CN104946791A

CN104946791A - 七种腹泻病毒检测基因芯片的制备和用途

Info

Publication number: CN104946791A
Application number: CN201510162147.5A
Authority: CN
Inventors: 王升启; 周标; 刘琪琦; 陈苏红; 张敏丽
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2015-04-08
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明涉及一种可检测七种腹泻病毒的基因芯片的制备和用途，其制备方法包括制备七种腹泻病毒特异性引物和探针，制备寡核苷酸芯片，建立多重PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时检测七种重要的肠道病毒，包括A组轮状病毒、B组轮状病毒、I型诺如病毒、II型诺如病毒、星状病毒、札如病毒、肠道腺病毒。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为腹泻病毒感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。

Description

七种腹泻病毒检测基因芯片的制备和用途

技术领域

本发明涉及七种腹泻病毒检测基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域。

背景技术

感染性腹泻是儿童中仅次于呼吸道感染的第二位的多发病，呈世界性分布，在发展中国家5岁以下儿童中尤为突出。感染性腹泻多见的病原有细菌和病毒。随着卫生条件的改变和抗生素的使用，细菌性腹泻在儿童感染性腹泻中的比例逐步下降，而病毒性腹泻所占的比例越来越多。

小儿病毒性腹泻不论是在发展中国家还是在发达国家中都是一个重要的公共卫生健康问题。例如轮状病毒，有研究显示几乎所有5岁以下儿童都有过轮状病毒感染。病毒性腹泻起病急，发病率高，病程长，严重的可导致死亡。若能在感染早期做出正确的诊断，使用正确的治疗方法，可有效缩短病程和避免其他并发症的发生。因此快速、准确的早期诊断是控制病毒性腹泻病的关键。传统的腹泻病毒检测方法主要有细胞生物学方法(病毒分离)、PCR和免疫学诊断。但细胞培养方法分离病毒耗时长，操作复杂；PCR和免疫学方法只能检测一种或几种病原体，不能完全满足检测种类多样的腹泻病毒的需要。而基因芯片技术具有快速、准确、低成本等特点适用于腹泻病毒的高通量检测。

发明内容

本发明的目的在于针对腹泻病毒核酸高通量检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的腹泻病毒甄别检测基因芯片，能同时检测七种重要的腹泻病毒，包括A组轮状病毒、B组轮状病毒、I型诺如病毒、II诺如型病毒、星状病毒、札如病毒、肠道腺病毒，为腹泻病毒感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。

为了达到上述目的，本发明七种腹泻病毒检测基因芯片，其制备方法如下：

1.步骤一：制备腹泻病毒特异性引物

选择轮状病毒的VP7基因、诺如病毒的RdRp基因、星状病毒的ORF1a基因、札如病毒的RdRp基因、肠道腺病毒的hexon基因等作为检测靶基因，可以实现七种腹泻病毒靶基因片段的扩增。优选七对引物序列及其对应的扩增靶标，如表1所示：

表1引物序列及对应的扩增靶标

2.步骤二：制备特异性寡核苷酸探针

根据七种腹泻病毒基因序列间的比对及每种腹泻病毒种内的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行分型探针的设计。腹泻病毒特异性探针序列以及对应的靶标，如表2所示：

表2寡核苷酸探针序列及对应的靶标

3.步骤三：制备寡核苷酸芯片

一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3nl。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥48小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括腹泻病毒12条特异性探针，其探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端bio标记、3’端NH₂修饰，用来监测醛基片片基质量；阴性探针为与腹泻病毒无关的植物基因序列，用来指示特异性；所有探针的点样量均为3nl，使用前至少在室温放置干燥48小时。

表3寡核苷酸探针阵列

片基质控

阳性探针

RotA

RotB1

RotB2

NVI-1

NVI-2

NVII-1

NVII-2

RotA

RotB1

RotB2

NVI-I

NVI-2

NVII-1

NVII-2

RotA

RotB1

RotB2

NVI-1

NVI-2

NVII-1

NVII-2

MON-1

MON-2

SV-1

SV-2

EADVP

内标1

内标2

MON-1

MON-2

SV-1

SV-2

EADVP

内标1

内标2

MON-1

MON-2

SV-1

SV-2

EADVP

内标1

内标2

空白对照

阴性探针

4.步骤四：建立多重不对称PCR体系

本发明基因芯片中PCR体系的特征为2管多重不对称PCR反应体系。合适的多重不对称PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化，优选的多重PCR体系，如表4所示：

