CN105671148A - 用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌试剂盒与检测方法 - Google Patents

用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌试剂盒与检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)的试剂盒与检测方法。本发明中的检测引物对选自KPC检测引物对、NDM检测引物对、IMP检测引物对、VIM检测引物对和OXA-48检测引物对中的一对或几对。本发明所述的试剂盒涵盖了常见的耐碳青霉烯类基因，最低检出1拷贝/uL。本发明所述检测方法具有灵敏度好、特异性高、准确定量等特点，对于日益严峻的CRE流行爆发进行检测监控具有重要的临床意义。

Description

用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌试剂盒与检测方法
技术领域
本发明属于耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)检测技术领域，具体涉及碳青酶烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。随着其在临床中的广泛应用，碳青霉烯类抗生素出现严重的耐药现象，耐药细菌表现为广泛耐药。2000年以前，未见碳青霉烯酶广泛流行的报道，更多的是AmpC酶或者ESBL合并膜孔蛋白丢失造成碳青霉烯耐药的报道；2001年，美国北卡罗来纳州首次报道KPC(该菌是1996年在ICU分离出的一株细菌)；2004年，美国纽约布鲁克林地区报道了KPC的暴发流行；从1996年到2006年间，KPC风行美国全国；过去的十年，CRE逐渐成为威胁人类健康的一个重要问题。碳青霉烯耐药的肠杆菌(Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae)或耐碳青霉烯肠杆菌，包括肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、肺炎克雷伯菌等，具有特点包括(1)所致感染病死率高；(2)意味着泛耐药，治疗方案有限(3)位于质粒上的耐药基因在不同种的细菌间传递；(4)耐药转移速度快：从院内到社区；因此对于耐药菌株的快速检测对于患者抗生素精准治疗，减少抗生素滥用具有极为重要的临床意义。
越来越多研究表明，细CRE耐药机理主要包括：碳青霉烯酶与头孢菌素酶合并膜孔蛋白丢失。产碳青霉烯酶基因存在多重，包括KPC、NDM-1、IMP、VIM与OXA-48等这5种最流行的碳青霉烯类抗菌药物耐药机制。KPC是引起肠杆菌科细菌碳青酶烯主要原因，KPC的基因型已达约20种，目前流行的主要是KPC-2和KPC-3；NDM基因大约有12种NDM基因型，是引起全球关注的新发水解活性极强的碳青霉烯酶；IMP和VIM是临床中最为常见的金属β-内酰胺酶。OXA-48高度水解青霉素，轻度水解碳青霉烯类药物(活性中心无疏水桥)，对IPM的活性大于MEM。
目前用于CRE基因型检测的方法有多种类型，包括PCR法、环介导等温扩增方法、基因芯片等，这些方法存在检测通量低、集成程度差、检测费用相对较高等问题。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明针对爆发流行最常见、最关键的基因，采用多重扩增技术，结合CFX96TouchTM荧光定量PCR、biometraToptical型荧光定量PCR等6通道检测系统，单次反应检测以上五种基因的多种亚型，为临床工作者鉴定CRE基因型，缩短时间、降低成本具有极大的临床意义。
本发明目的之一提供一种用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)的试剂盒，试剂盒中包括下述组合物：检测引物对和检测探针。本发明的目的之二还在于提供基于该检测引物对和检测探针的根进一步的试剂盒及检测方法。本发明的组合物、试剂盒及检测方法能够多重扩增分别检测KPC、NDM与IMP、VIM、OXA-48等耐药基因，并且实现耐药基因定量测定。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒，包括下述检测引物对中的至少一对：
检测引物对1：
KPC上游引物为：5′-ATCGCCGTCTAGTTCTGCTG-3′，如SEQIDNO.1所示，
KPC下游引物为：5′-TATCCATCGCGTACACACCG-3′，如SEQIDNO.2所示；
检测引物对2：
NDM上游引物为：5′-GCAAATGGAAACTGGCGACC-3′，如SEQIDNO.4所示，
NDM下游引物为：5′-TCAAACCGTTGGAAGCGACT-3′，如SEQIDNO.5所示；
