，如SEQ ID NO.6所示；
用于扩增不动杆菌特异序列的引物和探针：
上游引物K3-F：tttgcttgta tcgttgtggc ttta，如SEQ ID NO.7所示，
下游引物K3-R：gttttgttggccaagttactc，如SEQ ID NO.8所示，
探针T3：CY5- cttcgttcgtttgctgaaag -BHQ1，如SEQ ID NO.9所示。
菌液浓度的调整
选取经鉴定纯化的水貂源大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌各1株，分别挑单个菌落于10ml无菌试管中过夜摇菌，得原菌液。做10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8十进位倍比稀释。取稀释好的10-6倍，倍10-7倍，10-8倍这三种细菌的菌液各200ul，接种于TSA琼脂上，用无菌的涂布器均匀涂布后，并每个稀释度每种细菌做三个重复，待平板干燥后放于37℃烘箱中培养12h后，进行菌落计数，取三组细菌计数的平均数为最终活菌计数的结果。大肠杆菌菌液稀释到10-6，10-7，10-8 这三个稀释度的细菌数的平均数分别为392CFU，40CFU，5CFU，乘以稀释倍数，再除以0.2，最终换算成1.96×109CFU/ml，2.00×109CFU/ml，2.50×108CFU/ml。肺炎克雷伯氏菌菌液稀释到10-6，10-7，10-8 这三个稀释度的细菌数平均数分别为184CFU，21CFU，3CFU，最终换算成9.20×108CFU/ml，1.05×109CFU/ml，1.50×109CFU/ml。不动杆菌菌液稀释到10-6，10-7，10-8 这三个稀释度的细菌数的平均数分别为397CFU，43CFU，5CFU，最终换算成1.99×109CFU/ml，2.15×109CFU/ml，2.50×109CFU/ml。
特异性试验
1.3.1
随机取1.2中大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌复苏摇菌后的原菌液，各取200ul于1.5ml离心管中，共3份菌液。采用北京森康生物技术开发有限公司的柱式提取试剂盒，参照说明书分别提取3份菌液的核酸。
同时将实验室保存的绿脓杆菌3株，弗式柠檬酸杆菌3株，沙门氏菌3株，共9株细菌。将这9株细菌复苏于TSA琼脂上，培养出单个菌落后，挑取单个菌落于装有TSB肉汤的10ml离心管中，过夜摇菌。取摇菌后的9份菌液各200ul于1.5ml离心管中，采用北京森康生物技术开发有限公司的柱式提取的试剂盒，参照说明书提取9份菌液的核酸。
将上述3株绿脓杆菌、3株弗式柠檬酸杆菌、3株沙门氏菌的核酸及大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的核酸进行下述检测：
分别取上述核酸10ul，均加入配好的反应液15ul，最终配成25ul的反应体系。将反应体系同时上机进行荧光定量PCR反应。荧光定量PCR的反应参数如下设置：
第一阶段：预变性50℃/2min；95℃/3min
第二阶段：95℃ 15sec，60℃ 60sec，共40个循环，最后40℃ 10sec。
在第二阶段每次循环的退火延伸时进行荧光收集。
结果读取：对于多通道PCR仪，分别利用FAM（465-510）通道、HEX（533-580）通道和CY5（618-660）通道读取结果；若用ABI仪器，分别选择FAM荧光素对应的通道、HEX荧光素对应的通道、CY5荧光素对应的通道，无荧光淬灭基团，读取结果。
具体的反应液配方如下：
| 组成 | 量（uL） |
| 上游引物10μmol/L-大肠杆菌 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-大肠杆菌 | 1 |
| 探针10μmol/L—大肠杆菌 | 1 |
| 上游引物10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 探针10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 上游引物10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 探针10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 10×PCR | 2 |
| MgCl2（25mmol/L） | 1.7 |
| dNTP（25mmol/L） | 2 |
| Taq酶 | 0.3 |
本发明采用的是多通道PCR仪（包括ABI仪器），读取的结果分别如图1、2和3所示；在FAM（465-510）通道出现一条“S”型扩增曲线，为大肠杆菌的扩增曲线；（因为检测大肠杆菌的探针以FAM荧光素标记的,所以用这FAM（465-510）通道接收的荧光信号为标记FAM荧光素探针的扩增产物的扩增曲线）在HEX（533-580）通道出现一条“S”型扩增曲线，为肺炎克雷伯氏菌的扩增曲线；在CY5（618-660）通道出现一条“S”型扩增曲线，为不动杆菌的扩增曲线。
