CN104032032A - 用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌快速检测的肽核酸探针，该探针的DNA序列如SEQ NO：1、SEQ NO：2和SEQ NO：3所示。本发明还公开了应用该探针组鉴定样品中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌及其药物敏感性的试剂盒及其使用步骤。本发明省去DNA提取步骤，一般整个鉴定过程耗时不超过2个小时；且假阳性低，步骤少，效率高、敏感度高、特异性强。本发明能够迅速准确地检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌，对于保障食品安全、保证环境卫生、预防疾病传播具有重要意义。

Description

用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组及其试剂盒
技术领域
本发明涉及临床关联微生物的检测领域，具体涉及检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)亦称绿脓杆菌，为常见的条件致病菌，属于革兰氏阴性杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有其存在。经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可引起菌血症，而菌血症常是烧伤的致死性并发症。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌，是呼吸机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得性感染外，HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染，而且一旦被铜绿假单胞菌感染，常可出现晚期HIV感染的体征。
克雷伯氏菌属(Klebsiella)为肠杆菌科中一类有荚膜的革兰氏阴性杆菌，本属中肺炎克雷伯氏菌(又称肺炎杆菌)、臭鼻克雷伯氏杆菌和鼻硬结克雷伯氏菌与人类关系密切。其中尤以肺炎克雷伯氏菌最为重要，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。肺炎克雷伯氏菌为呼吸道感染的重要病原体，常引起重症肺炎，还可引起 泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病，尤其以败血症最为严重，如果得不到及时有效的治疗，病死率较高。感染多发生于住院的衰弱患者。病原体往往从上呼吸道吸入，或通过污染的人工呼吸器、雾化器或各种导管侵入人体，医务人员的双手在交叉感染中亦起重要作用。肺炎杆菌已成为医院内感染的重要致病菌之一，在某些国家中占院内感染的首位。
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界的水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。常从被感染患者的血、尿、脓液及呼吸道分泌物等标本中分离出，在非发酵菌感染中仅次于铜绿假单胞菌。医院感染性败血症和脓毒血症是不动杆菌属引起的最严重感染性疾病，病死率为32.0％，体弱者多为混合性感染，病死率更高。
肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，其骨架结构单元为(2-氨乙基)甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA亲和性，在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。
现有的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌检测方法都需要对细菌DNA进行提取，然后再进行PCR扩增，或者对菌液进行扩增，再以扩增产物进行检测，费时费工，步骤繁琐，并且 假阳性高，容易造成错判。
发明内容
本发明的目的是提供一种不需要提取DNA，不需要PCR扩增即可检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组及其试剂盒、方法，高效快捷，假阳性低。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组，其特征在于：该肽核酸探针组的DNA序列如SEQ NO：1、SEQ NO：2和SEQ NO：3所示；
其中，所述SEQ NO：1序列是：5’-CTG AAT CCA GGA GCA-3’，用于检测铜绿假单胞菌；
其中，所述SEQ NO：2序列是：5’-CAC CTA CAC ACC AGC-3’，用于检测肺炎克雷伯氏菌；