检测引物对3：
IMP上游引物为：5′-TTCAGTTGGTTCAGTTGTTGGTG-3′，如SEQIDNO.7所示，
IMP下游引物为：5′-TGGATTAAATAGCCAAACTGACGC-3′，如SEQIDNO.8所示；
检测引物对4：
VIM上游引物为：5′-ACCAGATTGCCGATGGTGTT-3′，如SEQIDNO.10所示，
VIM下游引物为：5′-TCGTCATGAAAGTGCGTGGA-3′，如SEQIDNO.11所示；
检测引物对5：
OXA-48上游引物为：5′-GGGCGATCAAGCTATTGGGA-3′，如SEQIDNO.13所示，
OXA-48下游引物为：5′-GGCTGTGTTTTTGGTGGCAT-3′，如SEQIDNO.14所示。
本发明从众多基因中选择KPC、NDM与IMP、VIM、OXA-48中的一种或几种作为检测的目的基因，一方面，可以保证检测结果的灵敏性和有效性，另一方面，具有操作简便、成本低、所需时间短等优点。在引物的设计过程中，由于检测样本的不确定性，往往出现非特异性扩增、无法扩增出或者引物与引物之间、引物与其他探针之间扩增相互干扰等问题，发明人意外的发现上述序列的检测引物具有很好的特异性和有效性，尤其，当这几种基因KPC、NDM与IMP、VIM、OXA-48一起联合使用时，效果会更好。
进一步，包括至少一个对应与上述检测引物对匹配的检测探针，
与检测引物对1匹配的检测探针为KPC探针：
KPC探针包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，优选地，
KPC探针为：5′-荧光标记物1/GGCCGCTGGCTGGCTTTTCTGCCAC/淬灭剂-3′；
与检测引物对2匹配的检测探针为NDM探针：
NDM探针包括SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，优选地，
NDM探针为：5′-荧光标记物2/TCGCACCGAATGTCTGGCAGCACA/淬灭剂-3′；
与检测引物对3匹配的检测探针为IMP探针：
IMP探针包括SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，优选地，
IMP探针为：5′-荧光标记物3/TAATTGCTTATTTTGCGTCAGTTTGGC/淬灭剂-3′；
与检测引物对4匹配的检测探针为VIM探针：
VIM探针包括SEQIDNO.12所示的核苷酸序列，优选地，
VIM探针为：5′-荧光标记物4/TCGTTTGATGGCGCAGTCTACCCGTCC/淬灭剂-3′；
与检测引物对5匹配的检测探针为OXA-48探针：
OXA-48探针包括SEQIDNO.15所示的核苷酸序列，优选地，
OXA-48探针为：5′-荧光标记物5/ATTATTGGTAAATCCTTGCTGCTTATTC/淬灭剂-3′。
所述荧光标记物1至荧光标记物5选自不同的荧光标记物，用以保证在在同一体系中通过不同的荧光标记物来区分内标与目的基因。
用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至200bp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性基因。探针可选用下述任一荧光标记物在其5′端标记：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED、Quasar705等；选用下述任一淬灭剂在其3′端标记：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非突光淬灭剂(MinorGrooveBindernonfluorescentquencher，MGBNFQ)。
优选地，所述KPC探针的5′端标有荧光基团FAM，KPC探针的3′端标有淬灭基团BHQ-1；所述NDM探针的5′端标有荧光基团HEX，NDM探针的3′端标有淬灭基团BHQ-1；所述IMP探针的5′端标有荧光基团TexsaRed，IMP探针的3′标有淬灭基团BHQ-2；所述VIM探针的5′端标有荧光基团Cy5，VIM探针的3′端标有淬灭基团BHQ-2；所述OXA-48探针的5′端标有荧光基团Quasar705，OXA-48探针的3′端标有淬灭基团BHQ-3。
通过上述引物与探针的设计可以进一步保证扩增的特异性和高效性。
进一步，还包括PCR反应混合液，
PCR反应混合液：Buffer10×缓冲液8μL、各检测引物对0.3μM、各检测探针0.3μM和dNTP各组分0.8mM。
进一步，还包括Taq酶，优选地，Taq酶在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40％；在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90％。通过高活性酶的选择，可以进一步保证扩增结果的准确性。
