CN116064870A - 碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法 - Google Patents

碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法，引物组包括用于检测碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸的引物对与探针，分别如SEQ IDNO.1‑SEQ ID NO.27所示。本发明的检测方法直接从直肠拭子样本中检测碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸，无需核酸提取步骤，具有耗时短、操作简便、覆盖率广、特异性好、防污染等优点。

Description

碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与 方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组、试剂盒与方法。
背景技术
碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)为肠杆菌科细菌对多利培南、厄他培南、美罗培南或亚胺培南不敏感，或者证实肠杆菌科细菌产生碳青霉烯酶。其中肠杆菌科包括62个属，常见引起人类感染的有10个属，是重要的临床感染病原菌。碳青霉烯类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强并对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点。随着其广泛应用，耐药快速增长，其中CRE由于高度耐药、传播速度快、致死率高而备受关注。
大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌是重要的条件致病菌，在免疫力低下的患者中可引起严重甚至致死性的感染。碳青霉烯类抗菌药物作为目前临床上用于细菌感染强有力的一类抗菌药物，抗菌作用非常强，并且抗菌谱也广，包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等。
但是随着碳青霉烯类抗菌药物的大量使用，产生了碳青霉烯类抗菌药物不敏感的情况，甚至产生了耐药细菌，这极大地限制了碳青霉烯类抗菌药物的使用，产生这一现象的重要原因是菌株获得了碳青霉烯酶基因。其中由质粒携带的碳青霉烯酶基因由于其耐药基因环境存在介导转移的基因元件，使得其易于在不同细菌间转移，造成了碳青霉烯酶耐药性的广泛传播，成为近年临床微生物学领域备受关注的热点之一。碳青霉烯类抗生素耐药菌的出现和流行，给临床抗感染治疗和医院内感染控制带来了极大困难。基于PCR分子诊断技术对临床样本进行耐药基因的检测，为感染防控措施的制定提供科学依据，为临床感染性疾病的诊治争取宝贵时间。
目前现行的病毒诊断方法：
Kirby-Bauer法初筛试验：不同的碳青霉烯类抗生素、不同的细菌、不同的耐药机制，K-B法的选择用药不同，如法罗培南目前被认为是检测产KPC酶菌株最好的指示药物，FDA推荐厄他培南、亚胺培南、美罗培南均可用于肠杆菌科的碳青霉烯类耐药的筛选，而亚胺培南扩展到对碳青霉烯类耐药的不动杆菌属和铜绿假单胞菌的筛选，美罗培南再扩展到对碳青霉烯类耐药的嗜水气单胞菌、蜂房哈弗尼亚菌、多杀巴斯德菌、沙门菌属和志贺菌属的筛选。
纸片筛选及协同试验：(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2017年推荐的改良碳青霉烯类灭活试验(Carbapenem inactivation method，CIM)简便易行，CIM可以检测出肠杆菌科的多种耐药基因包括KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48和OXA-23，根据基因的不同，与PCR方法检测的结果符合率达83％～100％。
纸片协同试验为简单、价廉且可靠的检测和鉴别CRE表型的检测方法，可在7h内快速鉴定KPC、金属酶和OXA-48型碳青霉烯酶，对指导临床救治和感染控制及流行病学监测意义重大。
Hodge试验：CLSI5于2015年推荐改良Hodge试验(Modified Hodge test,MHT)筛查CRE，仅适用于肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的筛查。MHT检测CRE的敏感性和特异性分别为89.65％和96.77％。但对金属酶的检测敏感性较差，假阳性和假阴性的存在是此方法的弊端。
显色培养基：科玛嘉显色培养基筛选KPC，内含有抑制革兰氏阳性菌和CSE的成分，作者比较科玛嘉KPC筛选用麦康凯琼脂培养(贴碳青霉烯类纸片)和PCR方法检测KPC基因，敏感性和特异性分别达到92.7％和95.9％，而PCR方法为100％和98.4％。
Carba NP试验：Carba NP(CNP)试验，为检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的表型确证方法。该方法是通过细菌提取物对亚胺培南的水解而改变pH值，导致指示剂的颜色变化而判断，特点是快速、简便、低耗，不需要特殊设备，大部分微生物实验室可以开展，并可检测多种碳青霉烯酶。CNP试验检测106株CRE的敏感性和特异性分别为66.04％和90.48％。
PCR及测序：PCR除检测是否产生碳青霉烯酶外，亦可检测碳青霉烯酶基因类型，具有准确、灵敏、特异的优越性；但其缺点为：需要特殊的实验室条件及仪器设备、只对靶基因特异、对未检测的特异性碳青霉烯酶基因可出现假阴性。在方法学观察研究中，PCR的敏感性为97％，明显高于科玛嘉显色培养或者选择性培养，检测时间仅为24h，较培养法(64～72h)明显缩短(P＜0.000 1)，PCR是最好的筛选CRE的方法。
