CN111593131A - 一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统及试剂盒。首先，本发明公开了一种可同时检测多种耐药基因的引物系统，包括核苷酸序列如SEQ ID N0：1‑24所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物系统的试剂盒，以及使用该引物系统或试剂盒进行耐药基因检测的方法。本发明公开的试剂盒支持高通量检测，可快速、准确及超高灵敏度地检测5种细菌耐药基因，根据目标耐药基因的定量/半定量检测结果，可实时、快速监测血流感染患者体内的特定耐药基因的变化，及时评估患者状况，为临床医生提供辅助治疗建议。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统及试剂盒。
背景技术
抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物，但近年感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国家之一，然而随着抗生素使用量的增加，细菌耐药情况也越发严重。当前，细菌耐药性的监测/检测重点包括：1、耐甲氧西林的葡萄球菌(MRS)；2、耐万古霉素的多重耐药的肠球菌(VRE)；3、耐β-内酰胺类和大环内酯类的多重耐药肺炎链球菌(PRSP)；4、产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶的革兰氏阴性杆菌；5、非发酵糖菌群的多重耐药问题等；6、耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌(CRE)。
超广谱β-内酰胺酶是β-内酰胺酶的一种，能水解包括碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素，而且绝大多数对β-内酰胺酶抑制剂具有抗性。根据编码ESBLs基因同源性，可将其分为+-TEM型、SHV型、CTX-M型、 OXA型等多个类别，每个类别含有多种亚型，且每种类别及其亚型水解药物的特性会有所差别。能产生ESBL的细菌即为ESBL(+)菌，主要由大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌组成，这类细菌在持续的各种β-内酰胺类抗菌药物的选择压力下，被诱导产生且能够不断变异的β-内酰胺酶，该β-内酰胺酶扩展了其耐受头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等第3代头孢菌素、第4代头孢菌素和氨曲南等单环β-内酰胺类抗菌药物的能力。
碳青霉烯类抗生素对大多数革兰氏阳性及革兰氏阴性病菌感染均有强大的抗菌效果，是临床上抵御严重细菌感染的重要屏障。然而随着临床的广泛应用，特别是滥用，产碳青霉烯类酶(KPC)的肺炎克雷伯菌已经陆续出现，现已有十多种KPC耐药基因，包括blaKPC-1到blaKPC-19，含有这些耐药基因的微生物将对KPC类抗生素失去敏感性。但是随着碳青霉烯类抗菌药物的大量使用，国内外开始报道对碳青霉烯类抗菌药物不敏感甚至耐药的肠杆菌科细菌，这极大地限制了碳青霉烯类抗菌药物的使用，产生这一现象的重要原因是菌株获得了碳青霉烯酶基因。其中由质粒携带的碳青霉烯酶基因由于其耐药基因环境存在介导转移的基因元件，使得其易于在不同细菌间转移，造成了碳青霉烯酶耐药性的广泛传播，如KPC、IMP、VIM、OXA等碳青霉烯酶在肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌及弗劳地枸橼酸杆菌等已有流行趋势，另有研究报道携带NDM-1型酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌表现出了超强的耐药性。这些耐药酶基因可以通过质粒、整合子等方式，在不同的菌株之间传播，导致细菌耐药率迅速增加，耐药性也迅速增强，给医院和社区感染性疾病的预防和控制带来很大困扰，对公众健康也造成日益严重的威胁。
CHINET数据显示，近年来大肠杆菌与肺炎克雷伯菌的ESBL耐药率达到 50％上下，碳青霉烯类抗生素耐药也在持续攀升。到目前为止，临床耐药菌的检测仍然主要是通过对标本进行选择性培养计数菌落数后，再通过传统药敏试验检验，传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用，因而研发一种简便、快速的多种耐药基因联合检测方法具有极大的应用前景。
随着分子生物学的发展，分子生物学技术在微生物领域的应用，特别是荧光定量PCR和数字PCR检测技术平台的出现后，越来越广泛。数字PCR技术是在qPCR技术上发展起来的第三代PCR技术，理论上可以实现对单个拷贝的目标核酸片段进行扩增检测，是当前灵敏度最高的核酸检测技术。利用多色荧光数字PCR平台，结合不同荧光标记水解探针的应用，可以同时对多个目标片段进行检测。
然而如何将数字PCR技术有效的应用于多种耐药基因的检测仍是本领域技术人员亟需克服的难题。
发明内容
本发明针对耐甲氧西林的葡萄球菌mecA基因、超广谱β-内酰胺酶比较常见和重要的CTX-M-14、CTX-M-15、和碳青霉烯酶基因blaKPC、NDM进行联合检测，对中国人群进行筛查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而减少抗生素使用量，降低耐药产生，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。
具体的，本发明的技术方案如下：
一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统，包括：
用于检测CTX-M-14基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、 SEQID N0：2和SEQ ID N0：3所示；
用于检测CTX-M-15基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、 SEQID N0：5和SEQ ID N0：6所示；
用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7-10和 SEQID N0：11-12所示；
用于检测NDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：13-16 和SEQID N0：17-18所示；
用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0： 19-22和SEQ ID N0：23-24所示。