进一步，还包括阳性对照，所述阳性对照为包括检测引物对检测的基因的序列的DNA片段或质粒；
KPC检测引物对1检测的DNA片段(简称为KPC检测片段)包括SEQIDNO.16所示的核苷酸序列；
NDM检测引物对2检测的DNA片段(简称为NDM检测片段)包括SEQIDNO.17所示的核苷酸序列；
IMP检测引物对3检测的DNA片段(简称为IMP检测片段)包括SEQIDNO.18所示的核苷酸序列；
VIM检测引物对4检测的DNA片段(简称为VIM检测片段)包括SEQIDNO.19所示的核苷酸序列；
OXA-48检测引物对5检测的DNA片段(简称为OXA-48检测片段)包括SEQIDNO.20所示的核苷酸序列。
进一步，还包括阴性对照，所述阴性对照为生理盐水，优选地，浓度为0.9％(m/v)的生理盐水。
本发明还提供上述用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒在诊断或辅助性诊断耐碳青霉烯类肠杆菌中的应用。
在应用中，可以为粪便、尿液、汗液、脓液、脑积水、血液、痰液、鼻咽拭子等可能含有耐碳青霉烯类基因的样本来源；所述待测样本优选为样本中提取的DNA。
本发明提供一种用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
将待测样本、Taq酶加入到上述的PCR反应混合液中，混匀，进行荧光定量PCR扩增，根据荧光荧光定量PCR扩增的结果分析耐碳青霉烯类肠杆菌类型。具体地，将5μL的待测样本与0.6μLTaq酶加入到所述的34.4μLPCR反应混合液中混匀。
本发明中，所述的耐碳青霉烯类肠杆菌包括肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏、粘质沙雷菌等可能携带KPC、NDM、IMP、VIM或OXA-48基因致病菌。
进一步，荧光定量PCR扩增的反应条件如下：
荧光定量扩增的反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、58℃30s，40个循环，收集荧光信号(例如，收集收集FAM/HEX荧光信号)。
发明人意外的发现上述条件可以保证扩增的特异性。
进一步，在加入待测样本的同时，还设定阳性对照和阴性对照。
采取上述技术方案的有益效果为：进一步保证扩增结果的准确性。
本发明提供的一种用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)的试剂盒及其监测方法，可便捷、快速、准确的检测KPC、NDM、IMP、VIM或OXA-48耐药基因。对于实际应用而言，能够在1.5小时内获得检测结果，对快速辅助药物治疗指导与用药选择具有重要意义。同时，可用于流行病学调研和疫情监控以研究或了解耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)在中国乃至全球的流行情况。
附图说明
图1为含有KPC基因的重组质粒pUC57-PKC104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液扩增检测结果，NC表示阴性对照；
图2为含有NDM基因的重组质粒pUC57-NDM104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液检测结果，NC表示阴性对照；
图3为含有IMP基因的重组质粒pUC57-IMP104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液检测结果，NC表示阴性对照；
图4为含有VIM基因的重组质粒pUC57-VIM104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液检测结果，NC表示阴性对照；
图5为含有OXA-48基因的重组质粒pUC57-OXA-48104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液检测结果，NC表示阴性对照。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规商业获得。
实施例1用于耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)检测试剂盒的制备
本发明所提供的用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)的试剂盒组成如下：
1、PCR反应混合液
PCR反应混合液各组分与浓度组成如下：Buffer10×缓冲液8μl、检测引物对、检测探针0.3μM和dNTP各组分0.8mM；
