CN117802260A - 用于检测碳青霉烯耐药基因的引物探针组合产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明大体涉及病原微生物技术领域，具体而言，涉及一种用于检测碳青霉烯耐药基因的引物探针组合产品及其应用。该引物探针组合产品可以快速、灵敏和高特异性的检测碳青霉烯耐药基因，可用于临床中对疑似多重耐药菌感染的病人及时，准确地诊断。

Description

用于检测碳青霉烯耐药基因的引物探针组合产品及其应用
技术领域
本发明大体涉及病原微生物技术领域，具体而言，涉及一种用于检测碳青霉烯耐药基因的引物探针组合产品及其应用。
背景技术
当前，细菌耐药已经成为全球公共卫生领域的重大挑战，多重耐药（multidrugresistance，MDR）、广泛耐药（extensive drug resistance，XDR）、甚至全耐药（pandrugresistance，PDR）细菌的出现和流行给人类健康带来了巨大威胁。在临床面临的诸多耐药菌中，最重要的是碳青霉烯耐药的革兰阴性杆菌，尤其是近年迅速增加的碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）。自2001年美国首次报道碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌以来，CRE 在全球范围内快速播散，2017年，WHO将 CRE 列为最需要新抗菌药物的耐药菌。2019 年美国疾病预防控制中心（CDC）将 CRE 列为耐药菌威胁人类健康的“紧急威胁”级病原菌。因此如何早期快速识别和及时针对治疗CRE 感染已成为当前抗感染领域最为棘手的问题。
肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的主要耐药机制包括产碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失或突变、外排泵过度表达，以及青霉素结合蛋白变异等，其中最主要的是产碳青霉烯酶，其是一类能水解广谱β-内酰胺环的水解酶，可以使所有含有β-内酰胺环的抗菌药物失效。编码酶的基因位于基因组DNA上或质粒上，因为水平基因转移元件的存在，可以对各种耐药基因进行整合，并通过质粒进行传播，使耐药基因的传播跨越生殖隔离，耐药性更加具有传播性。通过检测病原菌是否携带碳青霉烯酶编码基因，可以快速准确从疑似耐药病人样本（痰液）中制备的核酸中检测病原菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性，该检测可让医生作出有关治疗的关键患者管理决策。
多重荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR技术基础上发展出的多重联检，能够在同一个反应管中实现多个基因序列的扩增和特异性检测。在临床病原体检测的应用中，可同步检测同一样本内几种检测目标，有利于快速判断病原体，实现疾病的早期、快速、精准治疗。多重PCR技术的成功实施需要解决以下几个关键技术问题：（1）由于需要使用多组引物/探针组合，设计时需要避免不同引物/探针之间互相产生交联。（2）避免每组引物/探针对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性结果。（3）每种扩增子的最佳扩增条件不同，需要优化反应条件，保证在单一扩增条件下各扩增子都能成功扩增。（4）需要有内对照作为参考以排除来自核酸提取等方面的干扰。
目前国内还没有可对碳青霉烯类抗生素耐药的检测进行多重PCR法检测，并保证检测准确性和特异性的有效方法。
发明内容
本公开涵盖以下实施方案：
引物探针组合产品，包括a)~c)：
a) 核苷酸序列为SEQ ID NO：1~2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
b) 核苷酸序列为SEQ ID NO：4~5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针；
c) 核苷酸序列为SEQ ID NO：7~8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针。
含有如上所述引物探针组合产品的试剂盒。
如上所述的引物探针组合产品在制备用于碳青霉烯耐药基因检测的检测剂或试剂盒中的应用；
所述碳青霉烯耐药基因包括blaKPC、blaNDM、blaOXA-48中的至少一种。
以及一种检测碳青霉烯耐药基因的非诊断目的方法，包括：
i) 获取待检测样本中的核酸；
ii) 使用如上所述的引物探针组合产品，或如上所述的试剂盒，以所述核酸为模板进行扩增以确定所述样本中是否存在碳青霉烯耐药基因blaKPC、blaNDM、blaOXA-48中的至少一种。
本发明所提供的引物探针组合产品，一方面针对每个耐药基因的引物和探针菌具有优异的稳定性和特异性，在一些实施场景中可检出浓度≤5×101copies/μL；第二方面通过大量实验进行筛选，能够将组合产品合理地分配至同一个反应体系中，有效地避免了在PCR反应过程中的互相干扰，使多重荧光定量PCR方法得以实现；同时可以快速、灵敏和高特异性的检测碳青霉烯耐药基因。本发明可用于临床中对疑似多重耐药菌感染的病人及时，准确地诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为KPC和阴性对照组的扩增曲线；
图2为NDM和阴性对照组的扩增曲线；
图3为OXA-48和阴性对照组的扩增曲线；
图4为内质控和阴性对照组的扩增曲线；
