CN102952875B

CN102952875B - 细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒

Info

Publication number: CN102952875B
Application number: CN201110254798.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡挺; 张春秀; 张顺; 陈金丝; 李巧云; 周佳菁; 肖华胜
Original assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd; SHANGHAI BIOTECHNOLOGY Corp; Ningbo No2 Hospital
Current assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd; SHANGHAI BIOTECHNOLOGY Corp; Ningbo No2 Hospital
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2031-08-31
Also published as: CN102952875A

Abstract

本发明公开了一种细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒。该试剂盒包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测探针。该基因芯片包括检测待测细菌耐药基因的探针。利用该试剂盒和基因芯片进行耐药基因检测的方法，包括步骤：1)利用试剂盒中的引物，PCR扩增待测样本DNA中的耐药基因；2)扩增产物与试剂盒中的检测探针进行荧光标记反应；3)荧光标记的扩增产物与基因芯片进行杂交，确定样本所含耐药基因。本发明的检测方法覆盖了临床最常见的16种耐药基因的检测，有助于实现临床细菌耐药情况的快速诊断，从而可以为临床合理选择治疗药物提供支持。

Description

细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种检测临床常见细菌耐药基因的方法。本发明还涉及用于该方法的试剂盒和基因芯片。

背景技术

全国细菌耐药监测网的统计显示，在耐药细菌中，革兰氏阴性菌占70％左右，其中以大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌为多，且多重耐药情况严重；革兰氏阳性菌占30％左右，其中，葡萄球菌属占到2/3，而金黄色葡萄球菌几乎占葡萄球菌属的一半，肠球菌属占革兰氏阳性菌的1/4左右，并以粪肠球菌和屎肠球菌为主。

随着感染性疾病的增多，第三代和第四代头孢菌素、碳青霉烯类以及氟喹诺酮类等超广谱抗菌药物被广泛使用，细菌的耐药情况变得日益严重，造成感染性疾病难以控制、易复发、术后感染率高、昂贵抗菌药物使用量增加等后果。耐药菌株还随着国际交流在全球范围蔓延。

传统的病原学诊断及其耐药性检测主要依赖于形态学、培养等方法，需要先从标本中培养分离到病原菌，然后测定细菌的药物敏感性，测定的方法主要包括定性测定的纸片扩散法、K-B法，定量测定的稀释法(如肉汤稀释法，琼脂稀释法)，E试验法以及全自动药敏仪法，这些方法的成本相对较低，但测定过程复杂，耗时长。目前，临床上也有应用全自动微生物鉴定及药敏分析系统来做耐药检测，但同样需要经历培养、分离提纯、鉴定三个步骤，最顺利的情况也需要72小时才能提供药敏结果，且难以对自身生长缓慢、生长条件苛刻的细菌进行检测。此外，血清免疫学方法也可用于细菌的耐药性检测，但其假阳性率和假阴性率高，重复性差，效能也不高。鉴于临床治疗的需要，医生往往先根据流行病学资料、临床症状、体征及影像学特征等，估计可能的病原体及药敏情况，经验性应用覆盖可能病原体的抗菌药物或者相对广谱的抗菌药物，待培养结果出来后，再对抗菌药物进行调整，这严重限制了临床医师为患者及时有效地选择敏感抗菌药物，尤其不利于重症感染性疾病的及时治疗，而且很可能存在抗生素滥用的问题，助长了耐药菌的产生。

通过检测细菌的耐药基因，实现临床上耐药菌的快速准确诊断，是目前临床微生物学的重要研究和发展方向，它对控制医院内感染和抢救重症感染病人具有重要的意义。

β-内酰胺酶的产生是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，数量超过200种，其中，超广谱β-内酰胺酶(ESBL)超过50种，遍布于世界各地。ESBLs的产生，是革兰氏阴性肠杆菌的主要耐药机制。在医院感染中，ESBLs所涉及的菌种，几乎涵盖了所有主要的革兰氏阴性杆菌。

