CN104774941A - 碳青霉烯类抗生素耐药基因检测dna芯片的制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途，其制备方法包括制备九种碳青霉烯类耐药基因特异性引物，制备九种碳青霉烯类抗生素耐药基因特异性探针，制备寡核苷酸芯片，建立多重PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时检测九种常见的碳青霉烯类耐药基因，包括KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM。该DNA芯片具有快速、准确、高通量、高特异的优势，可为碳青霉烯类抗生素耐药表型的耐药基因确认及分子流行病学调查提供一种新的检测手段。

Description

碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途
技术领域
本发明涉及碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域。
背景技术
碳青霉烯类抗生素具有广谱、强效、对绝大多数β-内酰胺酶高度稳定、对头孢菌素耐药菌仍可发挥优良抗菌作用的特点。细菌对该类药物不存在交叉耐药性，因而碳青霉烯类抗生素对革兰氏阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有强大的抗菌活性，是治疗危重感染或初始抗生素治疗失败的复杂感染的常用抗菌药物之一。碳青霉烯类抗生素在大多数情况下耐受性良好，不良反应发生率较低，适用于严重的革兰阴性菌感染、混合感染、耐药菌感染和免疫缺陷者感染，在抗菌治疗中基本处于最后一道防线的地位
但随着广谱抗生素的广泛使用，世界各地陆续出现了产碳青霉烯酶菌株感染造成的暴发流行，给临床带来了极大的麻烦，因其对临床常用的广谱抗生素均耐药，由此引发的感染往往无药可救，病死率极高。而且耐药菌株一旦无法及时清除，就有可能通过克隆传播引起交叉感染，至造成院内感染的暴发流行。另外，由于肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药主要由质粒介导，耐药基因容易随质粒在不同菌种之间传播，造成耐药性的扩散。因此快速、准确的早期诊断是预防及控制耐药株暴发流行、延缓耐药性的发展的关键。常见的碳青霉烯类耐药检测方法有纸片扩散法、稀释法、Etest(表型确认)、改良Hodge实验、自动化药敏检测(VITEK2系统、BD Phoenix、ATB系统)等。但纸片扩散法和稀释法影响因素多，操作技术误差大；Etest和自动化药敏检测价格昂贵，抗生素选择自由度差，不适用于基层临床单位开展。基因芯片技术具有快速、准确、低成本等特点，适用于碳青霉烯类抗生素耐药基因的高通量检测。
发明内容
本发明的目的在于针对碳青霉烯类抗生素耐药检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片，能同时检测九种常见的碳青霉烯类耐药基因，包括KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM，为碳青霉烯类抗生素耐药的临床诊断、表型确证及分子流行病学调查提供一种新的检测手段。
为了达到上述目的，本发明碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片，其制备方法如下：
1.步骤一：制备碳青霉烯类耐药基因特异性引物
选择碳青霉烯类耐药基因KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM作为检测基因，优选9对引物序列，如表1所示：
表1 引物序列及对应的扩增靶标
2.步骤二：制备特异性寡核苷酸探针
根据每种碳青霉烯类耐药基因的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行探针的设计。碳青霉烯类耐药基因各特异性探针序列，如表2所示：
表2 寡核苷酸探针序列及对应的靶标
3.步骤三：制备寡核苷酸芯片
一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3nL。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥18小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括9种碳青霉烯类耐药基因的16条特异性探针，其探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端bio标记、3’端NH2修饰，用来监测醛基片片基质量；A管内标探针为线粒体mtDNA，B管内标探针16s rRNA，用来监测A、B管多重体系质量；阴性探针用来检测有无污染；所有探针的点样量均为3nL，使用前至少在室温放置干燥18小时。
表3 寡核苷酸探针阵列
片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 片基质控
KPC-P NDM1-P1 NDM1-P2 OXA23-P1 OXA23-P2 OXA48-P OXA51-P1 OXA51-P2
KPC-P NDM1-P1 NDM1-P2 OXA23-P1 OXA23-P2 OXA48-P OXA51-P1 OXA51-P2
KPC-P NDM1-P1 NDM1-P2 OXA23-P1 OXA23-P2 OXA48-P OXA51-P1 OXA51-P2
IMP-P1 IMP-P2 VIM-P1 VIM-P2 SIM-P1 SIM-P2 DIM-P NC
IMP-P1 IMP-P2 VIM-P1 VIM-P2 SIM-P1 SIM-P2 DIM-P NC
IMP-P1 IMP-P2 VIM-P1 VIM-P2 SIM-P1 SIM-P2 DIM-P NC
A管内标-P A管内标-P A管内标-P A管内标-P B管内标-P B管内标-P B管内标-P B管内标-P
4.步骤四：建立多重不对称PCR体系
本发明基因芯片中PCR体系的特征为一管六重不对称PCR反应体系，一管五重不对称PCR体系。合适的多重不对称PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化，优选的多重PCR体系，如表4所示：
表4 多重不对称PCR体系配方
优选的PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃60s，共40个循环；72℃延伸5min。
5.步骤五：建立杂交体系
合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物(A管和B管各2.5μL)与杂交液(5μL)等体积混合，优选的杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。
6.步骤六：化学发光显色
1)在芯片反应区加入10μL标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μL的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。
以上制备的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片，包括寡核苷酸芯片、PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、标记液、显色液A、显色液B、阳性质控品、阴性质控品。
一个优选的实施方案使用核酸裂解液与样本按照1∶1比例混合，提取采用煮沸法，98℃水浴10min后置于4℃冰箱30min(期间每隔10min中晃动一下离心管)，短暂离心，吸取上清液备用。提取的DNA溶液使用多重PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行扩增。PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五和步骤六的条件进行杂交和显色。