图5为多重组合的检测结果，其中包括：①NDM、②IC、③KPC和④OXA-48；
图6为100例临床样本的检测结果的ROC曲线。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2%，可以允许±0.1%范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1%、±2%、±5%等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10%的波动。
本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本发明的第一方面涉及引物探针组合产品，包括a)~c)：
a) 核苷酸序列为SEQ ID NO：1~2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
b) 核苷酸序列为SEQ ID NO：4~5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针；
c) 核苷酸序列为SEQ ID NO：7~8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针。
在一些实施方式中，所述的引物探针组合产品还包含d) 用于内质控的引物和探针。
在一些具体的实施方式中，d) 核苷酸序列为SEQ ID NO：10~11所示的引物以及SEQ ID NO：12所示的探针。
另外，需要说明的是，在一个方面，本领域技术人员所理解的SEQ ID NO：1~12所示的引物或探针，其含义包括与SEQ ID NO：1~12所示的引物或探针具有大于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。容易理解，本领域技术人员对于上述序列的保护范围还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。
术语“%同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，%同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST (Altschuletal., 1990、J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic AcidsRes25:17, 3389-402)确定百分比同一性。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
在一些实施方式中，所述探针标记有可检测的信号物质。在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子（如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团），也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物（比如拟肽），非天然核酸及其类似物（拟核苷酸）和纳米结构（包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等）。
在一些实施方式中，所述探针为自身淬灭探针。
在一些实施方式中，所述探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
在一些实施方式中，所述引物探针组合产品中各探针上所标记的信号物质能够被区分；在一些实施方式中，所述组合产品中各探针的荧光发射基团所携带的荧光信号能够被区分。
在一个具体的实施例中，SEQ ID NO：3、6、9、12所示的探针上的荧光发射基团选自FAM、Texas、HEX和Cy5。
在一些实施方式中，所述探针的淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
在一个具体的实施例中，SEQ ID NO：3、6、9、12所示的探针上的荧光淬灭基团依次分别为BHQ1、BHQ2、BHQ1和BHQ2。
在一个具体的实施例中，上述a)~d)中的引物探针，可以在同一个反应体系中使用组或多组以组成多重反应体系提高反应效率。
本发明的第二方面提供含有如上所述引物探针组合产品的试剂盒。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中，所述的试剂盒还包含DNA提取试剂、扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品、防腐剂以及水中的至少一种。
适合于实施本发明的 DNA聚合酶是本领域熟知的，可以从多个来源获得，例如选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶以及Klenow片段中的任一种。在一些较为优选的实施方式中，聚合酶是热稳定性的，可以从多种商业途径获得，优选的热稳定性的DNA聚合酶可以包括但不限于：TaqDNA聚合酶或其突变体、衍生物或片段。
本发明所用的水通常为无核酸和/或无核酸酶的水，形式可以是蒸馏水、去离子水或反渗水。
优选的，试剂盒中的核酸组分，例如引物、探针、阳性对照以及阴性对照以干粉形式存放于试剂盒中。阳性对照可以为碳青霉烯耐药基因DNA，或者含有待检测核酸片段的其他组分。阳性对照可以以质粒的方式存在。阴性对照可选为无菌水。