表4多重不对称PCR体系配方

优选的PCR扩增条件为：50℃逆转录30min；94℃预变性3min；94℃20s，55℃20s，72℃20s，共40个循环；72℃延伸5min。

5.步骤五：建立杂交体系

合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物(A管和B管各2.5μl)与杂交液(5μl)等体积混合，优选的杂交液各成分为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，10×Denhardt。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

6.步骤六：化学发光显色

1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用Array Vision7.0软件分析结果。

以上制备的腹泻病毒甄别检测基因芯片，包括寡核苷酸芯片、PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、标记液、显色液A、显色液B。

一个优选的实施方案使用市售的DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)提取腹泻病毒核酸，提取参照相应的试剂盒说明书进行。提取的DNA/RNA溶液使用多重PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行扩增。PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五和步骤六的条件进行杂交和显色。

洗涤后的芯片使用便携式化学发光生物芯片成像仪进行成像，并运用分析软件判读结果。选择脊髓灰质炎病毒1型、脊髓灰质炎病毒2型、柯萨奇病毒A16、埃可病毒、肠道病毒71型、甲型肝炎病毒、腺病毒55型、腺病毒1型、腺病毒3型、肠道病毒70型等病毒作为样本，利用上述制备的基因芯片进行检测，考察芯片的特异性。制备体外转录RNA和质粒DNA灵敏度参考品，考察芯片的最低检测限。结果：七种腹泻病毒的检测限均为3×1000copies/反应。

使用本发明制备的基因芯片检测腹泻病毒样本(粪便)。本芯片法检测腹泻病毒样本，直接从粪便样本中提取腹泻病毒核酸，与测序结果一致，经多重不对称RT-PCR扩增后与基因芯片杂交，结果显示，样本基因芯片检测符合率达到100％。表明本实验所建立的基因芯片方法可以对粪便中的腹泻病毒进行准确检测。

本发明建立了一种基于化学发光成像法的基因芯片，可同时甄别七种重要的腹泻病毒，包括A组轮状病毒、B组轮状病毒、I型诺如病毒、II型诺如病毒、星状病毒、札如病毒、肠道腺病毒。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为腹泻病毒感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。性能考察表明，本发明的基因芯片以对七种不同的腹泻病毒进行准确甄别，特异性良好。本发明芯片对七种腹泻病毒的检测灵敏度为3000copies/反应。

附图说明

图1：为本发明七种腹泻病毒检测基因芯片的阵列示意图，每张芯片上分布有10个相同阵列。

图2：七种腹泻病毒检测基因芯片上每个阵列上具体排列布局。图中一个原点代表探针的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。1号对应的是片基质控探针；2号对应的是阳性对照探针；3号对应的是轮状病毒A组特异性探针；4号对应的是轮状病毒B组特异性探针1；5号对应的是轮状病毒B组特异性探针2；6号对应的是I型诺如病毒特异性探针1；7号对应的是I型诺如病毒特异性探针2；8号对应的是II型诺如病毒特异性探针1；9号对应的是II型诺如病毒特异性探针2；10号对应的星状病毒探针1；11号对应的是星状病毒探针2；12号对应的是札如病毒探针1；13号对应的是札如病毒探针2；14号对应的是肠道腺病毒探针；15号对应的是内标探针1；16号对应的是内标探针2。

图3：七种腹泻病毒的芯片检测图。其中1-7依次为A组轮状病毒、B组轮状病毒、I型诺如病毒、II型诺如病毒、星状病毒、札如病毒、肠道腺病毒七种腹泻病毒检测芯片检测结果。

图4：基因芯片特异性检测结果图。其中1-10依次为脊髓灰质炎病毒1型、脊髓灰质炎病毒2型、柯萨奇病毒A16、埃可病毒、肠道病毒71型、甲型肝炎病毒、腺病毒55型、腺病毒1型、腺病毒3型、肠道病毒70型的检测结果图。