检测引物对中的上、下游检测引物分别为0.3μM。
检测引物对包括所有下述检测引物对：
检测引物对1：
KPC上游引物为：5′-ATCGCCGTCTAGTTCTGCTG-3′，如SEQIDNO.1所示，
KPC下游引物为：5′-TATCCATCGCGTACACACCG-3′，如SEQIDNO.2所示；
检测引物对2：
NDM上游引物为：5′-GCAAATGGAAACTGGCGACC-3′，如SEQIDNO.4所示，
NDM下游引物为：5′-TCAAACCGTTGGAAGCGACT-3′，如SEQIDNO.5所示；
检测引物对3：
IMP上游引物为：5′-TTCAGTTGGTTCAGTTGTTGGTG-3′，如SEQIDNO.7所示，
IMP下游引物为：5′-TGGATTAAATAGCCAAACTGACGC-3′，如SEQIDNO.8所示；
检测引物对4：
VIM上游引物为：5′-ACCAGATTGCCGATGGTGTT-3′，如SEQIDNO.10所示，
VIM下游引物为：5′-TCGTCATGAAAGTGCGTGGA-3′，SEQIDNO.11所示；
检测引物对5：
OXA-48上游引物为：5′-GGGCGATCAAGCTATTGGGA-3′，SEQIDNO.13所示，
OXA-48下游引物为：5′-GGCTGTGTTTTTGGTGGCAT-3′，SEQIDNO.14所示。
检测探针包括至少一个与上述检测引物对匹配的检测探针，
与检测引物对1匹配的检测探针为KPC探针(即探针1)：
KPC探针：5′-FAM/GGCCGCTGGCTGGCTTTTCTGCCAC/BHQ-1-3′；
与检测引物对2匹配的检测探针为NDM探针(即探针2)：
NDM探针：5′-HEX/TCGCACCGAATGTCTGGCAGCACA/BHQ-1-3′；
与检测引物对3匹配的检测探针为IMP探针(即探针3)：
IMP探针：5′-TexsaRed/TAATTGCTTATTTTGCGTCAGTTTGGC/BHQ-2-3′；
与检测引物对4匹配的检测探针为VIM探针(即探针4)：
VIM探针：5′-Cy5/TCGTTTGATGGCGCAGTCTACCCGTCC/BHQ-2-3′；
与检测引物对5匹配的检测探针为OXA-48探针(即探针5)：
OXA-48探针：5′-Quasar705/ATTATTGGTAAATCCTTGCTGCTTATTC/BHQ-3-3′；
2、Taq酶：购自TAKARA的HSTaq酶。
3、阳性对照品：所述阳性对照为包括检测引物检测的基因的序列的DNA片段或质粒；
KPC基因被检测片段序列为：
ATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCATGGCCGCTGGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTAAACTCGAACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCGCAACTGTAAGTTACCGCGCT，如SEQIDNO.16所示；
NDM基因被检测片段序列为：
GCAAATGGAAACTGGCGACCAACGGTTTGGCGATCTGGTTTTCCGCCAGCTCGCACCGAATGTCTGGCAGCACACTTCCTATCTCGACATGCCGGGTTTCGGGGCAGTCGCTTCCAACGGTTTGA，如SEQIDNO.17所示。
IMP基因被检测片段序列为：
TTCAGTTGGTTCAGTTGTTGGTGTTTTAGTATTATTTTTAATAATTGCTTATTTTGCGTCAGTTTGGCTATTTAATCCA，如SEQIDNO.18所示。
VIM基因被检测片段序列为：
ACCAGATTGCCGATGGTGTTTGGTCGCATATCGCAACGCAGTCGTTTGATGGCGCAGTCTACCCGTCCAATGGTCTCATTGTCCGTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTGCGAAAAACACAGCGGCACTTCTCGCGGAGATTGAGAAGCAAATTGGACTTCCTGTAACGCGTGCAGTCTCCACGCACTTTCATGACGA，如SEQIDNO.19所示。
OXA-48基因被检测片段序列为：
GGGCGATCAAGCTATTGGGAATTTTAAAGGTAGATGCGGGTAAAAATGCTTGGTTCGCCCGTTTAAGATTATTGGTAAATCCTTGCTGCTTATTCTCATTCCAGAGCACAACTACGCCCTGTGATTTATGTTCAGTAAAGTGAGCATTCCAACTTTTGTTTTCTTGCCATTCCTTTGCTACCGCAGGCATTCCGATAATCGATGCCACCAAAAACACAGCC，如SEQIDNO.20所示。