但是现有的引物与探针在受到其他细菌的干扰时，可能会出现误诊的情况，同时现有的试剂盒检测不够全面。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了首先提供了碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组。
本发明其次提供了碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的试剂盒。
本发明最后提供了碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测方法。
本发明的方法直接从直肠拭子样本中检测碳青霉烯耐药基因和4种病原体，具有耗时短、操作简便、灵敏度高、特异性好等优点，具备良好的临床应用前景。本发明的方法具有简单、快速、高灵敏度的优点。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组，所述的碳青霉烯耐药基因为OXA、KPC、VIM、IMP与NDM，所述的病原体为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌与鲍曼不动杆菌；所述试剂盒包括用于检测碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸的引物对与探针；
其中，OXA基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
KPC基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
VIM基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
IMP基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
NDM基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；
肺炎克雷伯菌的引物对与探针分别如SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18所示；
大肠埃希菌的引物对与探针分别如SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；
铜绿假单胞菌的引物对与探针分别如SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24所示；
鲍曼不动杆菌的引物对与探针分别如SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.26和SEQ IDNO.27所示。
本发明第二方面提供了包括上述引物组的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒，还包括了CRE-全自动检测管。
作为本发明的一种优选方案，所述CRE-全自动检测管由上至下依次包括裂解-核酸结合磁珠区，多个磁珠-核酸清洗区与多个核酸洗脱-核酸扩增区。
作为本发明的一种优选方案，所述的核酸洗脱-核酸扩增区包括反应区1，反应区2，反应区3以及反应区4，所述反应区1用于检测OXA、KPC与VIM，所述反应区2用于检测IMP，所述反应区3用于检测NDM，肺炎克雷伯菌与鲍曼不动杆菌，所述反应区4用于检测大肠埃希菌与铜绿假单胞菌。
作为本发明的一种优选方案，还包括内标，所述内标包括RNase P基因的引物对与探针，RNase P基因的引物对与探针如SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。
作为本发明的一种优选方案，还包括PCR buffer，20mmol/L dNTPs，热启动Taq酶与UDG酶。
作为本发明的一种优选方案，所述反应区1的反应体系为OXA的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，KPC的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，VIM的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，PCR buffer的工作浓度为0.5X～2X，20mmol/LdNTPs的工作浓度为100μM～300μM，热启动Taq酶的工作浓度为1U～5U与UDG酶的工作浓度为0.5U～2U；
所述反应区2的反应体系为IMP的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，PCR buffer的工作浓度为0.5X～2X，20mmol/L dNTPs的工作浓度为100μM～300μM，热启动Taq酶的工作浓度为1U～5U与UDG酶的工作浓度为0.5U～2U；
所述反应区3的反应体系为NDM的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，肺炎克雷伯菌的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，鲍曼不动杆菌的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，PCR buffer的工作浓度为0.5X～2X，20mmol/L dNTPs的工作浓度为100μM～300μM，热启动Taq酶的工作浓度为1U～5U与UDG酶的工作浓度为0.5U～2U；