各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后（在所述制造后物质通常作为粉末存在）被压制成球形的冻干物。因此，可以以冻干形式提供PCR批次所需的组分，特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。
本发明的第三方面提供如上所述引物探针组合产品在制备用于碳青霉烯耐药基因检测的检测剂或试剂盒中的应用；
所述碳青霉烯耐药基因包括blaKPC、blaNDM、blaOXA-48中的至少一种。
本发明所检测的对象可以是任意的含有 DNA 的生物 DNA样本。在一些实施方式中，所述DNA样本为基因组DNA。
在一些实施方式中，所述DNA样本来自血液、血清、血浆、细胞培养上清、唾液、痰液、精液、粪便、组织或组织裂解液。在一些实施方式中，所述血液、血清、血浆来自外周血或骨髓血。
本文使用的“组织裂解物”也可与“裂解物”、“裂解的样品”、“组织或细胞提取物”等用语通用，表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法，该过程被术语“裂解”包括。
在优选的实施方式中，出于检测便利性考虑，所述检测剂或试剂盒的检测对象为受试者的痰液。
本发明还提供一种检测碳青霉烯耐药基因的方法（可选非诊断目的），包括：
i) 获取待检测样本中的核酸；
ii) 使用如上所述的引物探针组合产品，或如上所述的试剂盒，以所述核酸为模板进行扩增以确定所述样本中是否存在碳青霉烯耐药基因blaKPC、blaNDM、blaOXA-48中的至少一种。
所述方法可用于耐药病原体的检验。检测样本典型的可以来自医院、学校等公共场所的环境样本。
检测优选可以通过多重荧光定量PCR反应进行。在一些实施方式中，多重荧光定量PCR反应中，每个引物终浓度为0.5μM，每个探针终浓度为0.3μM。
在一些实施方式中，通过分辨所述反应产物的荧光标记，确定其所述的荧光通道，并进一步确定其所对应的检测靶标。
在一些实施方式中，在样品检测的同时，进行阳性对照试验和阴性对照实验。
在一些实施方式中，所述方法用于临床中对疑似多重耐药菌感染的病人的诊断。检测的DNA样本优选如上文中所定义。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 单重荧光定量PCR检测碳青霉烯耐药3种耐药基因
1.荧光定量PCR引物组的制备
从GenBank获取对碳青霉烯耐药基因的3种基因的核酸序列，分别是blaKPC、blaNDM、blaOXA-48,进行同源性比对分析，确定各靶标的保守序列区域，然后在保守区域内选择合适的序列，采用Primer 3.0软件设计出3对特异的引物，3条探针。同时采用Primer3.0软件设计出内质控基因的1对引物和1条探针。
荧光定量PCR检测的对碳青霉烯耐药基因的3种基因以及内质控基因的引物对和探针序列如表1所示。
2. DNA参考品制备
根据不同基因靶标的保守序列区域，对4个基因(blaKPC、blaNDM、blaOXA-48、内质控基因)，以PUC57质粒为载体，选择多克隆位点EcoRV为插入点进行构建，将上述质粒分别构建到3个质粒和1个内源性对照质粒中；已知每个原始质粒的拷贝数（生工给出），参考品分别用灭菌的蒸馏水10倍梯度稀释，从108个copies/μL梯度稀释8个梯度。
3. 单重荧光定量PCR检测DNA耐药基因
执行单重荧光定量PCR检测3个DNA耐药基因和1个内质控，使用表1的DNA基因检测引物和探针。
表 1
单个基因检测反应体系：取5μL扩增子为模板(模板终浓度依次为5×104个copies/μL、5×103个copies/μL、5×102个copies/μL和5×101个copies/μL，加入2×扩增缓冲液12.5μL，一种基因引物探针组(引物终浓度为0.5μM，探针终浓度为0.3μM)，并补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积25μL。
3个耐药基因和1个内质控检测在上海宏石SLAN-96S实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃ 10分钟；95℃10秒，59℃30秒，72℃15秒，45个循环，59℃收集荧光（FAM、HEX、TexRed、Cy5）信号。
结果：单重荧光定量PCR（分子信标法）检测不同基因的扩增曲线如图1-图4所示。其中模板浓度分别为：5×103个copies/μL、5×102个copies/μL和5×101个copies/μL。图1-图4分别显示了KPC、NDM、OXA-48和内质控的检测结果。
实施例2优化后多重荧光定量PCR检测碳青霉烯耐药基因的检测
1. DNA参考品制备
以每个质粒参考品 5×105copies/μL为母液配置多重（3个基因和1个内质控）对照质粒混合参考品，其中每个质粒浓度为5×104copies/μL、5×103copies/μL、5×102copies/μL和5×101copies/μL，单个基因检测反应体系：取5μL扩增子为模板（模板浓度依次为5×104copies/μL、5×103copies/μL、5×102copies/μL和5×101copies/μL）。
2. 多重荧光定量PCR检测DNA耐药基因
对3个基因的3条探针进行混合；
使用表1中的DNA病原体检测引物和探针配置引物对组。
反应体系中加入DNA样本5μL，2×扩增缓冲液12.5μL以及引物组混合液7.5μL，其中每个引物浓度为0.5μM，每个探针浓度为0.3μM，并补充不含DNA酶/RNA 酶的水至总体积25μL。