图5：七种腹泻病毒体外转录RNA和质粒DNA参考品的灵敏度检测结果图。其中1-6依次为A组轮状病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果；7-12依次为B组轮状病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果；13-18依次为I型诺如病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果；19-24依次为II型诺如病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果；25-30依次为星状病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果；31-36依次为札如病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies体外转录RNA参考品和阴性对照检测结果；37-42依次为肠道腺病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果。

图6：七种腹泻病毒检测基因芯片样本检测结果图。1A组轮状病毒样本检测结果；2为B组轮状病毒样本检测结果；3为I型诺如病毒样本检测结果；4为II型诺如病毒样本检测结果；5为星状病毒样本检测结果；6为札如病毒样本检测结果；7为肠道腺病毒样本检测结果。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：腹泻病毒甄别检测基因芯片的研制

一、引物探针设计和筛选

首先从NCBI基因数据库中下载腹泻病毒靶基因序列，序列下载完成后，使用Vector NTIAdvance 10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、通用及特异性引物。经过筛选最终确定共14条上下游引物，将反向引物进行5’端bio标记，作为芯片使用的引物；确定12条特异性检测探针，3’端NH₂修饰。

二、寡核苷酸芯片制备及探针阵列

完成探针筛选后，确定了最终的探针阵列，见附图1和附图2。1号对应的是片基质控探针；2号对应的是阳性对照探针；3号对应的是轮状病毒A组特异性探针；4号对应的是轮状病毒B组特异性探针1；5号对应的是轮状病毒B组特异性探针2；6号对应的是I型诺如病毒特异性探针1；7号对应的是I型诺如病毒特异性探针2；8号对应的是II型诺如病毒特异性探针1；9号对应的是II型诺如病毒特异性探针2；10号对应的星状病毒探针1；11号对应的是星状病毒探针2；12号对应的是札如病毒探针1；13号对应的是札如病毒探针2；14号对应的是肠道腺病毒探针；15号对应的是内标探针1；16号对应的是内标探针2。

三、多重不对称PCR体系

本发明中PCR体系的特征为两管三重不对称PCR体系。合适的PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化。当上下游引物终浓度为0.16μM：0.8μM，Taq酶的用量2.5U/体系，参考品的探针信号值较强，且低拷贝模板10³copie/μl仍然可以检出。优选的PCR扩增条件为：50℃逆转录30min；94℃预变性3min；94℃20s，55℃20s，72℃20s，共40个循环；72℃延伸5min。

四、建立并优化杂交体系

通过优化得到同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物与杂交液等体积混合，杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，10×Denhardt。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

五、化学发光显色

1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。

2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。

实施例2：七种腹泻病毒检测基因芯片的特异性评价

特异性是诊断方法最重要的考核指标，本发明的基因芯片使用优化好的体系和条件，检测了脊髓灰质炎病毒1型、脊髓灰质炎病毒2型、柯萨奇病毒A16、埃可病毒、肠道病毒71型、甲型肝炎病毒、腺病毒55型、腺病毒1型、腺病3型、肠道病毒70型，由附图4可以看出，上述病毒检测结果都呈腹泻病毒阴性，特异性良好。本发明检测7种腹泻病毒，由附图3可以看出，7种腹泻病毒均可以明显区分，说明本发明特异性良好。

实施例3：七种腹泻病毒检测基因芯片灵敏度评价

构建七种腹泻病毒质粒DNA作为检测参考品，从10⁵copies/μl梯度稀释至10¹copies/μl，进行芯片检测，结果见附图5。由附图5可以看出，本发明的检测限：七种腹泻病毒的检测限均为3×1000copies/反应。

实施例4：七种腹泻病毒检测基因芯片样本检测

使用本发明制备的基因芯片，检测粪便样本中的腹泻病毒。样本前处理，粪便样本经灭菌的PBS缓冲溶液(pH7.4)充分洗涤，并将洗涤液转移至干净的EP管中。4℃，3000r/min离心3min，取上清。上清液于4℃，12000r/min离心10min，收集沉淀。将收集的沉淀用PBS液充分洗涤后备用。样本中腹泻病毒核酸的提取，使用病毒DNA/RNA核酸提取试剂盒(磁珠法)提取样本中的腹泻病毒核酸，与测序结果一致。样本核酸检测，按照说明书中的操作方法进行检测，检测结果阳性率为100％，部分检测结果见附图6。