对反应体系中的扩增产物进行测序；其中，标记有T1的扩增产物，其序列如SEQ ID NO.10所示（aagtagaacg gtttgtggtt aatcaggaac tgttcgccct tcactgccac tgaccggatgccgacgcgaa gcgggtagat atcacactct gtct），该序列唯一与大肠杆菌uidA基因序列保守区（1bp-94bp）一致；标记有T2的扩增产物，其序列如SEQ ID NO.11所示（cactggcgcg aactggaagg gcccgacgat gccacttatc ccgacagccc ggagcgtttt tcgattggcg cgccgctggg gcgcg），该序列唯一与肺炎克雷伯氏菌khe基因序列保守区（1bp-85bp）一致；标记有T3的扩增产物,其序列如SEQ ID NO.12所示（tttgcttgta tcgttgtggc tttaggttta ttatacgcca cccatcaagg taaaggcttc gttcgtttgc tgaaagatgc acgagtcgaa ttgcgtcgag taacttggcc aacaaaac），该序列唯一与不动杆菌secE基因序列保守区（1bp-118bp）一致。说明，引物K1-F、K1-R和探针T1能特异性扩增大肠杆菌uidA基因序列保守区，图1的“S”型曲线为大肠杆菌uidA基因序列保守区扩增产物的量的变化曲线。引物K2-F、K2-R和探针21能特异性扩增肺炎克雷伯氏菌khe基因序列保守区，图2的“S”型曲线为肺炎克雷伯氏菌khe基因序列保守区扩增产物的量的变化曲线。引物K3-F、K3-R和探针T3能特异性扩增不动杆菌secE基因序列保守区，图3的“S”型曲线为不动杆菌secE基因序列保守区扩增产物的量的变化曲线。而引物K1-F、K1-R和探针T1，引物K2-F、K2-R和探针T2，引物K3-F、K3-R和探针T3，均不会对绿脓杆菌、弗式柠檬酸杆菌、沙门氏菌进行扩增。大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌三重荧光定量PCR不能检测出混淆程度比较大的绿脓杆菌、弗式柠檬酸杆菌、沙门氏菌，具有很好的特异性。
另外，探针T1仅出现在与大肠杆菌uidA基因序列保守区（1bp-94bp）一致的扩增产物中，探针T2仅出现在与肺炎克雷伯氏菌khe基因序列保守区（1bp-85bp）一致的扩增产物中，探针T3仅出现在与不动杆菌secE基因序列保守区（1bp-118bp）一致的扩增产物中；说明，每组引物和探针均能排除另外两对引物和探针的干扰。
重复性试验
取1.2中复苏的三种菌液（原菌液）各200ul，即10株大肠杆菌菌液各200ul于10个不同的1.5ml离心管中；10株肺炎克雷伯氏菌菌液各200ul于10个不同的1.5ml离心管中；10株不动杆菌菌液各200ul于10个不同的1.5ml离心管中。采用北京森康生物技术开发有限公司的柱式提取的试剂盒，参照说明书提取30份菌液的核酸。将10株大肠杆菌的核酸、10株肺炎克雷伯氏菌的核酸、10株不动杆菌的核酸都随机挑选其中的一株，将三种细菌的核酸混合，最后形成10个三种细菌混合的核酸，把三种细菌的混合核酸当作荧光定量PCR反应的模板。荧光定量PCR反应采用15ul反应液，10ul模板，共25ul的体系。具体的反应液配方如下：
| 组成 | 量（uL） |
| 上游引物10μmol/L-大肠杆菌 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-大肠杆菌 | 1 |
| 探针10μmol/L—大肠杆菌 | 1 |
| 上游引物10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 探针10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 上游引物10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 探针10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 10×PCR | 2 |
| MgCl2（25mmol/L） | 1.7 |
| dNTP（25mmol/L） | 2 |
| Taq酶 | 0.3 |
； 取配好的反应液15ul，加入混合好的三种细菌的核酸10ul，最终配成25ul的反应体系，同时设定阴性对照（反应液15ul+DEPC水10ul），进行荧光定量PCR反应。荧光定量PCR的反应参数如下设置：
第一阶段：预变性50℃/2min；95℃/3min
第二阶段：95℃ 15sec，60℃ 60sec，共40个循环，最后40℃ 10sec。
荧光收集在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。
结果读取：对于多通道PCR仪，大肠杆菌利用FAM（465-510）通道读取结果，若用ABI仪器选择FAM荧光素对应的通道，无荧光淬灭基团；肺炎克雷伯氏菌利用HEX（533-580）读取结果，若用ABI仪器选择HEX荧光素对应的通道，无荧光淬灭基团；不动杆菌利用CY5（618-660）通道读取结果，若用ABI仪器选择无CY5荧光素对应的通道，无荧光淬灭基团。重复性试验的结果如图4、图5、图6：由图4可知：10株不同的大肠杆菌都能检测出阳性，结果在可控的范围之内，可见此三重荧光定量PCR对于大肠杆菌的检测比较稳定。由图5可知：10株不同的肺炎克雷伯氏菌都能检测出阳性，结果在可控的范围之内，可见此三重荧光定量PCR对于肺炎克雷伯氏菌的检测比较稳定。由图6可知：10株不同的不动杆菌都能检测出阳性，结果在可控的范围之内，可见此三重荧光定量PCR对于不动杆菌的检测比较稳定。
灵敏度试验