3个耐药基因和1个内质控基因进行四重荧光定量PCR，检测需设置3个反应孔（复孔），检测在上海宏石SLAN-96S实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃ 10分钟；95℃10秒，59℃30秒，72℃15秒，45个循环，59℃收集荧光（FAM、HEX、TexRed）信号。
结果：多重荧光定量PCR（分子信标法）检测不同组基因的多组分扩增的线形图谱如图5所示，其中模板浓度为100个菌/mL。由图中可见，各组别中的基因扩增结果均为良好。本实施例证明，本发明构建的反应条件能够高效地同时对4种基因进行扩增。
实施例3 优化后多重荧光定量PCR检测碳青霉烯耐药基因灵敏性实验
为评价三重荧光定量PCR（分子信标法）的检测灵敏性，以浓度为5×105copies/μL的病原体质粒为母液，按照表1组合配制一组混合参考品，每组包含3种基因和内参，其中每个基因质粒浓度为5×104copies/μL，以灭菌的体外诊断试剂用水稀释至以下梯度浓度，作为灵敏性参考品：
5×103copies/μL灵敏度参考品；
5×102copies/μL灵敏度参考品；
5×101copies/μL灵敏度参考品；
结果：检测Ct值如表2所示。
表2目标病原体灵敏度检测结果
由检测结果可知，本发明引物及探针可在四重定量PCR反应中同时检测三种耐药基因和内质控。其中，对碳青霉烯耐药基因的blaKPC的检测限为46copies/μL，对碳青霉烯耐药基因blaNDM的检测限为55copies/μL，对碳青霉烯耐药基因blaOXA-48的检测限为13copies/μL，故将本试剂盒整体最低检测限整体定为5×101copies/μL。
本实施例表明，本发明的引物对和探针检测试剂对碳青霉烯耐药基因具有高度灵敏性。
实施例4优化后多重荧光定量PCR检测临床病原体特异性实验
特异性参考品制备：
为评价方法的检测特异性，将已经验证过的10种DNA提取物采用本发明的试剂盒进行检测。其中10种病原体分别为：碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌，碳青霉烯敏感大肠埃希菌，碳青霉烯敏感鲍曼不动杆菌，碳青霉烯敏感奇异变形杆菌，碳青霉烯敏感阴沟肠杆菌，碳青霉烯敏感产酸克雷伯菌，碳青霉烯敏感铜绿假单胞菌，碳青霉烯敏感粪肠球菌，碳青霉烯敏感克雷柠檬酸杆菌，碳青霉烯敏感弗式柠檬酸杆菌
结果：特异性检测结果如表3所示。对这10种病原体的检测结果均为阴性。
表3目标病原体特异性检测结果
由上述检测结果可知，用本发明的分子信标法对应靶标的引物对和探针检测试剂，对含有细菌的内源性对照16s RNA基因均可检测出，对不含检测靶标的样本基本均为无Ct值，证明其不易产生假阳性结果。
实施例5对100例临床样本进行检测，进一步验证本检测方法的准确性
如图 6所示，对100例临床样本进行检测，并且计算出该试剂盒的Cutoff值为34，即对阳性样本的检测结果的Ct值小于34，即为阳性，大于34或者没有Ct值即为阴性。
表4特异性数据
如图 6结果所示，本发明的引物对和探针检测试剂能够特异性检测对应的病原体标本，且对其他种类病原体不产生假阳性结果。证明本发明的引物和探针组合具有优秀的特异性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.引物探针组合产品，其特征在于，包括a)~c)：
a) 核苷酸序列为SEQ ID NO：1~2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
b) 核苷酸序列为SEQ ID NO：4~5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针；
c) 核苷酸序列为SEQ ID NO：7~8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针。
2. 根据权利要求1所述的引物探针组合产品，其特征在于，还包含d) 核苷酸序列为SEQ ID NO：10~11所示的引物以及SEQ ID NO：12所示的探针。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合产品，其特征在于，所述探针标记有可检测的信号物质。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合产品，其特征在于，所述探针为自身淬灭探针。
5. 根据权利要求4所述的引物探针组合产品，其特征在于，所述探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
6.根据权利要求5所述的引物探针组合产品，其特征在于，各探针的荧光发射基团所携带的荧光信号能够被区分。
7. 根据权利要求 4所述的引物探针组合产品，其特征在于，所述探针的淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
8.试剂盒，其特征在于，含有权利要求1~7任一项所述引物探针组合产品。
9.权利要求1~7任一项所述引物探针组合产品在制备用于碳青霉烯耐药基因检测的检测剂或试剂盒中的应用；
所述碳青霉烯耐药基因包括blaKPC、blaNDM、blaOXA-48中的至少一种。
10.一种检测碳青霉烯耐药基因的非诊断目的方法，其特征在于，包括：
i) 获取待检测样本中的核酸；
ii) 使用权利要求1~7任一项所述的引物探针组合产品，或权利要求 8所述的试剂盒，以所述核酸为模板进行扩增以确定所述样本中是否存在碳青霉烯耐药基因blaKPC、blaNDM、blaOXA-48中的至少一种。
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