CN101974646A - 尿液样本细菌性病原体检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及临床微生物鉴定领域，提供了一种快速鉴定尿液样本中细菌的试剂盒及方法。该试剂盒包括2条通用引物扩增细菌16S rRNA的V1可变区，1条测序引物测定V1正向区段的序列，亲和素标记的磁珠，测序结果与数据库比对判断种属。应用此试剂盒能一次测序区分尿液样本中的细菌，可用于尿液中细菌性病原体的临床诊断。不仅可以为临床诊疗赢得宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉，操作方便，特异性强的优点。

Description

尿液样本细菌性病原体检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属临床微生物鉴定技术领域，具体涉及尿液样本细菌性病原体检测试剂盒及检测方法。
背景技术
世界范围内尿路感染是最常见的细菌性感染疾病之一，往往导致严重的尿脓毒症甚至病人死亡，尤其是免疫缺陷病人。研究表明，大约50％的妇女一生中至少发生过一次尿路感染。同时，每年大约有10％的儿童发生尿路感染而导致严重的发热性疾病伴随排尿困难及腹痛等症状。
目前，尿液半定量是临床上诊断尿路感染病原菌的标准方法，但是该法存在诸多缺陷。首先，从拿到尿液标本到得到病原菌鉴定结果需要48小时，而在这期间医生往往在没有确定病原菌的情况下采用经验性抗生素治疗，这会导致副作用的产生以及细菌耐药性。其次，尿培养需要经验丰富的专业人员才能进行。
其他一些快速检测尿液样本中病原菌的方法包括尿液镜检、尿素试验以及PCR等。尿液镜检是一种简单、快速的检测尿液病原菌的方法，但其缺陷在于只能检测尿液中有无病原菌而无法鉴定具体病原菌种属，并且其低敏感度也一定程度上限制了在临床上的广泛应用。尿素试验主要用于检测尿液中最为常见的肠杆菌科细菌，对单胞菌属及肠球菌属等不产生尿素的菌群无法检测。PCR结合DNA测序技术已经被证明是检测鉴定细菌及其他微生物的有效手段。以16S rRNA基因为测序片段进行细菌种属鉴定具有诸多优势。16S rRNA以多拷贝的形式存在于所有细菌中，其结构由8个保守区域及9个可变区组成。因此，在16S rRNA保守区设计引物理论上能扩增出绝大多数细菌的DNA片段，然后通过测定扩增产物中的可变区即可区分不同的细菌种属。
Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。该技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于构建标准化操作流程，因此广受研究者青睐，并在很多方面已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药检测。
Monstein等用焦磷酸测序技术检测幽门螺杆菌16S rRNA基因16S rDNA的V1和V3区序列，将胃镜活检标本中得到的23个幽门螺杆菌标本依据其V1区的核苷酸序列差异，鉴定出8种不同的等位基因类型，除11个样本与幽门螺杆菌26 695株序列一致、1个样本与199株的序列一致外，根据V1区的改变表现为有1个或2个核苷酸的突变或单个核苷酸的插入而分为4个等位基因类型。另有2个标本的V3区出现C至T转换，证明此技术可满足对临床病原菌标本的快速鉴定和分型。Unner stad等利用焦磷酸测序技术对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌进行了分型，根据inIB基因第1575位和1578位核苷酸的变化，将血清型1/2a和1/2c分为一组，1/2b和3b分为一组，而血清型4b又可分为2个组。该技术还被应用于百日咳杆菌(Bordetella pert ussis)与副百日咳杆菌(Parapert ussis)等细菌的快速鉴定及分型。Martin等运用此技术对百日咳杆菌毒力相关ptxS1基因进行了分型鉴定，并与定量PCR作了方法学的比较，结果显示两种方法具有很好的一致性，焦磷酸测序技术适合百日咳杆菌的大规模筛选。此外，Alistair等用焦磷酸测序技术检测肠球菌的23s rRNA上的抗利奈唑胺位点，并与PCR-RFLP方法比较，结果显示了100％的一致性。Marjo等用焦磷酸测序技术检测鸟分支杆菌，肺炎链球菌，酿脓链球菌，空肠弯曲杆菌，流感(嗜血)杆菌等多种病原体的23S rRNA基因2058位多态性，以获得病原体的大环内脂抗药性信息。赵锦荣等建立了基于焦磷酸测序技术的高通量检测耐利福平结核分支杆菌的方法，并用传统的测序方法进行验证，结果显示了100％一致性，他们认为这种方法具有自动化程度高和结果准确等特点，相比传统的测序，具有更快速，简便等特点，适用于耐利福平结核分支杆菌的快速高通量的检测。
本试剂盒通过设计软件对常见临床细菌测序引物随后25bp的序列进行了排列组合，产生了多重不同细菌感染的焦磷酸测序虚拟模式数据库，尿液样品经DNA抽提、通用引物扩增，然后用通用引物作为测序引物，测序结果与焦磷酸测序虚拟模式数据库比对判断型别。该方法能一次测序区分常见临床细菌及不同细菌的混合感染，可用于细菌感染的临床诊断及耐药监测。采用的空白对照可以在型别判断中有效扣除可能发生的污染，解决了高的灵敏度必然带来难以控制的污染难题。快速可靠鉴定尿液中细菌种属的重要意义在于：①合理应用抗生素，避免无效用药；②改善预后；③减缓获得耐药；④减少医疗费用。不合适抗生素应用常常导致治疗失败，而使住院期延长，并发症，耐药以及检验费用增加等后果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种尿液样本细菌性病原体检测试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种尿液样本细菌性病原体检测试剂盒，它包括：
(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；
(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(3)亲和素标记的磁珠；
其中，SEQ IDNO：1在其5’端标记生物素；
在一次检测中共同使用。
上述细菌快速鉴定的试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：50mg/mL Chelex 100缓冲液，20mg/mL蛋白酶K；
(2)反应液：PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO：1～2，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μLTaq DNA聚合酶；
其中，PCR Buffer具体为：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.6mg/mL BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9Tricine。
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween-20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁。
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP(dNTP即dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)。
一种尿液样本细菌快速鉴定的试剂盒，它包括上述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：
(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对；
(4)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(5)亲和素标记的磁珠；
其中，SEQ ID NO：3在其5’端标记生物素；
在一次检测中共同使用。
上述细菌快速鉴定的试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：50mg/mL Chelex 100缓冲液，20mg/mL蛋白酶K；
(2)反应液：PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO：3～4，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μL TaqDNA聚合酶；
其中，PCR Buffer具体为：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.6mg/mL BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9Tricine。
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween-20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁。
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP(dNTP即dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)。
本发明所述的细菌为狭义的细菌，包括：假单胞菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、不动杆菌属。
上述尿液样本细菌快速鉴定试剂盒的检测方法包括如下步骤：
(1)提取细菌DNA；
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16S rRNA的V1可变区的PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果与数据库比对判断细菌种属。
步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ ID NO：20.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃3min；28个循环(94℃25s，42℃30s，72℃20s)；72℃3min。或者将SEQ ID NO：3替换上述SEQ ID NO：1，同时将SEQ IDNO：4替换上述SEQ ID NO：2，其它PCR扩增体系和条件相同。
有益效果：本发明的试剂盒利用焦磷酸测序技术测定的V1正向区段的序列和数据库比对判断细菌种属。应用此试剂盒能一次测序鉴定尿液样本细菌种属。可用于尿液标本中细菌性病原体的临床诊断。不仅可为临床诊疗赢得宝贵的抢救时间，而且具有成本低廉，操作方便，特异性强的优点。本发明方法可以使尿液样本细菌种属鉴定时间大大缩短，从传统所需的24～48小时缩短为5小时，成本为传统鉴定法的三分之一，另外，通过序列比对鉴定细菌是菌种鉴定的终极方法，特别是对一些难鉴定菌，序列比对鉴定更具优势。
附图说明
图1为1例病人尿液标本致病菌检测结果图，测序结果为GTAACAGGAAGAAGCTTGCT TC，与数据库比对判定为大肠埃希菌。
图2为1例病人尿液标本致病菌检测结果图，测序结果为GAATCCAGGAGCAAGCTCCC TTCATCCG，与数据库比对判定为铜绿假单胞菌。
图3为1例病人尿液标本致病菌检测结果图，测序结果为AACGTCAGAGGAGCAAGCTC CTCG，与数据库比对判定为表皮葡萄球菌。
图4为1例病人尿液标本致病菌检测结果图，测序结果为CGTCACCCGAGAGCAAGCTC TC，与数据库比对判定为肺炎克雷伯菌。
图5为1例病人尿液标本致病菌检测结果图，测序结果为CGTCAGCAAGAAAGCAAGCT TTC，与数据库比对判定为奇异变形杆菌。
图6为1例病人尿液标本致病菌检测结果图，测序结果为CCCGTCCCATTTTTCCCCCGGATGGGAAGGACGAACGAACGTCCCGGTTCGG，与数据库比对判定为屎肠球菌和嗜麦芽窄食单胞菌混合感染。
图7为1例病人尿液标本致病菌检测结果图，测序结果为CCTCTTTTCCGGTGGAGCAA GCTCCGGTGG，与数据库比对判定为屎肠球菌。
图8为1例病人尿液标本致病菌检测结果图，测序结果为CCTCTTTCCAATTGAGTGCAAGC，与数据库比对判定为粪肠球菌。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：试剂盒的制备方法。
(1)DNA提取试剂：
(1a)50mg/mL Chelex 100缓冲液：含0.3mg/mL SDS(购于杭州荧光泰生物技术有限公司)，1％(v/v)Tween-20(购于美国Sigma公司)，1％(v/v)NP-40(购于美国Sigma公司)
(1b)20mg/mL蛋白酶K(购于Amresco)。
(2)反应液：
PCRBuffer：0.1％(v/v)NP-40(购于美国Sigma公司)，0.02％(v/v)明胶(购于美国Sigma公司)，0.06％(w/v)g/mL BSA(购于美国Sigma公司)，0.1％(v/v)Tween-20(购于美国Sigma公司)，0.06M pH8.9Tricine(购于德国Merck公司)，
通用引物SEQ ID NO：1～2或SEQ ID NO：3～4，由上海英俊生物科技有限公司合成。
MgCl2：购于美国Sigma公司，
0.2mM dNTPs：购于上海鼎国生物技术有限公司，
2U/μLTaq DNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
(3)单链纯化试剂：
75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司，
0.2M NaOH：购于上海试四赫维化工有限公司，
10mM Tris-Acetate(pH 7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司。
结合缓冲液：由10mM Tris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司)，2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mM EDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司)组成，
退火缓冲液：由20mM Tris-Acetate(pH 7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成。
亲和素标记的磁珠(购于GE healthcare Bioscience AB)。
(4)测序试剂：
DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于QIAGEN公司，
底物APS和荧光素：购于QIAGEN公司，
四种dNTP(dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)：购于QIAGEN公司。
实施例2：检测方法。
仪器：Bio-Rad S1000PCR仪，Beckman Microfuge 22R台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGEN PyroMark Q96ID测序仪。
(1)提取细菌DNA，具体包括如下步骤：
(1a)吸取1ml混匀的尿液至1.5ml eppendorf管中，14000rpm离心5min；去上清
(1b)在(1a)所获得的沉淀中加入5％(w/v，g/mL)Chelex 100缓冲液200μL和蛋白酶K 2μL(20mg/mL，)，56℃孵育60min，煮沸15min。
(1c)14000rpm离心5分钟，取上清3μl作为PCR反应模板。
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16S rRNA的V1可变区的PCR扩增；
其中，所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ IDNO：2O.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃3min；28个循环(94℃25s，42℃30s，72℃20s)；72℃3min；或者将SEQ ID NO：3替换上述SEQ ID NO：1，同时将SEQ ID NO：4替换上述SEQ ID NO：2，其它PCR扩增体系和条件相同。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：
●在使用前，保证所有溶液都达到室温；
●在PSQ 96板中加入45μl annealing buffer，然后每孔加入SEQ ID NO：2测序引物(10uM)0.5uL；
●使用Vertex混匀Sepharose beads，将需要使用的sepharoe beads总量(每样本3μL)转移到一个Eppendorf管中，在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μL的体积，将混合物混匀；
●将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中，每样本50μL，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合；
●在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；
●打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒，然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads，将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads；
●使用高纯水清洗vacuum prep tool。
将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果与焦磷酸测序细菌种属虚拟模式数据库(http://gene.dagene.net/；http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&BLAST_PROGRAMS＝megaBlast&PAGE_TYPE＝BlastSearch&SHOW_DEFAULTS＝on&LINK_LOC＝blasthome)比对判断细菌种属。
将本发明方法用于8例临床尿液标本的鉴定，测序图如图1-8所示。本发明方法鉴定结果与经微生物培养、致病菌分纯后用法国生物梅里埃的微生物鉴定系统做比对，结果一致。

Claims (7)

1.一种尿液样本细菌性病原体检测试剂盒，其特征在于它包括：
(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；
(2)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(3)亲和素标记的磁珠；
其中，SEQ ID NO：1在其5’端标记生物素；
在一次检测中共同使用。
2.根据权利要求1所述的尿液样本细菌性病原体检测试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：50mg/mL Chelex 100缓冲液，20mg/mL蛋白酶K；
(2)反应液：PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO：1～2，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μLTaq DNA聚合酶；
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。
3.一种尿液样本细菌性病原体检测试剂盒，其特征在于它包括：
(1)扩增细菌16S rRNA的V1可变区的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对；
(4)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(5)亲和素标记的磁珠；
其中，SEQ IDNO：3在其5’端标记生物素；
在一次检测中共同使用。
4.根据权利要求3所述的尿液样本细菌性病原体检测试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：50mg/mL Chelex 100缓冲液，20mg/mL蛋白酶K；
(2)反应液：PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO：3～4，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μL Taq DNA聚合酶；
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。
5.一种尿液样本细菌性病原体检测试剂盒的检测方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)提取尿液中细菌DNA；
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用通用引物进行细菌16S rRNA的V1可变区的PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果与数据库比对判断细菌种属。
6.根据权利要求5所述的尿液样本细菌性病原体检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：10.3μL，SEQ ID NO：20.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2。Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃3min；28个循环，94℃25s，42℃30s，72℃20s；72℃3min。
7.根据权利要求5所述的尿液样本细菌性病原体检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：30.3μL，SEQ ID NO：40.3μL，Template DNA 3μl，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；PCR扩增条件为：94℃3min；28个循环，94℃25s，42℃30s，72℃20s；72℃3min。
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