取1.2中复苏并稀释到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8的大肠杆菌菌液、肺炎克雷伯氏菌菌液、不动杆菌的菌液各200ul各1份于1.5ml离心管中，共21份200ul菌液。采用北京森康生物技术开发有限公司的柱式提取的试剂盒，参照说明书提取21份菌液的核酸。将稀释浓度相同的三种细菌的核酸各取10ul后充分混合，最后形成7份不同稀释度的三种细菌混合的核酸，把不同稀释度的三种细菌的混合核酸当作荧光定量PCR反应的模板。荧光定量PCR反应采用15ul反应液，10ul模板，共25ul的体系。具体的反应液配方如下：
| 组成 | 量（uL） |
| 上游引物10μmol/L-大肠杆菌 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-大肠杆菌 | 1 |
| 探针10μmol/L—大肠杆菌 | 1 |
| 上游引物10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 探针10μmol/L-肺炎克雷伯 | 1 |
| 上游引物10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 下游引物10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 探针10μmol/L-不动杆菌 | 1 |
| 10×PCR | 2 |
| MgCl2（25mmol/L） | 1.7 |
| dNTP（25mmol/L） | 2 |
| Taq酶 | 0.3 |
取配好的反应液15ul，加入混合好的三种细菌的核酸10ul，最终配成25ul的反应体系；同时设定阴性对照（反应液15ul+DEPC水10ul），进行荧光定量PCR反应。荧光定量PCR的反应参数如下设置：
第一阶段：预变性50℃/2min；95℃/3min
第二阶段：95℃ 15sec，60℃ 60sec，共40个循环，最后40℃ 10sec。
荧光收集在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。
结果读取：对于多通道PCR仪，大肠杆菌利用FAM（465-510）通道读取结果，若用ABI仪器选择FAM荧光素对应的通道，无荧光淬灭基团；肺炎克雷伯氏菌利用HEX（533-580）读取结果，若用ABI仪器选择HEX荧光素对应的通道，无荧光淬灭基团；不动杆菌利用CY5（618-660）通道读取结果，若用ABI仪器选择CY5荧光素对应的通道，无荧光淬灭基团。敏感性的结果如图7、8、9。
Claims (2)
1.一种大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量PCR检测方法，
取待测样品的核酸10ul与15ul反应液配成25ul的反应体系，然后进行荧光定量PCR反应，读取结果；
所述反应液的组成：
10μmol/L的K1-F：1μl，
10μmol/L的K1-R：1μl，
10μmol/L的T1：1μl，
10μmol/L的K2-F：1μl，
10μmol/L的K2-R：1μl，
10μmol/L的T2：1μl，
10μmol/L的K3-F：1μl，
10μmol/L的K3-R：1μl，
10μmol/L的T3:：1μl，
10×PCR ：2μl，
25mmol/L的MgCl2：1.7μl，
25mmol/L的dNTP：2μl，
Taq酶：0.3μl；
所述K1-F为：agacagagtgtgatatctac，如SEQ ID NO.1所示
所述K1-R为：aagtagaacggtttgtggttaatca，如SEQ ID NO.2所示
所述T1为：FAM-ggcgaacagttcctgattaacca-BHQ1，如SEQ ID NO.3所示
所述K2-F为：cactg gcgcgaactg gaagggcccg ，如SEQ ID NO.4所示
述K2-R为：cgcgccccagcggcgcgccaatcg，如SEQ ID NO.5所示
所述T2为：HEX-atgaaacgacctgattgcattc -BHQ1，如SEQ ID NO.6所示
所述K3-F为：tttgcttgta tcgttgtggc ttta，如SEQ ID NO.7所示
所述K3-R为：gttttgttggccaagttactc，如SEQ ID NO.8所示
所述T3为：CY5- cttcgttcgtttgctgaaag -BHQ1；如SEQ ID NO.9所示
所述荧光定量PCR反应：
第一阶段：预变性50℃/2min；95℃/3min；
第二阶段：95℃ 15sec，60℃ 60sec，共40个循环，最后40℃ 10sec；
在第二阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；
所述读取结果：
如果FAM检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有大肠杆菌；
如果HEX或VIC检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有肺炎克雷伯氏菌；
如果CY5检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有不动杆菌。
2.一种引物和探针，其组成为：
用于扩增大肠杆菌特异序列的引物和探针：
上游引物K1-F：agacagagtgtgatatctac，如SEQ ID NO.1所示，
下游引物K1-R：aagtagaacggtttgtggttaatca，如SEQ ID NO.2所示，
探针T1：FAM-ggcgaacagttcctgattaacca-BHQ1，如SEQ ID NO.3所示；