所述反应区4的反应体系为大肠埃希菌的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，铜绿假单胞菌的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，PCR buffer的工作浓度为0.5X～2X，20mmol/L dNTPs的工作浓度为100μM～300μM，热启动Taq酶的工作浓度为1U～5U与UDG酶的工作浓度为0.5U～2U。
本发明第三方面提供了采用上述试剂盒用于检测碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸的方法。
作为本发明的一种优选方案，包括以下步骤：
1)采集待测样本；
2)加入提取液与待测样本，完成DNA提纯；
3)将提纯后的DNA进行PCR扩增，荧光探针与靶标发生特异性结合而产生荧光信号；采集荧光信号，对荧光信号变化分析并得到判定检验结果。
作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，扩增程序为：94℃，5min；94℃，5s，60℃，30s，40个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明设计并合成了碳青霉烯耐药基因及4种病原体的引物对于探针；
2)本发明的试剂盒，碳青霉烯耐药基因检测，OXA-48(大肠埃希菌)、KPC-2(肺炎克雷伯菌)、VIM-4(铜绿假单胞菌)、NDM-6(大肠埃希菌)的灵敏度都为10CFU/mL；IMP-5(铜绿假单胞菌)的灵敏度都为2CFU/mL；肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的灵敏度都为100CFU/mL，因此灵敏度高；对与临床常见的30种致病菌进行测试，没有交叉反应，因此特异性高；
3)本发明的检测方法直接从直肠拭子样本中检测碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸，无需核酸提取步骤，具有耗时短、操作简便、覆盖率广、特异性好、防污染等优点。
附图说明
图1是本发明CRE-全自动检测管的示意图。
图中，1.裂解-核酸结合磁珠区；2.磁珠-核酸清洗区；3.核酸洗脱-核酸扩增区。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参见图1，本发明的试剂盒中包括CRE-全自动检测管，由上至下依次包括裂解-核酸结合磁珠区1，多个磁珠-核酸清洗区2与多个核酸洗脱-核酸扩增区3。
磁珠-核酸清洗区有4个，核酸洗脱-核酸扩增区有4个，核酸洗脱-核酸扩增区与磁珠-核酸清洗区一一对应。
在第1个(从左到右第一个，简称反应区1)扩增区中检测碳青霉烯耐药基因(OXA、KPC、VIM)特异性的基因序列，第2个扩增区(简称反应区2)中检测碳青霉烯耐药基因(IMP)特异性的基因序列，第3个扩增区(简称反应区3)中检测碳青霉烯耐药基因(NDM)及2种病原体(肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌)特异性的基因序列，第4个扩增区(简称反应区4)中检测2种病原体(大肠埃希菌、铜绿假单胞菌)特异性的基因序列。
本发明的试剂盒预装的试剂还包括内标(简称IC)，由特异性检测人RNase P的PCR系统组成，用以监测采样、提取、纯化和扩增反应是否有效。CRE-全自动检测管预装有核酸纯化试剂、核酸洗脱试剂和PCR反应试剂。上机前，用户只需加入CRE-提取液和待测样本，在适用仪器控制下就能自动完成样本中DNA的提纯，提纯后的DNA与PCR反应试剂被适用仪器混匀加热后进行PCR扩增，同时荧光探针与靶标发生特异性结合而产生荧光信号。适用仪器实时采集荧光信号并通过对荧光信号变化的分析实现自动判定检验结果。
实施例1：热启动Taq酶和dNTP工作浓度的优选范围和最优值
1.材料与方法：
表1.试剂和仪器
Figure BDA0003922352680000051
Figure BDA0003922352680000061
引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
热启动Taq酶缓冲液购自生工生物工程(上海)股份公司；
ABI7500购自赛默飞世尔科技公司。
引物设计与合成
设计以下30条引物和探针:
SEQ ID NO.1：5’-AAGCTGAGCACCGCATTAG；
SEQ ID NO.2：5’-TGGTCGCCAGTTTCCATTT；
SEQ ID NO.3：5’-FAM-CATTGATGCTGAGCGGGTGCATG-BHQ1；
SEQ ID NO.4：5’-ATCTGTCTGGAGCGGATTTG；
SEQ ID NO.5：5’-ACGGACATTGATCAACCGATAG；
SEQ ID NO.6：5’-HEX-CAGCAACTTGGCGCTGTTCACAG-BHQ1；
SEQ ID NO.7：5’-CGATGCTCTATGAGTGGCTAAA；
SEQ ID NO.8：5’-CTTGGCAAGTACTGTTCCTGTA；
SEQ ID NO.9：5’-ROX-AAGTGTCGGGCGTGCTTCTTCTC-BHQ2；
SEQ ID NO.10：5’-CGACAGCACAGGAGGAATAG；
SEQ ID NO.11：5’-AGCTTGTACCTTACCGGATTT；
SEQ ID NO.12：5’-FAM-GCTTAATTCTCAATCTATTCCCACGT-BHQ1；