除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围。

序列表

Claims

1.一种可以检测七种腹泻病毒的基因芯片，本发明的基因芯片可以用于同时检测A组轮状病毒、B组轮状病毒、I型诺如病毒、II诺如型病毒、星状病毒、札如病毒、肠道腺病毒。其特征是包含检测腹泻病毒的7对特异性引物和2对外源性内标引物；12条腹泻病毒特异性寡核苷酸探针；1条片基质控探针，一条阳性对照探针，一条空白对照探针，1条阴性对照探针，2条外源性内标探针和载体。上述探针分别分布在载体上。

表1 A组轮状病毒扩增引物

表2 B组轮状病毒扩增引物

表3 I型诺如病毒扩增引物

表4 II型诺如病毒扩增引物

表5 星状病毒扩增引物

表6 札如病毒扩增引物

表7 肠道腺病毒扩增引物

表8 外源性内标扩增引物1

表9 外源性内标扩增引物2

表10 腹泻病毒特异性寡核苷酸探针序列

2.根据权利1所述的七种腹泻病毒检测基因芯片，其特征是所述的载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片。

3.七种腹泻病毒检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，探针和引物的设计：首先从NCBI基因数据库中下载腹泻病毒基因序列，序列下载完成后，使用Vector NTI Advance 10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、特异性引物。

步骤二，探针的合成，每条探针的3’端加入12个碱基T且3’末端T氨基修饰作为连接臂，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3’末端T进行氨基修饰外，5’端同时标记生物素标记；

步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100μM，分别取10μL探针溶液，和10μL芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μM，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔阵列膜，用PersonalArrayer^TM16个人点样仪(博奥生物有限公司)，将探针点制在载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，点制好的芯片常温干燥保存。

4.根据权利要求3所述的七种腹泻病毒检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤一中12条特异性寡核苷酸探针及7对引物，探针长度在31-44nt，引物长度在18-27nt。

5.根据权利要求3所述的七种腹泻病毒检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤三种所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。

6.七种腹泻病毒检测基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤：

1)步骤一，腹泻病毒核酸的提取，使用市售商品化病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取腹泻病毒核酸；

2)步骤二，多重不对称PCR扩增：扩增使用TaKaRa公司的PCR试剂，将整个扩增体系分为A、B两管。A管包括II型诺如病毒，星状病毒，肠道腺病毒，内标1；B管包括A组轮状病毒，B组轮状病毒，I型诺如病毒，札如病毒，内标2。扩增按以下循环参数进行扩增：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃20s、55℃20s、72℃20s共40个循环，72℃延伸5min，4℃保存或进行下一步实验；

3)步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2％SDS和去离子水中分别清洗30s，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在98℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的A管产物2.5μL和B管产物2.5μL与5μL杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；

4)步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1×SSC+0.2％SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30s，最后将基因芯片表面液体离心干燥；

5)步骤五，样品标记：向芯片加入15μL标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥；

6)步骤六，成像：向芯片反应区加入刚刚1∶1混合的发光液A和B的混合溶液，用移液器涂匀后立即置化学发光成像仪中成像，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益参数300，曝光时间10s，触发次数1次；

7)步骤六，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析。每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值＞该探针Cutoff值的判读为该探针信号阳性。本发明使用方法的步骤二中PCR使用的反向引物修饰分子为生物素。本发明使用方法步骤三中使用的杂交液组分为8×SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10×Denhardt。

7.根据权利要求6所述的七种腹泻病毒检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤二中使用的用于扩增腹泻病毒各特异性基因的反向引物5’端进行修饰。

8.根据权利要求7所述的反向引物5’端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素。

9.根据权利要求6所述的七种腹泻病毒检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤三中使用的杂交液组分为8×SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10×Denhardt。

10.根据权利要求6所述的七种腹泻病毒检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤六中使用的扫描方法，根据权利要求8中反向引物修饰分子的不同，扫描方法包括荧光扫描，可见光扫描，化学发光成像。