分别合成上述序列，构建到pUC57质粒(购自金斯瑞生物技术有限公司)，经双酶切与测序鉴定正确无误。测定质粒浓度，并将质粒稀释为103拷贝/μL作为阳性对照品。
因为质粒构建为本领域的常规技术手段，故没有详细列出。
4、阴性对照品：0.9％(m/v)生理盐水。
实施例2用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)试剂盒的使用方法
1、反应体系配制
组分 体积
PCR反应混合液 34.4μL
Taq酶 0.6μL
样本DNA 5μL
总体积 40μL
取34.4μL的PCR反应混合液、0.6μLTaq酶和5μL样本DNA混合成为40μL反应溶液，涡旋震荡均匀后离心。
2、荧光实时定量PCR反应与检测
荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、58℃30s，40个循环，收集FAM/HEX信号。
3、结果判断
反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线与循环数Ct作为各基因存在与否的判断依据；若待测样本呈现S型扩增曲线且Ct值小于40，则所述样本中存在对应的耐药基因。例如：NDM基因的检测引物对与探针能够扩增到，那么说明该基因存在；如果NDM基因的检测引物对与探针不能够扩增到，无信号，则不存在该基因。
上述五种基因中，如果有任何一种基因检测到，说明属于耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)。
实施例3.用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)试剂盒的灵敏度与特异性分析
一、参考品DNA核酸的制备
分别构建包含KPC、NDM、IMP、VIM或OXA-48基因质粒
分别以待测KPC、NDM、IMP、VIM或OXA-48为模板，由南京金斯瑞生物技术公司合成如发明内容所述的各标准品(SEQIDNO.16-SEQIDNO.20)。将各标准品分别连接到pUC57载体，并测序校对。
含有KPC基因的重组质粒命名为pUC57-PKC；含有NDM基因的重组质粒命名为pUC57-NDM；含有IMP基因的重组质粒命名为pUC57-IMP；含有VIM基因的重组质粒命名为pUC57-VIM；含有OXA-48基因的重组质粒命名为pUC57-OXA-48。
二、用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)试剂盒的灵敏度与特异性分析
1、不同浓度的参考品制备
将上述合成包含KPC的质粒进行定量，并定量为1010拷贝/μL，并梯度稀释，得到105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液。
将上述合成包含NDM的质粒进行定量，并定量为1010拷贝/μL，并梯度稀释，得到105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液。
将上述合成包含IMP的质粒进行定量，并定量为1010拷贝/μL，并梯度稀释，得到105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液。
将上述合成包含VIM的质粒进行定量，并定量为1010拷贝/μL，并梯度稀释，得到105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液。
将上述合成包含OXA-48的质粒进行定量，并定量为1010拷贝/μL，并梯度稀释，得到105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL等不同浓度梯度稀释液。
2、反应体系配制
组分 体积
PCR反应混合液 34.4μL
Taq酶 0.6μL
样本DNA 5μL
总体积 40μL
取34.4μL的PCR反应液、0.6μLTaq酶和5μL样本DNA混合成为40μL反应溶液，涡旋震荡均匀后离心。
3、荧光实时定量PCR反应与检测
荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、58℃30s，40个循环，收集FAM/HEX信号。
三、检测结果
图1-5所示为KPC、NDM、IMP、VIM或OXA-48参考品检测结果。
如图1所示，对于检测引物对1与探针1而言，反应体系最低检出100拷贝/μL的KPC重组质粒模板，扩增结果均有明显的S型扩增曲线；但NDM、IMP、VIM、OXA-48重组质粒的各种浓度均不能被检出。
如图2所示，对于检测引物对2与探针2而言，反应体系最低检出100拷贝/μL的NDM重组质粒模板，扩增结果均有明显的S型扩增曲线；但KPC、IMP、VIM、OXA-48重组质粒的各种浓度均不能被检出。