应当理解，与上述核苷酸序列具有90％以上(例如92％、94％、96％或98％等)同源性且功能相同的核苷酸序列变体，均在本发明的保护范围之内。
CTX-M-14基因为超广谱β内酰胺酶CTX-M-14型基因；CTX-M-15基因为超广谱β内酰胺酶CTX-M-15型基因。mecA基因为甲氧西林耐药基因(青霉素结合蛋白PBP2a的结构基因)。blaKPC基因为碳青霉烯酶基因。NDM基因编码新德里金属β-内酰胺酶。
本发明第二个方面公开了上述的引物探针系统制备的可同时检测多种耐药基因的产品。
进一步的，所述产品为试剂盒。
更进一步的，所述试剂盒包括检测试剂。
本发明还公开了一种同时检测多种耐药基因的方法，所述方法使用上述的引物系统或上述的产品进行检测。
进一步的，基于多重数字PCR平台进行检测。
术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达 20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上的数字PCR反应。
进一步的，上述方法包括以下步骤：
(1)提取样本核酸；
(2)配置数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。
需要强调的是，根据本发明的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不限于如上描述的方案。
进一步的，检测样品为感染患者血浆样品。通过常规试剂盒提取临床样品血浆中的游离核酸，并用液滴数字PCR系统进行检测。
进一步的，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火 30秒，循环40次。
本发明还公开了上述的引物探针系统、上述的产品或上述的方法在临床领域中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
1.本发明采用多色多重的检测方案，将多种目标基因联合检测，单位时间和反应孔内同时获得多个耐药基因的检测结果。
2.本发明的检测方法和检测试剂盒，可快速、准确及超高灵敏度地检测5种细菌耐药基因，根据目标耐药基因的定量/半定量检测结果，可实时、快速监测血流感染患者体内的特定耐药基因的变化，及时评估患者状况，为临床医生提供辅助治疗建议。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种同时检测多种耐药基因的方法。实验流程如下：
医院取样及保存→血浆分离→血浆游离核酸提取→配置数字PCR反应液→液滴芯片生成→扩增→阅读→结果分析与报告输出。
涉及到的仪器与设备表如表1所示，涉及到的试剂名称及存储条件如表2所示。
表1仪器与设备表
表2试剂名称及存储条件
| 试剂名称 | 存储条件 |
| 裂解液A | 2-8℃保存 |
| Proteinase K | 2-8℃保存 |
| 磁珠悬液 | 2-8℃保存 |
| 洗涤液A | 2-8℃保存 |
| 异丙醇 | 常温保存 |
| 75％乙醇 | 常温保存 |
| 洗脱液 | 2-8℃保存 |
一、核酸提取实验步骤如下：
1.1血浆游离核酸提取步骤
1.1.1将临床全血样本(约10mL)1600g离心15min，取上层血浆于新的15/50mL离心管中，注意不要吸到下层的血液。分离血浆样本，每份2mL血浆(以下试剂加入量按2ml体积计算，血浆体积不足2mL时，加入DDW或经过滤的生理盐水补齐2mL)。
1.2自动化提取的不同孔槽中，加入不同的试剂或混合液，如下：
孔槽1：
1.加入3ml裂解液GHH；
2.加入200ul Proteinase K；
3.加入1ul Carrier RNA；
4.加入30ul磁珠；
5.加入2ml检测样品；
孔槽2：加入1ml 缓冲液GDF；
孔槽3：加入1ml 漂洗液PWG；
孔槽4：加入1ml 漂洗液PWG；
孔槽7：加入50ul洗脱缓冲液TBC；
其中，孔槽5和6中未加入溶液，孔槽5和6为提取程序中为了优化步骤预留出的孔槽，可选择使用也可不用。
1.3孔槽1中，加入2mL临床样本后再加混匀的30ul磁珠，启动自动化提取程序。
1.4产物24h内进行下游实验，可2-8℃保存，长时间请-25℃～-15℃保存。
二、靶基因检测方案
数字PCR检测流程(配置数字PCR反应液、液滴芯片生成及扩增过程)
一、配制20μl的液滴PCR检测体系，具体体系配方分别见表3；
表3
| 组分 | 体积(μl) |
| 2x Taq Mix | 7.5 |
| Forward Primer(10μM) | 0.6 |
| Reverse Primer(10μM) | 0.6 |
| Probe(10μM) | 0.4 |
| 模板 | 1 |
| 总体积 | 15 |
备注：表1中反应体系为单引物探针对反应体系，同样适用于多重检测体系。
2、将血浆提取的游离核酸模加入到不同体系中并混匀，模板加入量为5μl，同时配制实验的阳性对照和阴性对照；
3、按照SOP流程将配制好的反应体系加入到液滴芯片加样孔中；将芯片放入样本制备仪，启动仪器生成液滴。
将芯片放入芯片扩增仪中；设置液滴芯片扩增程序，并运行；反应程序如下： 95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火30秒，循环40次。
三、液滴芯片阅读、结果分析及报告流程
1、扩增结束后，将芯片架拿出放至数字PCR阅读仪的芯片放置台上，打开 GenePMS软件，将芯片放置台的温度调至50℃，并设置软件相应参数；
2、芯片放置5分钟后，选择相应的荧光检测通道，开始芯片扫描并分析结果；
3、数据分析与报告输出。
其中本实施例涉及到的引物组合序列如表4所示。
表4引物探针组合序列
本实施例公开的检测可以高通量、快速、准确及超高灵敏度地检测5个细菌耐药基因，可根据耐药基因的拷贝数检测结果实时评估临床治疗效果。具体的，通过目标耐药基因的定量/半定量检测结果，可实时、快速监测血流感染患者体内的特定耐药基因的变化，及时评估并为临床医生提供辅助治疗建议。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统及试剂盒
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 1
ccgctggttc tggtgaccta 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 2
tctcgccgct gaagcca 17
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 3