用于扩增肺炎克雷伯氏菌特异序列的引物和探针：
上游引物K2-F：cactg gcgcgaactg gaagggcccg ，如SEQ ID NO.4所示，
下游引物K2-R：cgcgccccagcggcgcgccaatcg，如SEQ ID NO.5所示，
探针T2：HEX-atgaaacgacctgattgcattc -BHQ1，如SEQ ID NO.6所示；
用于扩增不动杆菌特异序列的引物和探针：
上游引物K3-F：tttgcttgta tcgttgtggc ttta，如SEQ ID NO.7所示，
下游引物K3-R：gttttgttggccaagttactc，如SEQ ID NO.8所示，
探针T3：CY5- cttcgttcgtttgctgaaag -BHQ1，如SEQ ID NO.9所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510163845.7A CN104762392A (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量pcr检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510163845.7A CN104762392A (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量pcr检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104762392A true CN104762392A (zh) | 2015-07-08 |
Family
ID=53644482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510163845.7A Pending CN104762392A (zh) | 2015-04-09 | 2015-04-09 | 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量pcr检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104762392A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106319055A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-01-11 | 天津喜诺生物医药有限公司 | 一种三联核酸检测试剂盒 |
| CN115992270A (zh) * | 2022-08-30 | 2023-04-21 | 四川省亚中基因科技有限责任公司 | 一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物、试剂及试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104032032A (zh) * | 2014-07-07 | 2014-09-10 | 玉峰惠仁生物医药科技（北京）有限公司 | 用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组及其试剂盒 |
| CN104531887A (zh) * | 2015-01-15 | 2015-04-22 | 山东省动物疫病预防与控制中心 | 肺炎克雷伯氏菌的鉴定方法及所用引物 |
-
2015
- 2015-04-09 CN CN201510163845.7A patent/CN104762392A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104032032A (zh) * | 2014-07-07 | 2014-09-10 | 玉峰惠仁生物医药科技（北京）有限公司 | 用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组及其试剂盒 |
| CN104531887A (zh) * | 2015-01-15 | 2015-04-22 | 山东省动物疫病预防与控制中心 | 肺炎克雷伯氏菌的鉴定方法及所用引物 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ROBERTJ. CLIFFORD ET.AL: "Detection of bacterial 16s rRNA and identification of four clinically important bacterial by real-time PCR", 《PLOS ONE》 * |
| 和晋渝: "肺炎克雷伯菌的血清分型及毒力基因分布的研究", 《中国优秀硕士论文全文数据库》 * |
| 郑雪芳等: "微生物发酵床对猪舍大肠杆菌病原生物防治作用的研究", 《中国农业科学》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106319055A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-01-11 | 天津喜诺生物医药有限公司 | 一种三联核酸检测试剂盒 |
| CN106319055B (zh) * | 2016-08-30 | 2019-12-13 | 天津喜诺生物医药有限公司 | 一种三联核酸检测试剂盒 |