如图3所示，对于检测引物对3与探针3而言，反应体系最低检出100拷贝/μL的IMP重组质粒模板，扩增结果均有明显的S型扩增曲线；但KPC、NDM、VIM、OXA-48重组质粒的各种浓度均不能被检出。
结果如图4所示，对于检测引物对4与探针4而言，反应体系最低检出100拷贝/μL的VIM重组质粒模板，扩增结果均有明显的S型扩增曲线；但KPC、NDM、IMP、OXA-48重组质粒的各种浓度均不能被检出。
如图5所示，对于检测引物对5与探针5而言，反应体系最低检出100拷贝/μL的OXA-48重组质粒模板，扩增结果均有明显的S型扩增曲线；但KPC、NDM、IMP、VIM重组质粒的各种浓度均不能被检出。
以上结果说明该试剂盒具有较高的扩增灵敏度与特异性。
实施例4用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)试剂盒检测感染样本
1、菌株
收集武汉市协和医院可疑耐碳青霉烯类肠杆菌，用琼脂扩散敏感实验(K-B法)筛选对亚胺培南或美罗培南药敏结果耐受或中介的肠杆菌科菌株，共计检测到39株，具体见表1。
表1细菌分布科室情况
2、提取临床标本DNA
临床标本DNA提取所用的试剂盒为OMEGA细菌基因组提取试剂盒，具体步骤如下：
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入等体积请参照瓶上的标签。所有离心步骤均使用台式离心机在常温下离心。
(1)取菌培养液或细菌1mL，12000rpm离心1min，尽量吸进上清。
(2)向沉淀中加入溶液A，震荡菌体充分悬浮(如果为革兰氏阳性细菌，可以在此步骤中加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶)，加入200μL10mg/mL的RNaseA，37℃放置15-30min。
(3)向试管中加入20μL10mg/mL的蛋白酶K，混合均匀，55℃消化30-60min，期间可颠倒离心管混匀数次。
(4)向试管中加入200μL溶液B，75℃条件下15-30min。
(5)向试管中加入200μL无水乙醇，充分混匀，将溶液加入吸附柱中，静置2min。
(6)12000rpm离心1min，废弃液，将吸附柱放入收集管中。
(7)向吸附柱中加入700μL漂洗液用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，废弃液，将吸附柱放入收集管中。
(8)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心1min，废弃液，将吸附柱放入收集管中。
(9)12000rpm离心2min，晾干吸附柱。
(10)吸附柱中间加入200μL-500μL75℃预热的洗脱缓冲液，静置5min，12000rpm离心2min。
(11)离心洗脱液重新加入吸附柱中，静置2min，12000rpm离心2min，即获得高质量的基因组DNA。
上述中，溶液A、蛋白酶K、溶液B、吸附柱、漂洗液和洗脱缓冲液等均为OMEGA细菌基因组提取试剂盒自带产品或试剂。
3、反应体系配制
组分 体积
PCR反应混合液 34.4μL
Taq酶 0.6μL
样本DNA 5μL
总体积 40μL
取34.4μL的PCR反应混合液、0.6μLTaq酶和5μL样本DNA混合成为40μL反应溶液，涡旋震荡均匀后离心。
4、荧光实时定量PCR反应与检测
荧光定量PCR反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、58℃30s，40个循环，收集FAM/HEX信号。
5、检测结果
本发明试剂盒的检测结果显示，针对以上每种耐碳青霉稀类肠杆菌，经荧光定量PCR方法检测显示均为阳性结果。其中部分上述耐碳青霉稀类肠杆菌为单个基因阳性，多数为多基因检测阳性，说明耐碳青霉稀类肠杆菌具有多种耐药基因携带的情况普遍存在。通过与传统的检测方法(琼脂扩散敏感实验(K-B法))相比，本检测试剂盒与传统检测方法一致性好，并且能检测耐碳青霉稀类肠杆菌的具体耐药基因(传统检测方法不能确定)。本检测试剂盒和琼脂扩散敏感实验(K-B法)检测耐碳青霉稀类肠杆菌的统计结果参见下表2。表2中″+″表示检测的到，表2中空白表示没有检测到。根据表2中可以看出，各株菌均能检测到至少一种目的基因，说明这些菌株属于耐碳青霉稀类肠杆菌。
表2检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒，其特征在于，包括下述检测引物对中的至少一对：
检测引物对1：
KPC上游引物为：5’-ATCGCCGTCTAGTTCTGCTG-3’，如SEQIDNO.1所示，
KPC下游引物为：5’-TATCCATCGCGTACACACCG-3’，如SEQIDNO.2所示；