洗涤后的芯片使用便携式化学发光生物芯片成像仪进行扫描，并运用分析软件判读结果。选择301医院提供的对碳青霉烯类抗生素表型敏感的菌株考察芯片的特异性。制备质粒DNA灵敏度参考品，考察芯片的最低检测限。结果：KPC、NDM-1、OXA-23、OXA48、IMP、DIM的检测限为3×100copies/反应，OXA-51、VIM、SIM的检测限为3×1000copies/反应。
使用本发明制备的基因芯片检测碳青霉烯类耐药基因临床样本。结果显示，基因芯片检测符合率达到100％。表明本实验所建立的基因芯片方法可以对细菌中的碳青霉烯类耐药基因进行准确检测。
本发明建立了一种基于化学发光成像法的基因芯片，可同时甄别九种常见的碳青霉烯类耐药基因，包括KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为碳青霉烯类抗生素耐药的临床诊断及分子流行病学调查提供一种新的检测手段。性能考察表明，本发明的基因芯片以对9种不同种的碳青霉烯类耐药基因进行准确甄别，特异性良好。本发明芯片对9种耐药基因的检测灵敏度为300-3000copies/反应。
附图说明
图1：为本发明碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的阵列示意图，每张芯片上分布有10个相同阵列。
图2：碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片上每个阵列上具体排列布局。图中一个原点代表探针的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。①对应的是KPC特异性探针；②对应的是NDM-1特异性探针1；③对应的是NDM-1特异性探针2；④对应的是OXA-23特异性探针1；⑤对应的是OXA-23特异性探针2；⑥对应的是OXA-48特异性探针；⑦对应的是OXA-51特异性探针1；⑧对应的是OXA-51特异性探针2；⑨对应的是IMP特异性探针1；⑩对应的是IMP特异性探针2；对应的是VIM特异性探针1；对应的是VIM特异性探针2；对应的是SIM特异性探针1；对应的是SIM特异性探针2；对应的是DIM特异性探针；对应的是阴性对照；对应的是A管内标探针；对应的是B管内标探针；对应片基质控探针。
图3：典型的9种碳青霉烯类耐药基因的芯片检测图。其中1-9依次为KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM碳青霉烯类耐药基因芯片检测结果。
图4：基因芯片特异性检测结果图。其中1-10依次为10株对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南表型敏感的菌株检测结果图。
图5：9种碳青霉烯类耐药基因质粒DNA参考品的灵敏度检测结果图。其中1-7依次为KPC 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；8-14依次为NDM1 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；15-21依次为OXA23 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；22-28依次为OXA48 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；29-35依次为OXA51 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；36-42依次为IMP 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；43-49依次为VIM 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；50-56依次为SIM 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；57-63依次为DIM 3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果。
图6：碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片临床样本检测结果图。1-10为对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南表型耐药的培养菌株，11-13为对对碳青霉烯类抗生素表型敏感的培养菌株。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的研制
一、引物探针设计和筛选
首先从NCBI基因数据库中下载碳青霉烯类耐药基因序列，序列下载完成后，使用VectorNTI Advance 10(invitrogen)软件包中的ALignX程序按照默认的参数设置对各耐药基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、通用及特异性引物。经过筛选最终确定共18条上下游引物，将反向引物进行5’端bio标记，作为芯片使用的引物；确定15条特异性检测探针，3’端NH2修饰。
二、寡核苷酸芯片制备及探针阵列
完成探针筛选后，确定了最终的探针阵列，见附图1和附图2。①对应的是KPC特异性探针；②对应的是NDM-1特异性探针1；③对应的是NDM-1特异性探针2；④对应的是OXA-23特异性探针1；⑤对应的是OXA-23特异性探针2；⑥对应的是OXA-48特异性探针；⑦对应的是OXA-51特异性探针1；⑧对应的是OXA-51特异性探针2；⑨对应的是IMP特异性探针1；⑩对应的是IMP特异性探针2；对应的是VIM特异性探针1；对应的是VIM特异性探针2；对应的是SIM特异性探针1；对应的是SIM特异性探针2；对应的是DIM特异性探针；对应的是阴性对照；对应的是A管内标探针；对应的是B管内标探针；对应片基质控探针。
三、多重不对称PCR体系
本发明中PCR体系的特征为一管六重不对称PCR体系、一管五重不对称PCR体系。合适的PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化。当上下游引物终浓度为0.1μM∶0.5μM，Taq酶用量为2.5U/体系时，参考品的探针信号值较强，且低拷贝模板103copie/μL仍然可以检出。优选的PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃，60s，共40个循环；72℃延伸5min。
四、建立并优化杂交体系
通过优化得到同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物与杂交液等体积混合，杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。
五、化学发光显色
1)在芯片反应区加入10μL标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。
2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μL的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。
实施例2：碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片阳性判定标准的确定
Cutoff值是判断基因芯片信号值是否为阳性的标准。每条耐药基因探针分别选取空白对照进行基因芯片杂交，通过反复的实验和数据统计，将空白对照的背景统计平均值+2SD作为每条探针的Cutoff值。将各突变检测探针的区分能力在2.5倍以上作为位点是否出现突变的判断标准。
实施例3：碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的特异性评价