其中，所述SEQ NO：3序列是：5’-GGC CAG ATG GCT GCC-3，用于检测鲍曼不动杆菌；
其中，所述SEQ NO：1序列、SEQ NO：2序列或SEQ NO：3序列可分别使用，用来分别检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌；也可同时使用，用来同时检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌。
所述肽核酸探针组能在铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的rRNA、rDNA或互补的rRNA序列中检测靶序列。
所述肽核酸探针组中检测铜绿假单胞菌的探针应至少包含86％结构上类似于SEQ NO：1的DNA序列；所述肽核酸探针组中 检测肺炎克雷伯氏菌的探针应至少包含86％结构上类似于SEQ NO：2的DNA序列；所述肽核酸探针组中检测鲍曼不动杆菌的探针应至少包含86％结构上类似于SEQ NO：3的DNA序列。
所述肽核酸探针组至少连接到一种可检测的级分。
所述可检测的级分的类型选自：缀合物、生色团、荧光团、放射性同位素、酶、半抗原或发光化合物。
所述荧光团基团是下列中的至少一种：荧光团Alexa系列、Alexa Fluor系列、花青苷、5-(及-6)羧基-2’、7′-二氯荧光素、5-ROX(5-羧基-X-若丹明，三乙基铵盐)。
本发明还提供用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌菌株及药物敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1～6中任一项的探针。。
所述试剂盒还包含下列溶液：固定溶液、杂交溶液及药物敏感性检测溶液；
其中，固定溶液包含多聚甲醛和乙醇；
其中，杂交溶液包含曲拉通和甲酰胺；
其中，药物敏感性检测溶液是M-H液体。
所述固定溶液包含2～8％(wt/vol)的多聚甲醛和25～75％(vol/vol)的乙醇；所述杂交溶液的成分及组成是：10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，50％(v/v)甲酰胺，0.1％(wt/vol)焦磷酸钠，0.2％(wt/vol)聚乙烯基吡咯啉，0.2％(wt/vol)FICOLL(聚蔗糖)，5mM EDTA二钠，0.1％(vol/vol)Triton X-100(曲拉通)，50mM Tris-HCl。
本发明还提供用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍 曼不动杆菌菌株及药物敏感性的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括下列步骤：
(a)固定：将待检样品放入固定溶液中进行固定；
(b)杂交：使肽核酸探针与待检样品在杂交溶液中接触，肽核酸探针与存在于待检样品中的微生物的靶序列杂交；
(c)洗涤：对杂交后的样品进行清洗；
(d)菌种鉴定结果观测；
(e)对数期生长的细胞在设定抗菌药物浓度的M-H液体中振荡培养；
(f)取样固定、杂交、洗涤，观测计数荧光值；
(g)计数荧光比值，确定药物敏感性。
所述待检样品源于血、空气、水、食品、活组织检查及其它医学检查。
所述杂交结果通过荧光呈现。
本发明中的固定溶液由于使用多聚甲醛和乙醇固定细胞，固定效果更佳。
本发明的杂交液中加入一定比例的甲酰胺，能使杂交的灵敏度更高，曲拉通可以增加细胞膜的穿透性。
本发明还提供用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组的用途，所述肽核酸探针组用于生物学样品中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的检测。
本发明还提供用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌菌株及药物敏感性的试剂盒的用途，所述试剂盒应用于 样品中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的鉴定及其药物敏感性的检测。
本发明还提供用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌菌株及药物敏感性的试剂盒的使用方法的用途，所述使用方法用于生物学样品中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的鉴定及其药物敏感性的检测。
本发明的PNA探针具有很好的特异性，灵敏性很高，1个或2个不同核苷酸相关的核苷酸序列都能很好地区分开。
在本发明中描述的PNA探针能检测rRNA，对应于rRNA的基因组序列(rDNA)，或其互补序列，允许靶物种的特异性检测。
在本发明中描述的PNA探针的核苷酸序列选自至少86％结构上类似于表1中序列：
表1 探针序列
物种 名称 特征序列
铜绿假单胞菌 SEQ NO：1 5’-CTG AAT CCA GGA GCA-3’
肺炎克雷伯氏菌 SEQ NO：2 5’-CAC CTA CAC ACC AGC-3’
鲍曼不动杆菌 SEQ NO：3 5’-GGC CAG ATG GCT GCC-3
首先进行PNA-FISH探针的开发，由于不了解探针适宜的碱基数量，因此需先测试对于探针应用理想的碱基数。探针之内的大量的核苷酸允许对应靶点高探针亲和性，在非常高温工作，而低核苷酸数暗示结合自由能对于杂交发生不足。在此情况下，发现对12～18个核苷酸能达到最佳结果。
对于各特定情况，研究最佳实验FISH条件，由于探针杂交成功依赖于杂交条件，以及依赖于固定/渗透化及洗涤步骤。首先考虑 之前公开的文献资料中提及的用于检测细菌的条件。预测固定/渗透化可以与早先描述相同的方式进行，即，用4％多聚甲醛和50％乙醇。因此，主要研究的参数是温度、甲酰胺浓度和杂交及洗涤时间，由于来自之前探针的这些条件，特征性不可外推到此新探针。
因为在不知道哪个因素负面地影响PNA-FISH方法的情况下必需同时优化这些参数，此过程复杂且耗时。在其他研究者公开的文献中提及，迄今为止的探针都因效率低下，而使它们很难实际应用于PNA-FISH方法。
在此情况中，最佳时间、温度和甲酰胺浓度鉴定为于55℃和30％甲酰胺下60分钟的杂交和30分钟的洗涤步骤。
良好成功的杂交之后可通过荧光显微镜检测特定微生物及其数量。
对此，考虑适合检测/鉴定的稳定的探针/靶复合物的PNA探针级分也重要。探针的可检测的级分选自下列组之一：缀合物、生色团、荧光团、放射性同位素、酶、半抗原或发光化合物。
本发明中描述的方法包括样品与PNA探针的接触。根据方法，关于它们的关联在适当的杂交条件下PNA序列与靶序列的杂交来检测或鉴定生物学样品之中的微生物。因而分析基于荧光、形态和数量的判断的独特测试。相反，目前用于分析微生物及其药物敏感性的传统方法基于涉及几个测试的多表型特征。
本发明的主题还包括适合进行用于测定，即，检测或鉴定生物学样品之中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)及其药物敏感性的试剂盒。试剂盒包含三种PNA探针、 进行原位杂交和药物敏感性测试所需要的其他选择的试剂或化合物。
在更可优选的实施方法中，适合进行铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)及其药物敏感性检测或鉴定的试剂盒，包含固定，杂交洗涤溶液和药物敏感性检测溶液。
本发明的探针应用在杂交之前不涉及用于细胞膜渗透化的试剂或酶，PNA探针可直接应用于载玻片样品上。
本发明中所使用的术语定义：
(a)如本文所用，术语“核苷酸”包括使用与核酸相关的技术的人通常知道的天然的和人工分子而由此产生特异性结合核酸的化合物；
(b)术语“核苷酸序列”与指称含有亚单位，在此情况中核苷酸的化合物的聚合物；
(c)术语“靶序列”指称旨在测试中检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的核苷酸序列，其中核苷酸探针的部分被设计为杂交；
(d)术语“PNA探针”指称具有核苷酸序列且特异于与目的微生物的靶序列杂交的PNA的亚单位的聚合物。PNA分子是带负电的糖-磷酸主链结构被由重复的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元形成的非手性及电中性取代的DNA模拟物；
(e)术语“可检测的级分”指可连接于探针而由此致使探针通 过仪器或方法可检测的分子；
(f)术语“样品”指称可含有用于检测的微生物或靶序列的任何生物学样品，包括血、空气、水、食品、活组织检查及其它医学检查。
(g)术语“药物敏感性”指称特定抗生素药物最小使用浓度能杀灭铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。
(h)缀合物：有别于生色团、荧光团、放射性同位素、酶、半抗原或发光化合物之外其他可连接于探针而由此致使探针通过仪器或方法可检测的分子。
本发明的PNA探针概念
本发明的PNA探针在负责与微生物种属相关的保守区中选择作为具有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)种特征的靶序列。由此，将各数据库的假单胞菌(Pseudomonas)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的16S rRNA序列进行比对，在排序后的变异区域设计了铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌特异性探针，探针序列见表1。
本发明的PNA探针包含15～18个核苷酸序列。根据这些标准，选择至少86％结构上类似于SEQ NO：1、SEQ NO：2和SEQ NO：3的序列，尽管此探针被描述用于检测生物学样品中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)以及其药物敏感性，但它们不必仅特定用于此情况。
5’-CTG AAT CCA GGA GCA-3’(SEQ NO：1)
5’-CAC CTA CAC ACC AGC-3’(SEQ NO：2)
5’-GGC CAG ATG GCT GCC-3(SEQ NO：3)
替代性地，本发明也涵盖探针核苷酸序列中的变异。该变异可尤其包括缺失、插入。因而，如所述，探针核苷酸序列应至少86％同源于以上提及的序列。
PNA探针的可检测的级分
不限于下列实施例，PNA探针的可检测的级分可包括各种类型的分子，尤其诸如缀合的葡聚糖，生色团，荧光团，放射性同位素，酶，半抗原，化学发光化合物。
作为一例，荧光团类之中可优选使用(但不限于)：Alexa Fluor系列，花青苷，5-(及-6)羧基-2′，7′-二氯荧光素，5-ROX(5-羧基-X-若丹明，三乙基铵盐)。
方法
本发明公开了用于检测样品中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)以及其药物敏感性的方法。使用的PNA探针包含至少86％结构上类似于SEQ NO：1、2和3的核苷酸序列。
方法可涵盖使具有此文献中描述的一种或更多PNA探针的样品与细菌靶序列之间在充分的杂交条件或充分的原位杂交条件下接触(如见于实施例)。荧光原位杂交(FISH或PNA-FISH)或实时PCR 是用于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)及其药物敏感性分析的测试形式。
由此，方法可分为：样品制备，药物敏感性试验，细胞固定，杂交，洗涤及结果可视化。此方法可在粘附的或悬浮的细胞中进行。
杂交条件
控制靶序列与PNA探针杂交严格度的几个因素，这些因素包括：使用的甲酰胺(或其他化学变性剂)的百分比、盐浓度和离子强度、杂交温度、去污剂浓度、杂交缓冲液的pH值和其他。为了测定杂交最佳条件，必需固定不同因子，并个别变化各因素，直到达到期望的辨别程度。
靶序列与样品中的另一非靶序列越接近，限定影响杂交的各种因素需要更大程度的严格控制。在本发明中非靶序列可与靶序列具有仅1个不同核苷酸，像这样水平的区别以避免PNA探针与非靶序列的非特定杂交是必需的。
样品制备
待分析的样品可尤其从血、空气、水、食品和医学检查中得到。在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)检测情况中是以悬浮液的形式。在水和空气样品中，将样品通过黑色聚碳酸酯膜或相当体过滤，然后液体培养；血液和医学检查样品直接进行液体培养；对于食品样品，在将样品浸没到水或到无菌缓冲溶液中之后于细菌浆式捣碎器中捣碎，分离培养。培养物制成悬浮液直接用于杂交过程。
试剂盒
本发明也涉及允许检测样品中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和/或鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)及其药物敏感性的试剂盒。本文之前已经提及此试剂盒中使用的PNA探针，其特征和涉及的方法。
本发明的试剂盒包含一种至少86％结构上类似于SEQ NO：1、2和3的核苷酸序列，及选择用于进行测试的其他试剂或组合物。
本发明的PNA探针，它们的特征、方法和试剂盒适合用于分析在目的生物细胞中存在或不在目的生物细胞之内的核酸序列。本发明可用于生物的分析或从目的生物提取的或来源的核酸的分析，表明本发明不限制靶序列来源。
操作步骤
细菌株
细菌株是临床分离菌株及美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的参照菌株。将一滴各菌株培养物加到载玻片，置于55℃干燥。
固定
为了防止16S rRNA杂交期间的损失，将样品浸没于4％多聚甲醛(wt/vol)和50％乙醇(vol/vol)溶液各10分钟。
杂交
在此步骤中，将一滴包含10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，10mMNaCl，50％(v/v)甲酰胺，0.1％(wt/vol)焦磷酸钠，0.2％(wt/vol)聚乙烯基吡咯啉，0.2％(wt/vol)FICOLL，5mM EDTA二钠，0.1％(vol/vol)Triton X-100，50mM Tris-HCl和200nM的PNA探针的杂 交溶液加入样品。样品用盖玻片覆盖以确保探针扩展，并温育60分钟。此期间，探针可进入细胞膜，并结合于16S rRNA互补序列。盖玻片和样品周围的湿纸的存在对于防止杂交溶液蒸发是必要的。
洗涤
杂交之后，去除盖玻片，并将载玻片浸入预加温的由5mM Tris碱，15mM NaCl和1％(vol/vol)Triton X-100(pH10)组成的洗涤溶液。洗涤步骤在相同的杂交温度进行30分钟。
药物敏感性试验
在此试验中，将处于对数生长期的细菌调整浓度至5×105cfu/mL，在设定抗生素药物浓度的M-H液体中于35℃震荡培养2小时，取样固定、杂交、洗涤和荧光计数，计算荧光比值。
结果
细菌鉴定结果通过在装有适用于探针之内的荧光色素信号的滤光片(即，其偶联于探针的荧光色素的发射波长)的荧光显微镜中观察获得，绿色荧光代表铜绿假单胞菌，红色荧光代表肺炎克雷伯氏菌，蓝色荧光代表鲍曼不动杆菌；细菌药物敏感性通过荧光比值的范围确定，敏感：荧光比值≤0.75，中介：0.75＜荧光比值＜1.4，耐药：荧光比值≥1.4。
探针的敏感度和特异性理论验证
为了验证探针的敏感度和特异性，用ProbeCheck与NCBI数据库对探针进行了验证。ProbeCheck的验证结果显示：探针SEQ NO：1能检测到数据库中所有的238个铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的全部。而其他检测到的非目标细菌有33株与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)亲缘关系较近，但是只有5株荧 光假单胞菌为条件致病菌，其余28株为植物病原菌，对人不构成威胁，更有2株与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)关系疏远，一株为革兰氏阳性菌，一株为北极寒带细菌，也并非致病菌(表2)。随后将PNA探针与大亚基(23S/28S)数据库匹配检测，发现探针SEQ NO：1不与23S rRNA存在错配；探针SEQ NO：2能检测到数据库中所有的57个目标肺炎克雷伯氏菌的全部菌株。而其他检测到的非目标细菌，一株与肺炎克雷伯氏菌亲缘关系很近，为同一菌属的变栖克雷伯氏菌，另一株亲缘关系较为疏远的产气肠杆菌，他们都是不常见的条件致病菌(表2)。随后将PNA探针与小亚基(16S/18S)数据库匹配检测，发现探针SEQ NO：2不与16S rRNA存在错配；探针SEQ NO：3能检测到数据库中所有的420个目标鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)中的417个，有3个菌株因为2～3个核苷酸差异可能检漏。而其他检测到的非目标细菌，与鲍曼不动杆菌同属的其他病原菌，但未并不常见的致病菌(表2)。随后将PNA探针与大亚基(23S/28S)数据库匹配检测，发现探针SEQ NO：3不与23S rRNA存在错配。
经过ProbeCheck验证，本发明的探针具有很高的灵敏度和特异性。
表2 ProbeCheck检测PNA探针的敏感度和特异性
特异性＝没有检测到的非目标菌菌株数/数据库中所有的非目标菌菌株数；
敏感度＝检测到的目标菌菌株数/数据库中所有的目标菌菌株数。
本发明采用PNA探针结合原位荧光杂交(FISH)技术，与传统生化鉴定比较，本发明不需要对细菌进行DNA提取，不需要细胞膜渗透化，可直接对血、空气、水、食品、活组织等各种样品进行检测。因此本发明可节约大量时间，省却提取DNA等繁琐步骤，用时少，效率高，若不计细菌生长繁殖时间，一般耗时不超过2个小时。并且，本发明的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，敏感度高、特异性强，较PCR法等传统方法假阳性大大降低。本发明能够迅速准确地检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌，对于保障食品安全、保证环境卫生、预防疾病传播具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1，PNA-FISH敏感度验证
PNA探针：
Alexa488-O-CTG AAT CCA GGA GCA(SEQ NO：1)
Alexa546-O-CAC CTA CAC ACC AGC(SEQ NO：2)
Alexa350-O-GGC CAG ATG GCT GCC(SEQ NO：3)
对不同亚种的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌进行敏感度验证。实验步骤如下所述。
细菌株
细菌株是临床分离菌株及美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的参照菌株。将一滴各菌株培养物加到载玻片，置于55℃干燥。
固定
为了防止16S rRNA杂交期间的损失，将样品浸没于4％多聚甲醛(wt/vol)和50％乙醇(vol/vol)溶液各10分钟。
杂交
在此步骤中，将一滴包含10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，10mMNaCl，50％(v/v)甲酰胺，0.1％(wt/vol)焦磷酸钠，0.2％(wt/vol)聚乙烯基吡咯啉，0.2％(wt/vol)FICOLL，5mM EDTA二钠，0.1％(vol/vol)Triton X-100，50mM Tris-HCl和200nM的PNA探针的杂交溶液加入样品。样品用盖玻片覆盖以确保探针扩展，并温育60分钟。此期间，探针可进入细胞膜，并结合于16S rRNA互补序列。盖玻片和样品周围的湿纸的存在对于防止杂交溶液蒸发是必要的。
洗涤
杂交之后，去除盖玻片，并将载玻片浸入预加温的由5mM Tris碱，15mM NaCl和1％(vol/vol)Triton X-100(pH10)组成的洗涤溶液。洗涤步骤在相同的杂交温度进行30分钟。
药物敏感性试验
在此试验中，将处于对数生长期的细菌调整浓度至5×105cfu/mL，在设定抗生素药物浓度的M-H液体中于35℃震荡培养2小时，取样固定、杂交、洗涤和荧光计数，计算荧光比值。
结果
细菌鉴定结果通过在装有适用于探针之内的荧光色素信号的滤 光片(即，其偶联于探针的荧光色素的发射波长)的荧光显微镜中观察获得，绿色荧光代表粪肠球菌，红色荧光代表其他肠球菌；细菌药物敏感性通过荧光比值的范围确定，敏感：荧光比值≤0.75，中介：0.75＜荧光比值＜1.4，耐药：荧光比值≥1.4。
每次试验(包括以下实例)都同步进行阳性对照和阴性对照试验，阳性对照试验，用DAPI或PI染色替代其他探针，而阴性对照试验中，用空白替代其他探针。结果显示，所有的铜绿假单胞菌与探针SEQ NO：1结合；所有的肺炎克雷伯氏菌与探针SEQ NO：2结合；所有的鲍曼不动杆菌与探针SEQ NO：3结合(表3、4和5)。结果与预期的一致，SEQ NO：1～3有很好的敏感性。
表3 铜绿假单胞菌PNA探针敏感度试验
注：——为医院分离，无菌株编号描述。
表4 肺炎克雷伯氏菌PNA探针敏感度试验
注：——为医院分离，无菌株编号描述。
表5 鲍曼不动杆菌PNA探针敏感度试验
——医院分离，无菌株编号描述。
实施例2PNA-FISH特异性验证
选取铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯克菌以及鲍曼不动杆菌等其它致病菌，包括葡萄球菌、肠球菌、大肠埃希菌等常见致病菌，试验步骤及方法如实施例1所述。
结果显示探针SEQ NO：1～3不能与非目标菌株结合(表6)。与预期结果一致，SEQ NO：1～3有很好的特异性。
表6 PNA探针特异性验证
物种 编号 SEQ NO：1 SEQ NO：2 SEQ NO：3
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 + - -
Klebsiella pneumoniae ATCC13884 - + -
Acinetobacter baumannii ATCC19606 - - +
Staphylococcus epidermidis ATCC12228 - - -
Staphylococcus aureus ATCC29213 - - -
Staphylococcus aureus ATCC25923 - - -
Enterococcus faecalis —— - - -
Escherichia coli —— - - -
Enterococcus Faecium —— - - -
Enterococcus faecalis —— - - -
Streptococcus pneumoniae —— - - -
Streptococcus pyogenes —— - - -
Enterobacter cloacae —— - - -
Streptococcus viridans —— - - -
——医院分离，无菌株编号描述。
实施例3药物敏感性试验
选取铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌的质控菌 株与医院分离得到的不同药物敏感性铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌菌株进行药物敏感性试验，试验步骤及方法如实施例1所述，每次试验同时以K-B法作为阳性对照。结果见表7、8和9。
结果表明本发明能较好地检测目标菌株的药物敏感性。
表7 铜绿假单胞菌菌药物敏感性试验
注：A：荧光比值法；B：K-B法；S：敏感；I：中介；R：耐药
表8 肺炎克雷伯菌药物敏感性试验
注：A：荧光比值法；B：K-B法；S：敏感；I：中介；R：耐药
表9 鲍曼不动杆菌药物敏感性试验
注：A：荧光比值法；B：K-B法；S：敏感；I：中介；R：耐药
本发明采用PNA探针结合原位荧光杂交(FISH)技术，与传统生化鉴定比较，不需要对细菌进行DNA提取，不需要细胞膜渗透化，可直接对血、空气、水、食品、活组织等各种样品进行检测。因此本发明可节约大量时间，省却提取DNA等繁琐步骤，若不计细菌生长繁殖时间，一般耗时不超过2个小时。本发明的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等传统方法假阳性大大降低。本发明能够迅速准确地检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌，对于保障食品安全、保证环境卫生、预防疾病传播具有重要意义。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (15)

1.用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组，其特征在于：该肽核酸探针组的DNA序列如SEQ NO：1、SEQ NO：2和SEQ NO：3所示；
其中，所述SEQ NO：1序列是：5’-CTG AAT CCA GGA GCA-3’，用于检测铜绿假单胞菌；
其中，所述SEQ NO：2序列是：5’-CAC CTA CAC ACC AGC-3’，用于检测肺炎克雷伯氏菌；
其中，所述SEQ NO：3序列是：5’-GGC CAG ATG GCT GCC-3，用于检测鲍曼不动杆菌；
其中，所述SEQ NO：1序列、SEQ NO：2序列或SEQ NO：3序列可分别使用，用来分别检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌；也可同时使用，用来同时检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌。
2.如权利要求1所述的用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组，其特征在于，所述肽核酸探针组能在铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的rRNA、rDNA或互补的rRNA序列中检测靶序列。
3.如权利要求1所述的用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组，其特征在于，所述肽核酸探针组中检测铜绿假单胞菌的探针应至少包含86％结构上类似于SEQ NO：1的DNA序列；所述肽核酸探针组中检测肺炎克雷伯氏菌的探针应至少包含86％结构上类似于SEQ NO：2的DNA序列；所述肽核酸探针组中检测鲍曼不动杆菌的探针应至少包含86％结构上类似于SEQ NO：3的DNA序列。
4.如权利要求1～3任一所述的用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组，其特征在于，所述肽核酸探针组至少连接到一种可检测的级分。
5.如权利要求4所述的用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组，其特征在于，所述可检测的级分的类型选自：缀合物、生色团、荧光团、放射性同位素、酶、半抗原或发光化合物。
6.如权利要求5所述的用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组，其特征在于，所述荧光团基团是下列中的至少一种：荧光团Alexa系列、Alexa Fluor系列、花青苷、5-(及-6)羧基-2’、7′-二氯荧光素、5-ROX。
7.用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌菌株及药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～6中任一项的探针。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含下列溶液：固定溶液、杂交溶液及药物敏感性检测溶液；
其中，固定溶液包含多聚甲醛和乙醇；
其中，杂交溶液包含曲拉通和甲酰胺；
其中，药物敏感性检测溶液是M-H液体。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述固定溶液包含2～8％的多聚甲醛和25～75％的乙醇；所述杂交溶液的成分及组成是：10％硫酸葡聚糖，10mM NaCl，50％甲酰胺，0.1％焦磷酸钠，0.2％聚乙烯基吡咯啉，0.2％FICOLL，5mM EDTA二钠，0.1％Triton X-100，50mM Tris-HCl。
10.用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌菌株及药物敏感性的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括下列步骤：
(a)固定：将待检样品放入固定溶液中进行固定；
(b)杂交：使肽核酸探针与待检样品在杂交溶液中接触，肽核酸探针与存在于待检样品中的微生物的靶序列杂交；
(c)洗涤：对杂交后的样品进行清洗；
(d)菌种鉴定结果观测；
(e)对数期生长的细胞在设定抗菌药物浓度的M-H液体中振荡培养；
(f)取样固定、杂交、洗涤，观测计数荧光值；
(g)计数荧光比值，确定药物敏感性。