检测引物对2：
NDM上游引物为：5’-GCAAATGGAAACTGGCGACC-3’，如SEQIDNO.4所示，
NDM下游引物为：5’-TCAAACCGTTGGAAGCGACT-3’，如SEQIDNO.5所示；
检测引物对3：
IMP上游引物为：5’-TTCAGTTGGTTCAGTTGTTGGTG-3’，如SEQIDNO.7所示，
IMP下游引物为：5’-TGGATTAAATAGCCAAACTGACGC-3’，如SEQIDNO.8所示；
检测引物对4：
VIM上游引物为：5’-ACCAGATTGCCGATGGTGTT-3’，如SEQIDNO.10所示，
VIM下游引物为：5’-TCGTCATGAAAGTGCGTGGA-3’，如SEQIDNO.11所示；
检测引物对5：
OXA‐48上游引物为：5’-GGGCGATCAAGCTATTGGGA-3’，如SEQIDNO.13所示，
OXA‐48下游引物为：5’-GGCTGTGTTTTTGGTGGCAT-3’，如SEQIDNO.14所示。
2.根据权利要求1所述用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒，其特征在于，包括至少一个对应与上述检测引物对匹配的检测探针，
与检测引物对1匹配的检测探针为KPC探针：
KPC探针：5’-荧光标记物1/GGCCGCTGGCTGGCTTTTCTGCCAC/淬灭剂-3’，如SEQIDNO.3所示；
与检测引物对2匹配的检测探针为NDM探针：
NDM探针：5’-荧光标记物2/TCGCACCGAATGTCTGGCAGCACA/淬灭剂-3’，如SEQIDNO.6所示；
与检测引物对3匹配的检测探针为IMP探针：
IMP探针：5’-荧光标记物3/TAATTGCTTATTTTGCGTCAGTTTGGC/淬灭剂-3’，如SEQIDNO.9所示；
与检测引物对4匹配的检测探针为VIM探针：
VIM探针：5’-荧光标记物4/TCGTTTGATGGCGCAGTCTACCCGTCC/淬灭剂-3’，如SEQIDNO.12所示；
与检测引物对5匹配的检测探针为OXA-48探针：
OXA-48探针：5’-荧光标记物5/ATTATTGGTAAATCCTTGCTGCTTATTC/淬灭剂-3’，如SEQIDNO.15所示；
所述荧光标记物1至荧光标记物5选自不同的荧光标记物。
3.根据权利要求2所述用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应混合液,
PCR反应混合液：Buffer10×缓冲液8μL、检测引物对、检测探针0.3μM和dNTP各组分0.8mM；
检测引物对包括KPC检测引物对、NDM检测引物对、IMP检测引物对、VIM检测引物对和OXA‐48检测引物对，其中的上、下游检测引物分别为0.3μM。
4.根据权利要求2所述用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照为包括检测引物对检测的基因的序列的DNA片段或质粒；
KPC检测片段包括SEQIDNO.16所示的核苷酸序列；
NDM检测片段包括SEQIDNO.17所示的核苷酸序列；
IMP检测片段包括SEQIDNO.18所示的核苷酸序列；
VIM检测片段包括SEQIDNO.19所示的核苷酸序列；
OXA-48检测片段包括SEQIDNO.20所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照，所述阴性对照为生理盐水。
6.权利要求1-5任一项所述用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒在诊断或辅助性诊断耐碳青霉烯类肠杆菌中的应用。
7.用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样本、Taq酶加入到权利要求3-5任一项所述的PCR反应混合液中，混匀，进行荧光定量PCR扩增，根据荧光荧光定量PCR扩增的结果分析耐碳青霉烯类肠杆菌类型。
8.根据权利要求7所述用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的反应条件如下：
荧光定量扩增的反应条件如上表所示：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃20s、58℃30s，40个循环，收集荧光信号。
9.根据权利要求7所述用于检测耐碳青霉烯类肠杆菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，在加入待测样本的同时，还设定阳性对照和阴性对照。
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