检测了对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南表型敏感的菌株，由附图4可以看出，1-2呈OXA51阳性，OXA51为鲍曼不动杆菌天然耐药基因；3-10检测结果都呈碳青霉烯类耐药基因阴性，特异性良好。本发明检测9种碳青霉烯类耐药基因，由附图3可以看出，9种耐药基因均可以明显区分，说明本发明特异性良好。
实施例4：碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片灵敏度评价
构建9种碳青霉烯类耐药基因质粒DNA作为检测参考品，从109copies/μL梯度稀释至101copies/μL，进行芯片检测，结果见附图5。由附图5可以看出，本发明的KPC、NDM-1、OXA-23、OXA48、IMP、DIM的检测限为3×100copies/反应，OXA-51、VIM、SIM的检测限为3×1000copies/反应。
实施例5：碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片临床样本检测
使用本发明制备的基因芯片，检测对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南表型耐药及表型敏感的培养菌株。结果显示，DNA芯片检测符合率达到100％。部分检测结果见附图6。
除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围。
序列表

Claims (10)

1.一种检测碳青霉烯类抗生素耐药基因的DNA芯片，本发明的基因芯片可以用于同时检测耐药基因KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、SIM、VIM、DIM。其特征是包含检测碳青霉烯类抗生素常见耐药基因的9对通用及特异性引物15条碳青霉烯类耐药基因特异性寡核苷酸探针；1条片基质控探针和1条阴性对照探针和载体。上述探针分别分布在载体上。
表1 碳青霉烯类耐药基因扩增引物
表2 碳青霉烯类耐药基因特异性寡核苷酸探针序列
2.根据权利1所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片，其特征是所述的载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片。
3.一种碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，探针和引物的设计：首先从NCBI基因数据库中下载碳青霉烯类耐药基因序列，使用Vector NTI Advance 10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各碳青霉烯类耐药基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、特异性引物。
步骤二，探针的合成，每条探针的3’端加入12个碱基T且3’末端T氨基修饰作为连接臂，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3’末端T进行氨基修饰外，5’端同时标记生物素标记；
步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100μM，分别取10μL探针溶液，和10μL体积芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μM，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔阵列膜，用芯片制备仪将探针点制在载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，使探针和芯片表面醛基共价结合，点制好的芯片常温干燥保存。
4.根据权利要求3所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途的制备方法，其特征是步骤一中15条特异性寡核苷酸探针及9对引物，探针长度在33-42nt，引物长度在16-20nt。
5.根据权利要求3所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途的制备方法，其特征是步骤三中所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
6.碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的制备和用途的使用方法，其特征是包括以下步骤：
1)步骤一，细菌基因组DNA的提取，采用核酸裂解液与样本按照1∶1比例混合，提取采用煮沸法，98℃水浴10min后置于4℃冰箱30min(期间每隔10min中晃动一下离心管)，短暂离心，吸取上清液备用；
2)步骤二，多重不对称PCR扩增：扩增使用多重PCR体系，将整个扩增体系分为A、B两管。A管包括KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、内标一；B管包括IMP、VIM、SIM、DIM、内标二。扩增按以下循环参数进行扩增：95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃，60s，共40个循环；72℃延伸5min；4℃保存或进行下一步实验；
3)步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2％SDS和去离子水中分别清洗30s，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在98℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的A管产物2.5μL和B管产物2.5.μL与5μL杂交液混匀，加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；
4)步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1×SSC+0.2％SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30s,最后将基因芯片表面液体离心干燥；
5)步骤五，样品标记：向芯片加入10μL标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥；
6)步骤六，扫描：向芯片反应区加入刚刚1∶1混合的化学发光液A和B的混合溶液，用移液器涂匀后立即置化学发光成像仪中扫描，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益参数300，曝光时间10s，触发次数1次；
7)步骤六，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析。每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值＞该探针Cutoff值的判读为该探针信号阳性。
7.根据权利要求6所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的使用方法，其特征是步骤二中使用的用于扩增各碳青霉烯类耐药基因的反向引物5’端进行修饰。
8.根据权利要求7所述的反向引物5’端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素。
9.根据权利要求6所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的使用方法，其特征是步骤三中使用的杂交液组分为8×SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10×Denhardt。
10.根据权利要求6所述的碳青霉烯类抗生素耐药基因检测DNA芯片的使用方法，其特征是步骤六中使用的扫描方法，根据权利要求8中反向引物修饰分子的不同，扫描方法包括荧光扫描，可见光扫描，化学发光成像。
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