ccagccgcaa caga 14
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 4
gatggcgacg gcaaccg 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 5
gtacgtccgc cgtttgcg 18
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 6
cagcggcaca cttc 14
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 7
aactacggta acattgatcg caac 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 8
gattatggct caggtactgc tatcc 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 9
gcattcctgg aataatgacg cta 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 10
atgaaggtgt gcttacaagt gctaa 25
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 11
cttccacata ccatcttc 18
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 12
ccctcaaaca ggtgaat 17
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 13
cccaatatta tgcacccggt c 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 14
ctggatcaag caggagatca ac 22
<210> 15
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<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 15
cacccgctca gcatcaatg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 16
cgcccatctt gtcctgatg 19
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 17
ctgagcaccg catta 15
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 18
tgagtcacca ccgcca 16
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 19
gccttcatgc gctctatcg 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 20
agttcagctc cagctcccag 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 21
ggcgcctaac aaggatgaca 20
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 22
gacgcccaat ccctcgag 18
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 23
ccacgttccg tctgga 16
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 24
acagcgaggc cgtca 15
Claims (10)
1.一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统，其特征在于，包括：
用于检测CTX-M-14基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、SEQ IDN0：2和SEQ ID N0：3所示；
用于检测CTX-M-15基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、SEQ IDN0：5和SEQ ID N0：6所示；
用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7-10和SEQ IDN0：11-12所示；
用于检测NDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：13-16和SEQ IDN0：17-18所示；
用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：19-22和SEQ IDN0：23-24所示。
2.由权利要求1所述的引物探针系统制备的可同时检测多种耐药基因的产品。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括检测试剂。
5.一种可同时检测多种耐药基因的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1所述的引物探针系统或权利要求2-4所述的产品进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，基于多重荧光PCR或多重数字PCR平台进行检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，多重数字PCR平台检测包括以下步骤：
(1)提取样本核酸；
(2)配置数字PCR反应液；
(3)制备液滴芯片；
(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，检测样品为感染患者血浆样品。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火30秒，循环40次。
10.根据权利要求1所述的引物探针系统、权利要求2-4所述的产品或权利要求5-9所述的方法在临床领域中的应用。
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