SEQ ID NO.13：5’-ATTGGCCAGCAAATGGAAAC；
SEQ ID NO.14：5’-GGCATGTCGAGATAGGAAGTG；
SEQ ID NO.15：5’-FAM-CCAACGGTTTGGCGATCTGGTTT-BHQ1；
SEQ ID NO.16：5’-TCGCTGGTCAACTCGTAATG；
SEQ ID NO.17：5’-TAACGAACAGTGCGCTAAGG；
SEQ ID NO.18：5’-HEX-ATGAAGCAGCGACGGTTATCGGC-BHQ1；
SEQ ID NO.19：5’-ACGCCGTAAGAGTGCATTAG；
SEQ ID NO.20：5’-AGAGTCACCCTCGACAAGATA；
SEQ ID NO.21：5’-ROX-TGCAGGTTTGCCTGGTAAATTGGC-BHQ2；
SEQ ID NO.22：5’-CTCGATTGGGTGAACGAGAAA；
SEQ ID NO.23：5’-GCTACGCTTGCTGCCTATTA；
SEQ ID NO.24：5’-FAM-TTCACCGAGCAGTTCCAGAAGCC-BHQ1；
SEQ ID NO.25：5’-GGCAATGCAGGAAGAGTTCTA；
SEQ ID NO.26：5’-CATCACCTACCACCGAGATAATG；
SEQ ID NO.27：5’-ROX-AGCGGCTCCAGTAAGCCTTCTTTC-BHQ2；
SEQ ID NO.28:5’-GGAGCTTGGAACAGACTCAC；
SEQ ID NO.29:5’-GGAGAGTAGTCTGAATTGGGTTATG；
SEQ ID NO.30:5’-CY5-ACCTCACCTCAGCCATTGAACTCAC-BHQ2
检测试剂配制：按照表2配制4个试剂：
表2.反应区1检测试剂
Figure BDA0003922352680000071
Figure BDA0003922352680000081
Figure BDA0003922352680000091
4个反应都按照下表配制Taq酶和dNTP的浓度梯度组，每组3个平行测试管。分组见表3。
表3.分组
分组 1 2 3 4 5 6 7 8
热启动Taq酶(U) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 5
dNTP(μM) 100 125 150 175 200 125 250 300
核酸扩增
向反应区1系统反应液中分别加入肺炎克雷伯菌(OXA)临床样本核酸、肺炎克雷伯菌(KPC)临床样本核酸、大肠埃希菌(VIM)临床样本核酸溶液，混合均匀。
向反应区2系统反应液中加入铜绿假单胞菌(IMP)临床样本核酸溶液，混合均匀。
向反应区3系统反应液中分别加入肺炎克雷伯菌(OXA)临床样本核酸、肺炎克雷伯菌(KPC)临床样本核酸、鲍曼不动杆菌(NDM)临床样本核酸溶液，混合均匀。
向反应区4系统反应液中分别加入大肠埃希菌(VIM)临床样本核酸、铜绿假单胞菌(IMP)临床样本核酸溶液，混合均匀。
将蒸馏水作为阴性对照的扩增模板，重复3次测试。
核酸扩增条件：ABI7500扩增程序为：94℃5min；94℃，5s，60℃，30s，40个循环。实验结果见表4-表7。
表4.反应区1结果
Figure BDA0003922352680000092
Figure BDA0003922352680000101
Figure BDA0003922352680000111
表5.反应区2结果
Figure BDA0003922352680000112
表6.反应区3结果
Figure BDA0003922352680000113
Figure BDA0003922352680000121
表7.反应区4结果
Figure BDA0003922352680000131
实验结论
4个检测系统dNTPs的工作浓度范围100μM～300μM，优选的，所述dNTPs的工作浓度为200μM。Taq酶的工作浓度范围1U～5U，优选的，所述Taq的工作浓度为2.5U。
实施例2
CRE-检测管覆盖率测试
材料与方法：
表8.试剂
编号 名称
1 大肠埃希菌(OXA-48)临床样本分离株
2 肺炎克雷伯菌(OXA-48)临床样本分离株
3 肺炎克雷伯菌(KPC-4)临床样本分离株
4 肺炎克雷伯菌(KPC-5)临床样本分离株
5 铜绿假单胞菌(VIM-2)临床样本分离株
6 粘质沙雷菌(VIM-4)临床样本分离株
7 产气克雷伯菌(IPM-2)临床样本分离株
8 铜绿假单胞菌(IMP-10)临床样本分离株
9 鲍曼不动杆菌(NDM-3)临床样本分离株
10 大肠埃希菌(NDM-4)临床样本分离株
11 肺炎克雷伯菌临床样本分离株
12 鲍曼不动杆菌临床样本分离株
13 铜绿假单胞菌临床样本分离株
14 大肠埃希菌临床样本分离株
全自动医用PCR分析系统(杭州优思达生物技术有限公司)。
检测试剂
碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒(磁导式-荧光定量PCR法)(杭州优思达生物技术有限公司)。
检测
每种临床样本进行测试。在全自动医用PCR分析系统上检测。
表9.反应区1与反应区2的实验结果
Figure BDA0003922352680000141
Figure BDA0003922352680000151
表10.反应区3与反应区4的实验结果
Figure BDA0003922352680000152
Figure BDA0003922352680000161
实验结论
本发明中公开的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒(磁导式-荧光定量PCR法)，碳青霉烯耐药基因检测，两例OXA临床样本全检出、两例KPC临床样本全检出、两例VIM临床样本全检出、两例NDM临床样本全检出、四例肺炎克雷伯菌临床样本全检出、三例大肠埃希菌临床样本全检出、三例铜绿假单胞菌临床样本全检出、两例鲍曼不动杆菌临床样本全检出，检出率为100％，覆盖率良好。
实施例3
试剂灵敏度测试，材料与方法：
表11.试剂和仪器
Figure BDA0003922352680000162
全自动医用PCR分析系统(杭州优思达生物技术有限公司)。
检测试剂
碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒(磁导式-荧光定量PCR法)(杭州优思达生物技术有限公司)。
检测
每个样本加入检测管进行测试。在全自动医用PCR分析系统上检测。
表12.实验结果
Figure BDA0003922352680000163
Figure BDA0003922352680000171
实验结论
本发明中公开的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒(磁导式-荧光定量PCR法)，碳青霉烯耐药基因检测，OXA-48(大肠埃希菌)、KPC-2(肺炎克雷伯菌)、VIM-4(铜绿假单胞菌)、NDM-6(大肠埃希菌)的灵敏度都为10CFU/mL；IMP-5(铜绿假单胞菌)的灵敏度都为2CFU/mL；肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的灵敏度都为100CFU/mL。
实施例4
特异性测试
为进一步确定系统的特异性，需要实验验证临床常见菌，具体包括：变形杆菌、爱德华氏菌、枸橼酸杆菌、沙门氏菌、嗜酸乳杆菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、艰难梭菌、双歧杆菌、幽门螺杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乳酸杆菌、甲型肝炎病毒、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、表皮葡萄球菌、百日咳杆菌、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒I型、纳瑟氏菌、人巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌。
材料与方法：
试剂和仪器
全自动医用PCR分析系统(杭州优思达生物技术有限公司)。
检测试剂
碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒(磁导式-荧光定量PCR法)(杭州优思达生物技术有限公司)。
检测
每种临床常见的致病菌重复进行测试。在全自动医用PCR分析系统上检测。
实验结果
30种常见致病菌，检测结果均为阴性。
实验结论
本发明中公开的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒(磁导式-荧光定量PCR法)核酸检测试剂，对与临床常见的30种致病菌菌落没有交叉反应。
实施例4
临床样本测试
材料与方法：
试剂和仪器
全自动医用PCR分析系统(杭州优思达生物技术有限公司)。
检测试剂
碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒(磁导式-荧光定量PCR法)(杭州优思达生物技术有限公司)。
表13.临床样本
Figure BDA0003922352680000191
Figure BDA0003922352680000201
Figure BDA0003922352680000211
实验结果见表14与表15。
50例临床样本检测结果显示，有1例与临床诊断结果不一致，其余都符合。
表14.检测结果
Figure BDA0003922352680000212
Figure BDA0003922352680000221
Figure BDA0003922352680000231
表15.诊断结果
Figure BDA0003922352680000232
全自动医用PCR分析仪准确性，与临床诊断结果一致度为：Kappa值为0.9493；阳性符合率为97.3％，95％CI为85.84％～99.93％；阴性符合率为100％，95％CI为75.29％～100％；总符合率为98.00％，95％CI为89.35％～99.95％。阳性符合率、阴性符合率和总符合率均≥85％。
实验结论
本发明中公开的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒(荧光定量PCR法)，可从临床样本中检测出碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸，具备临床应用的可行性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组，其特征在于，所述的碳青霉烯耐药基因为OXA、KPC、VIM、IMP与NDM，所述的病原体为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌与鲍曼不动杆菌；试剂盒包括用于检测碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸的引物对与探针；
其中，OXA基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
KPC基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
VIM基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
IMP基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
NDM基因的引物对与探针分别如SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；
肺炎克雷伯菌的引物对与探针分别如SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；
大肠埃希菌的引物对与探针分别如SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；
铜绿假单胞菌的引物对与探针分别如SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；
鲍曼不动杆菌的引物对与探针分别如SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示。
2.碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测的引物组与CRE-全自动检测管。
3.根据权利要求2所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述CRE-全自动检测管由上至下依次包括裂解-核酸结合磁珠区，多个磁珠-核酸清洗区与多个核酸洗脱-核酸扩增区。
4.根据权利要求3所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的核酸洗脱-核酸扩增区包括反应区1，反应区2，反应区3以及反应区4，所述反应区1用于检测OXA、KPC与VIM，所述反应区2用于检测IMP，所述反应区3用于检测NDM、肺炎克雷伯菌与鲍曼不动杆菌，所述反应区4用于检测大肠埃希菌与铜绿假单胞菌。
5.根据权利要求4所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括内标，所述内标包括RNase P基因的引物对与探针，RNase P基因的引物对与探针如SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。
6.根据权利要求5所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR buffer，20mmol/L dNTPs，热启动Taq酶与UDG酶。
7.根据权利要求6所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述反应区1的反应体系为OXA的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，KPC的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，VIM的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，PCR buffer的工作浓度为0.5X～2X，20mmol/L dNTPs的工作浓度为100μM～300μM，热启动Taq酶的工作浓度为1U～5U与UDG酶的工作浓度为0.5U～2U；
所述反应区2的反应体系为IMP的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，PCRbuffer的工作浓度为0.5X～2X，20mmol/L dNTPs的工作浓度为100μM～300μM，热启动Taq酶的工作浓度为1U～5U与UDG酶的工作浓度为0.5U-2U；
所述反应区3的反应体系为NDM的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，肺炎克雷伯菌的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，鲍曼不动杆菌的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，PCR buffer的工作浓度为0.5X～2X，20mmol/L dNTPs的工作浓度为100μM～300μM，热启动Taq酶的工作浓度为1U～5U与UDG酶的工作浓度为0.5U～2U；
所述反应区4的反应体系为大肠埃希菌的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，铜绿假单胞菌的引物对与探针的工作浓度均为0.1μM～0.6μM，PCR buffer的工作浓度为0.5X～2X，20mmol/L dNTPs的工作浓度为100μM～300μM，热启动Taq酶的工作浓度为1U～5U与UDG酶的工作浓度为0.5U～2U。
8.碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测方法，其特征在于，采用权利要求2～7任一项所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集待测样本；
2)加入提取液与待测样本，完成DNA提纯；
3)将提纯后的DNA进行PCR扩增，荧光探针与靶标发生特异性结合而产生荧光信号；采集荧光信号，对荧光信号变化分析并得到判定检验结果。
10.根据权利要求9所述的碳青霉烯耐药基因及4种病原体核酸检测方法，其特征在于，步骤3)中，扩增程序为：94℃，5min；94℃，5s，60℃，30s，40个循环。
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