11.如权利要求10所述的使用方法，其特征在于，所述待检样品源于血液、空气、水、食品、活组织检查及其它医学检查。
12.如权利要求10所述的使用方法，其特征在于，其杂交结果通过荧光呈现。
13.如权利要求1～6任一所述的用于荧光原位杂交检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的肽核酸探针组的用途，其特征在于，所述肽核酸探针组用于样品中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的检测。
14.如权利要求7～9任一所述的用于检测铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌菌株及药物敏感性的试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒用于生物学样品中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的鉴定及其药物敏感性的检测。
15.如权利要求10～12任一所述的使用方法的用途，其特征在于，所述使用方法用于样品中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的鉴定及其药物敏感性的检测。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762392A (zh) * 2015-04-09 2015-07-08 山东省动物疫病预防与控制中心 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量pcr检测方法
CN116064870A (zh) * 2022-11-02 2023-05-05 中国医学科学院北京协和医院 碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法
CN116121409A (zh) * 2022-11-04 2023-05-16 迪飞医学科技(南京)有限公司 一种多重qPCR检测细菌的探针引物组、试剂盒以及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6664045B1 (en) * 1998-06-18 2003-12-16 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of microorganisms
WO2011028494A2 (en) * 2009-08-24 2011-03-10 Trustees Of Boston University Label-free sensing of pna-dna complexes using nanopores

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6664045B1 (en) * 1998-06-18 2003-12-16 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of microorganisms
WO2011028494A2 (en) * 2009-08-24 2011-03-10 Trustees Of Boston University Label-free sensing of pna-dna complexes using nanopores

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王晓玲: "用肽核酸快速检验、鉴定和计数瓶装水中的铜绿假单胞菌", 《中国食品卫生杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762392A (zh) * 2015-04-09 2015-07-08 山东省动物疫病预防与控制中心 大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和不动杆菌的三重荧光定量pcr检测方法
CN116064870A (zh) * 2022-11-02 2023-05-05 中国医学科学院北京协和医院 碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法
CN116121409A (zh) * 2022-11-04 2023-05-16 迪飞医学科技(南京)有限公司 一种多重qPCR检测细菌的探针引物组、试剂盒以及检测方法
CN116121409B (zh) * 2022-11-04 2023-10-24 迪飞医学科技(南京)有限公司 一种多重qPCR检测细菌的探针引物组、试剂盒以及检测方法

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