| CN115992270A (zh) * | 2022-08-30 | 2023-04-21 | 四川省亚中基因科技有限责任公司 | 一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物、试剂及试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gurjar et al. | Real-time multiplex PCR assay for rapid detection and toxintyping of Clostridium perfringens toxin producing strains in feces of dairy cattle | |
| CN103468811B (zh) | 小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重pcr检测引物组和试剂盒 | |
| CN103966353A (zh) | 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物 | |
| TWI810144B (zh) | 核酸偵測和定量方法及組合物 | |
| CN103498000A (zh) | 一种多重pcr法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法 | |
| CN102154497B (zh) | 食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法 | |
| CN104087676A (zh) | 多重pcr检测4种细菌的引物组及方法 | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| US9388474B2 (en) | Method for detecting toxin-producing Clostridium difficile | |
| KR101100932B1 (ko) | 병원성 미생물 검출용 프라이머, 이를 이용한 병원성 미생물의 검출방법 및 검출키트 | |
| CN106434935A (zh) | 鉴定猪多杀性巴氏杆菌和/或副猪嗜血杆菌组合物和方法 | |
| CN104762392A (zh) | 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量pcr检测方法 | |
| CN106011154B (zh) | 一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用 | |
| CN115747361B (zh) | 检测海豚链球菌的实时荧光mira和mira-lfd引物组及检测方法 | |
| CN105803064B (zh) | 检测肠杆菌科食源性致病菌的lamp方法、核酸及引物对 | |
| WO2015103710A1 (en) | Methods, reagents and kits for the assessment of bacterial infection | |
| CN109680087B (zh) | 一种甘蔗白叶病植原体和白条黄单胞菌的双重pcr检测方法及其引物组 | |
| CN104004842A (zh) | 一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重pcr引物组及检测方法 | |
| CN105624285A (zh) | 肺炎支原体荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN105624286A (zh) | 嗜肺军团菌荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN101235411A (zh) | 一种利用环介导等温扩增技术检测豚鼠气单胞菌的试剂盒 | |
| Noll et al. | Validation and application of a real-time PCR assay based on the CRISPR array for serotype-specific detection and quantification of enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 in cattle feces | |
| CN102653792B (zh) | 多重pcr检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的方法 | |
| KR20150143347A (ko) | 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형을 판별하기 위한 고감도 실시간 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형의 판별 방법 | |
| CN1316039C (zh) | 运用聚合酶链式反应技术检测坂崎肠杆菌的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150708 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |