CN107130016A

CN107130016A - Vre/mrsa/kpc/ndm‑1检测基因芯片的制备和用途

Info

Publication number: CN107130016A
Application number: CN201611230917.6A
Authority: CN
Inventors: 王升启; 吴冰; 刘琪琦; 陈苏红; 宋燚
Original assignee: Tianjin Wego Molecule Diagnosis Technology Co ltd; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Tianjin Wego Molecule Diagnosis Technology Co ltd; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2017-09-05

Abstract

本发明涉及一种VRE/MRSA/KPC/NDM‑1检测基因芯片的制备和用途，其制备方法包括制备特异性引物，制备特异性探针，制备寡核苷酸芯片，建立多重PCR体系和杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时检测5种耐药基因和3种相关的病原菌，包括抗万古霉素肠球菌VRE耐药基因VanA,VanB；编码新德里金属‑β‑内酰胺酶NDM‑1耐药基因；抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的耐药基因mecA；编码碳青霉烯酶KPC基因；以及粪肠球菌特异基因Fddl、屎肠球菌特异基因Sddl、金黄色葡萄球菌特异基因nuc。该芯片具有快速准确、高通量等优势，为常见抗生素耐药表型的耐药基因确认提供一种新的检测手段。

Description

VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的制备和用途

技术领域

本发明涉及VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域。

背景技术

感染性疾病一直以来都对人类健康和生命构成很大威胁，20世纪40年代抗生素的发现使得一些感染性疾病在治疗上取得了重大进展，但随着抗生素的不合理使用和滥用，使得细菌耐药率不断上升。细菌耐药性已发展成为全球主要的公共健康威胁，由耐药菌引起的感染使治疗无效，增加患者的痛苦、丧失劳动力甚至是死亡。在抗生素选择压力下一些致病菌对抗菌药物出现耐药性，从而使抗菌药物疗效降低甚至失效。耐药趋势也由单一耐药发展为多重耐药（multiple resistance, MDR），尤其是近些年来被媒体称为的“超级细菌”的出现，如抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA），耐万古霉素肠球菌（vancomycin-resistant enterococci,VRE），“新德里”金属-β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase,NDM-1）等，几乎对抗生素产生了泛性耐药，对临床治疗产生极大的影响，危害人类健康，克服抗药性极其紧迫。面对如此严重的细菌耐药形势，加强细菌耐药监测变得十分重要。如果在用药前可以检测出某种耐药基因，将大大有利于指导临床用药，延缓耐药的发展，因此快速、准确的早期诊断是预防及控制耐药株暴发流行、延缓耐药性发展的关键。

耐药基因的检测方法主要包括表型检测和基因型检测两大类，其中传统的表型检测以药敏检测方法为主，主要包括纸片扩散法、稀释法、Etest（表型确认）、改良Hodge实验、自动化药敏检测（VITEK 2系统、BD Phoenix、ATB系统）等。但传统的表型检测方法实验周期长，操作繁琐，且经验依赖性较强，不能满足临床治疗的需要。而基因芯片恰好具有高通量，高灵敏度，操作简单，成本低，实验周期短等优点，适用于耐药基因的高通量检测和临床治疗研究。

发明内容

本发明的目的在于针对耐药基因检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的耐药基因检测DNA芯片，能同时检测5种常见的耐药基因和3种相关的病原菌，包括抗万古霉素肠球菌（VRE）的耐药基因VanA、VanB；可编码新德里金属-β-内酰胺酶NDM-1耐药基因；抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的耐药基因mecA；编码碳青霉烯酶KPC基因；以及粪肠球菌特异基因Fddl、屎肠球菌特异基因Sddl、金黄色葡萄球菌特异基因nuc。为抗生素耐药菌的临床诊断、表型确证及分子流行病学调查提供一种新的检测手段。

为了达到上述目的，本发明VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片，其制备方法如下。

步骤一：制备耐药基因特异性引物。

选择耐药基因VanA、VanB、NDM-1、mecA、KPC；特异基因Fddl、Sddl和nuc作为检测靶基因，优选八对引物序列及其对应的扩增靶标，如表1所示。

表1 引物序列及对应的扩增靶标。

。

步骤二：制备特异性寡核苷酸探针。

根据每种耐药基因的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行探针的设计。筛选出耐药基因各特异性探针序列及其对应的扩增靶标，如表2所示。

表2 寡核苷酸探针序列及对应的靶标。

。

步骤三：制备寡核苷酸芯片。

一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液（6×SSC，0.1%SDS）稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3nL。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥48小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括5种超级耐药基因和3种病原菌特异基因，共8条特异性探针，其探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端bio标记、3’端NH2修饰，用来监测醛基片片基质量；A管内标探针为细菌16s1基因，B管内标探针细菌16s2 基因，用来监测A、B管多重体系质量；阴性探针用来检测有无污染；所有探针的点样量均为3nL，使用前至少在室温放置干燥48小时。

表3 寡核苷酸探针阵列。

。

步骤四：建立多重不对称PCR体系。

本发明基因芯片中PCR体系的特征为两管五重不对称PCR反应体系。合适的多重不对称PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化，优选的多重PCR体系，如表4所示。

表4 多重不对称PCR体系配方。

。

优选的PCR扩增条件为：95℃预变性15min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，共40个循环； 72℃延伸5 min。

步骤五：建立杂交体系。

合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物（A管和B管各2.5µL）与杂交液（5µL）等体积混合，优选的杂交液各成分终浓度为8×SSC，0.6%SDS，10%甲酰胺，10×Denhardt。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A（1×SSC，0.2%SDS），洗液B（0.2×SSC）和洗液C（0.1×SSC）中各洗涤20s。

步骤六：化学发光显色。

①在芯片反应区加入10µL标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素（streptavidin-HRP），37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液（1×PBS+0.05%Tween20）清洗20s，重复3次，置室温晾干。②将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20µL的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。

以上制备的VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片，包括寡核苷酸芯片、PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、标记液、显色液A、显色液B、阳性质控品、阴性质控品。

一个优选的实施方案使用市售的基因组DNA提取试剂盒（磁珠法）提取核酸，提取参照相应的试剂盒说明书进行。提取的DNA使用多重PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行扩增。PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五和步骤六的条件进行杂交和显色。

洗涤后的芯片使用便携式化学发光生物芯片成像仪进行扫描，并运用分析软件判读结果。选择大肠杆菌、沙门菌、幽门螺旋杆菌、副溶血性弧菌、化脓球菌、流感嗜血杆菌等细菌作为样本，利用上述制备的基因芯片进行检测，考察芯片的特异性。制备质粒菌灵敏度参考品，考察芯片的最低检测限。结果：5种耐药基因及3种病原菌的检测限均能达到3×10³copies/反应。

使用本发明制备的基因芯片检测耐药基因临床样本。结果显示，基因芯片检测符合率达到100%。表明本实验所建立的基因芯片方法可以对细菌中的常见的耐药基因进行准确检测。

本发明建立了一种基于化学发光成像法的基因芯片，可同时甄别5种常见的超级耐药基因及相关的3种病原菌特异基因，包括抗万古霉素肠球菌（VRE）的耐药基因VanA、 VanB；可编码新德里金属-β-内酰胺酶NDM-1耐药基因；抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的耐药基因mecA；编码碳青霉烯酶KPC基因；以及粪肠球菌特异基因Fddl、屎肠球菌特异基因Sddl、金黄色葡萄球菌特异基因nuc。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为抗生素耐药的临床诊断及分子流行病学调查提供一种新的检测手段。性能考察表明，本发明的基因芯片以对5种不同种的超级耐药基因及相关的3种病原菌进行准确甄别，特异性良好。本发明芯片的检测灵敏度为3×10³copies/反应。

附图说明

图1：为本发明VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的阵列示意图，每张芯片上分布有10个相同阵列。

图2：VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片上每个阵列上具体排列布局。图中一个原点代表探针的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。①对应片基质控探针；②对应的是VanA特异性探针；③对应的是VanB特异性探针；④对应的是Fddl特异性探针；⑤对应的是Sddl特异性探针；⑥对应的是内标16s探针1；⑦对应的是阴性对照；⑧对应的是KPC特异性探针；⑨对应的是NDM-1特异性探针；⑩对应的是mecA特异性探针；⑪对应的是nuc特异性探针；⑫对应的是内标16s探针2；⑬对应的是空白对照；⑭对应的是阳性对照。

图3：基因芯片特异性检测结果图。其中1-6依次为大肠杆菌、沙门菌、幽门螺旋杆菌、副溶血性弧菌、化脓球菌、流感嗜血杆菌的检测结果图。

图4：5种不同种的超级耐药基因及相关的3种病原菌特异基因的芯片检测图。其中1-8依次为VanA、VanB、Fddl、Sddl、KPC、NDM-1、mecA、nuc基因芯片检测结果。图5：5种不同种的超级耐药基因及相关的3种病原菌特异基因质粒菌参考品的灵敏度检测结果图。其中1-6依次为VanA3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒菌参考品和阴性对照检测结果；7-12依次为VanB 3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒菌参考品和阴性对照检测结果；13-18依次为Fddl 3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒菌参考品和阴性对照检测结果；19-24依次为Sddl 3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒菌参考品和阴性对照检测结果；25-30依次为KPC 3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒菌参考品和阴性对照检测结果；31-36 依次为NDM-1 3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒菌参考品和阴性对照检测结果；37-42依次为mecA 3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒菌参考品和阴性对照检测结果；43-48依次为nuc 3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒菌参考品和阴性对照检测结果。

图6：VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片临床样本检测结果图。1为耐万古霉素A粪肠球菌Fddl/VanA基因；2为耐万古霉素A屎肠球菌Sddl/VanA基因；3为耐万古霉素B粪肠球菌Fddl/VanB基因；4为耐万古霉素B屎肠球菌Sddl/VanB基因；5为碳青霉烯酶肺炎克雷伯杆菌KPC；6为新德里金属-β-内酰胺酶NDM-1耐药基因；7为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nuc/ mecA基因。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的研制。

一、引物探针设计和筛选。

首先从NCBI基因数据库中下载常见的超级耐药基因序列，序列下载完成后，使用Vector NTI Advance 10 (invitrogen) 软件包中的ALignX程序按照默认的参数设置对各耐药基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、通用及特异性引物。经过筛选最终确定共8对引物，将反向引物进行5’端bio标记，作为芯片使用的引物；确定8条特异性检测探针，3’端NH₂修饰。

二、寡核苷酸芯片制备及探针阵列。

完成探针筛选后，确定了最终的探针阵列，见附图1和附图2。①对应片基质控探针；②对应的是VanA特异性探针；③对应的是VanB特异性探针；④对应的是Fddl特异性探针；⑤对应的是Sddl特异性探针；⑥对应的是内标16s探针1；⑦对应的是阴性对照；⑧对应的是KPC特异性探针；⑨对应的是NDM-1特异性探针；⑩对应的是mecA特异性探针；⑪对应的是nuc特异性探针；⑫对应的是内标16s探针2；⑬对应的是空白对照；⑭对应的是阳性对照。

三、多重不对称PCR体系。

本发明中PCR体系的特征为两管五重不对称PCR反应体系。合适的PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化。当上下游引物终浓度为（0.04-0.48μM）：（0.2-2.4μM），Taq酶用量为2.5U/体系时，参考品的探针信号值较强，且低拷贝模板10³copie/μL仍然可以检出。优选的PCR扩增条件为：95℃预变性15min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃，30 s，共40个循环； 72℃延伸5 min。

四、建立并优化杂交体系。

通过优化得到同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物与杂交液等体积混合，杂交液各成分终浓度为8×SSC，0.6%SDS，10%甲酰胺，10×Denhardt。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A（1×SSC，0.2%SDS），洗液B（0.2×SSC）和洗液C（0.1×SSC）中各洗涤20s。

五、化学发光显色。

1）在芯片反应区加入10µL标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素（streptavidin-HRP），37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液（1×PBS+0.05%Tween20）清洗20s，重复3次，置室温晾干。

2）将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20µL的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。

实施例2：VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的特异性评价。

特异性是诊断方法最重要的考核指标，本发明的基因芯片使用优化好的体系和条件，检测了大肠杆菌、沙门菌、幽门螺旋杆菌、副溶血性弧菌、化脓球菌、流感嗜血杆菌，由附图4可以看出，上述细菌检测结果都呈阴性，特异性良好。本发明检测5种不同种的超级耐药基因及相关的3种病原菌特异基因，由附图3可以看出，各基因可以明显区分，说明本发明特异性良好。

实施例4：VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片灵敏度评价。

5种不同种的超级耐药基因及相关的3种病原菌特异基因质粒菌作为检测参考品，从10⁵copies/μL梯度稀释至10¹ copies/μL，进行芯片检测，结果见附图5。由附图5可以看出，本发明芯片的检测灵敏度为3×10³copies/反应。

实施例5：VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片临床样本检测。

使用本发明制备的基因芯片检测耐药基因临床样本。样本中细菌DNA的提取使用市售的基因组DNA提取试剂盒（磁珠法）提取核酸。样本核酸检测按照说明书中的操作方法进行，结果显示，与测序结果一致，基因芯片检测符合率达到100%。表明本实验所建立的基因芯片方法可以对细菌中的常见的耐药基因进行准确检测。部分检测结果见附图6。

除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120> 超级耐药基因检测DNA芯片的制备和用途

<130> 1

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>

根据耐万古霉素基因设计，用作耐万古霉素基因VanA上游引物，命名为Van

A-F

<400> 1

tactctgccc ggtttcac 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据耐万古霉素基因设计，用作耐万古霉素基因VanA下游引物，命名为Van

A-R

<400> 2

gaacaccgtg tactatttca tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>

根据耐万古霉素基因设计，用作耐万古霉素基因VanB上游引物，命名为Van

B-F

<400> 3

caagaagcca tgtacggaat gg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据耐万古霉素基因设计，用作耐万古霉素基因VanB下游引物，命名为Van

B-R

<400> 4

tatcgcacca tcctccccgc at 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>

根据新德里金属-β-内酰胺酶NDM-1耐药基因设计，用作NDM-1基因上游引物

，命名为NDM-F

<400> 5

gaatgtctgg cagcacact 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据新德里金属-β-内酰胺酶NDM-1耐药基因设计，用作NDM-1基因下游引物

，命名为NDM-R

<400> 6

tggcataagt cgcaatcc 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据耐甲氧西林基因设计，用作耐甲氧西林mecA基因上游引物，命名为mec

A-F

<400> 7

gtgaagatat accaagtgat t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据耐甲氧西林基因设计，用作耐甲氧西林mecA基因下游引物，命名为mec

A-R

<400> 8

atgcgctata gattgaaagg at 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据编码碳青霉烯酶KPC基因设计，用作KPC基因上游引物，命名为KPC-F

<400> 9

ctgggcagtc ggagacaaaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据编码碳青霉烯酶KPC基因设计，用作KPC基因下游引物，命名为KPC-R

<400> 10

agacggccaa cacaataggt 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据粪肠球菌基因设计，用作粪肠球菌Fddl基因上游引物，命名为Fddl-F

<400> 11

taacttgggc acaaacac 18

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据粪肠球菌基因设计，用作粪肠球菌Fddl基因下游引物，命名为Fddl-R

<400> 12

atgaatcctt gaattgttcc atctt 25

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据屎肠球菌基因设计，用作屎肠球菌Sddl基因上游引物，命名为Sddl-F

<400> 13

taaagccacg ccttctac 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据屎肠球菌基因设计，用作屎肠球菌Sddl基因下游引物，命名为Sddl-R

<400> 14

gagtatcagc ctttagcg 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据金黄色葡萄球菌基因设计，用作金黄色葡萄球菌nuc基因上游引物，命

名为nuc-F

<400> 15

agcgattgat ggtgatac 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据金黄色葡萄球菌基因设计，用作金黄色葡萄球菌nuc基因下游引物，命

名为nuc-R

<400> 16

aagccttgac gaactaaag 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据细菌16s基因设计，用作细菌16s1基因上游引物，命名为16s1-F

<400> 17

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据细菌16s基因设计，用作细菌16s1基因下游引物，命名为16s1-R

<400> 18

cgtattaccg cggctgctg 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据细菌16s基因设计，用作细菌16s2基因上游引物，命名为16s2-F

<400> 19

gacccgcaca agcggtggag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据细菌16s基因设计，用作细菌16s2基因下游引物，命名为16s2-R

<400> 20

ttgcgctcgt tgcgggactt 20

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据耐万古霉素基因设计，用作耐万古霉素VanA基因特异性检测的寡核苷酸

探针，命名为VanA-P

<400> 21

gtttcacgtc atacagtcgt tatctttttt tttttt 36

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据耐万古霉素基因设计，用作耐万古霉素VanB基因特异性检测的寡核苷酸

探针，命名为VanB-P

<400> 22

cggaatggga agccgacagt ctcctttttt tttttt 36

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据新德里金属-β-内酰胺酶NDM-1耐药基因设计，用作NDM-1基因特异性检

测的寡核苷酸探针，命名为NDM-P

<400> 23

tcaggacaag atgggcggta tggacttttt ttttttt 37

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据耐甲氧西林基因设计，用作耐甲氧西林mecA基因特异性检测的寡核苷酸

探针，命名为mecA-P

<400> 24

aggtgaaata ctgattaacc cagtactttt tttttttt 38

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据编码碳青霉烯酶KPC基因设计，用作KPC基因特异性检测的寡核苷酸探针

，命名为KPC-P

<400> 25

caaatgacta tgccgtcgtc tggccttttt ttttttt 37

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据粪肠球菌基因设计，用作粪肠球菌Fddl基因特异性检测的寡核苷酸探针

，命名为Fddl-P

<400> 26

tgttttacat gggccaaatg gtgatttttt tttttt 36

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据屎肠球菌基因设计，用作屎肠球菌Sddl基因特异性检测的寡核苷酸探针

，命名为Sddl-P

<400> 27

tcctttttcc gtcatcagta taaagtatag tttttttttt tt 42

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据金黄色葡萄球菌基因设计，用作金黄色葡萄球菌nuc基因特异性检测的

寡核苷酸探针，命名为nuc-P

<400> 28

aaaggtgtag agaaatatgg cccttttttt tttttt 36

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据细菌16s基因设计，用作细菌16s1基因特异性检测的寡核苷酸探针，命

名为16s1-P

<400> 29

ctacgggagg cagcattttt ttttttt 27

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 根据细菌16s基因设计，用作细菌16s2基因特异性检测的寡核苷酸探针，命

名为16s2-P

<400> 30

tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttttttt ttttt 35

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 片基质控探针，命名为(T)20

<400> 31

tttttttttt tttttttttt 20

Claims

1.一种VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的制备和用途，本发明的基因芯片可以用于同时检测5种常见的耐药基因和三种相关的病原菌，包括抗万古霉素肠球菌（vancomycin-resistant enterococci,VRE）的耐药基因VanA、VanB；抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的耐药基因mecA；可编码新德里金属-β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase）NDM-1耐药基因；编码碳青霉烯酶KPC基因；以及粪肠球菌特异基因Fddl、屎肠球菌特异基因Sddl和金黄色葡萄球菌特异基因nuc；

其特征是包含（1）检测上述基因的8对特异性引物和2对细菌内标引物；（2）8条耐药基因特异性寡核苷酸探针；（3）芯片质量控制寡核苷酸探针；；（4）寡核苷酸探针固化在载体材料上形成的探针阵列；；

所谓的寡核苷酸探针是指能与目的基因杂交的多聚寡核苷酸，长度在27-42nt；

所谓的特异性引物是指根据基因序列的保守区设计的寡核苷酸，可以扩增出特异性基因，长度在18-25nt；

所谓的质量控制寡核苷酸探针至少包括两种探针，即阳性对照，阴性对照：阳性对照用于检测是否正常杂交和准确定位，阴性对照用于检测杂交信号错误或污染；

所谓的载体材料选自玻片、金属片、硅片、硝酸纤维素；

表1 特异性扩增引物

表2 特异性寡核苷酸探针序列

。

2.如权利要求1所述的检测基因芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

设计特异性引物和探针：以8种特异性基因为靶，从中选取权利要求1所述的引物及探针序列；

合成探针：使用DNA合成仪合成；

引物处理：反向引物5’端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素；

探针处理：在3’或5’末端加上polyT尾巴，并进行氨基修饰，使它能够固化在基质上；

基因芯片的制备：使用点样仪在基质上按预先设定好的顺序进行点样；

将点好的芯片在室温放置干燥18小时以上，使探针牢固固定在基质上。

3.DNA芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤：

（1）步骤一，细菌基因组DNA的提取，使用市售商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；

（2）步骤二，多重不对称PCR扩增：扩增使用多重PCR体系，将整个扩增体系分为A、B两管；A管包括VanA、VanB、Fddl、Sddl、内标16s1；B管包括mecA、nuc、NDM-1、KPC、内标16s2；扩增按以下循环参数进行扩增：95℃预变性15 min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃，30 s，共40个循环；72℃延伸5 min；4℃保存或进行下一步实验；

（3）步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2% SDS和去离子水中分别清洗30s，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在98℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的A管产物2.5μL和B管产物2.5μL与5μL杂交液混匀，加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；

（4）步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1×SSC+0.2%SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30s,最后将基因芯片表面液体离心干燥；

（5）步骤五，样品标记：向芯片加入10μL标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥；

（6）步骤六，扫描：向芯片反应区加入刚刚1:1混合的化学发光液A和B的混合溶液，用移液器涂匀后立即置化学发光成像仪中扫描，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益参数300，曝光时间10s，触发次数1次；

（7）步骤七，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析；

每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值>该探针Cutoff值的判读为该探针信号阳性。

4.根据权利要求3所述的VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤六中使用的扫描方法，根据权利要求2中反向引物修饰分子的不同，扫描方法包括荧光扫描，可见光扫描，化学发光成像。