质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)基因，包括qnr(quinolone resistance)、qepA(quinolone efflux protein A)和aac(6’)-Ib-cr等。质粒通过接合等方式，在细菌间传递耐药基因，造成耐药性的传播。基因aac(6’)-Ib的304位T突变为C或者A，或者535位G突变为T，导致102位色氨酸突变为精氨酸，179位天冬氨酸突变为酪氨酸，引起细菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性。

DNA回旋酶GyrA和拓扑异构酶ParC的突变是导致细菌对喹诺酮类耐药的重要机制，GyrA基因常见突变位点有83位丝氨酸(S83)突变为亮氨酸(L83)、87位天冬氨酸(D87)突变为天冬酰胺(N87)或者酪氨酸(Y87)；ParC常见突变位点有80位丝氨酸(S80)突变为异亮氨酸(I80)、84位谷氨酸(E84)突变为赖氨酸(K84)、甘氨酸(G84)或者缬氨酸(V84)。

mecA基因是MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)特有的耐药基因，其编码的PBP2a蛋白代替原来的青霉素结合蛋白PBP2，细菌细胞壁的合成不能被抑制，致使β-内酰胺类药物结合靶位缺失，从而形成耐药。检测mecA基因是被认为国内外判断MRSA的金标准。

氨基糖苷类修饰基因aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia的存在，是耐高浓度庆大霉素肠球菌(HLGR)的主要原因。

目前，临床微生物耐药基因的检测，基本以表型检测为主。由于耐药机制的多样性，某些耐药基因可能沉默表达，但潜在的耐药性是存在的，在合适的环境条件下，就会转变成耐药细菌，或者将耐药基因传播给其他细菌。PCR杂交分析是检测细菌耐药基因最常见的方法，然而，在众多的耐药基因中筛选某一种或者几种耐药基因，需要做大量的重复工作。

基因芯片技术，具有敏感性高、特异性强、快速、高通量等特性，与PCR杂交分析法相比，基因芯片可并行检测多种基因信息，实现大量重复工作的同步化，从而能提高检测效率。

针对细菌耐药基因的检测，国内外研究者尝试了不同检测范围的基因芯片。例如，JanWeile等开发了一种检测铜绿假单胞菌抗生素耐药性和毒力因子的基因芯片，整个过程在5个小时内完成，阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度分别为78％、91％、89％、83％(WeileJ et al.DNA microarray for genotyping multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosaclinical isolates[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2007，59(3)：325-338)。MirandaBatchelor等开发的革兰氏阴性杆菌耐药基因的微型芯片可以检测编码耐氨基糖苷类、甲氧苄啶、磺胺类、四环素和β-内酰胺类以及超广谱β-内酰胺酶的47个耐药基因(Batchelor Met al.Development of a miniaturised microarray-based assay for the rapididentification of antimicrobial resistance genes in Gram-negative bacteria[J].IntJ Antimicrob Agents，2008，31(5)：440-451)。Naas等设计的芯片能检测肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌中各型β-内酰胺酶类耐药基因，包括TEM、SHV、CTX-M、KPC等(Naas Tet al.Evaluation of a DNA microarray，the check-points ESBL/KPC array，for rapiddetection of TEM，SHV，and CTX-M extended-spectrum beta-lactamases and KPCcarbapenemases[J].Antimicrob Agents Chemother.2010，54(8)：3086-3092)。MarcoCassone等设计制作了覆盖8种细菌的65个大环内酯类耐药基因的芯片(Cassone M et al.DNA microarray for detection of macrolide resistance genes[J].Antimicrob.AgentsChemother，2006，50(6)：2038-2041)。

我国的基因芯片技术近年来也发展较快，例如，毛红菊等设计了可以检测超广谱β内酞胺酶类耐药基因中的SHV、CTX-M的几个亚型的基因芯片，该方法由标本处理到细菌鉴定及耐药谱检测，全程仅需6-8小时(毛红菊等.利用基因芯片快速检测多种临床常见致病菌及其耐药性基因[J].中华传染病杂志，2006，24(6)：372-377)。沈定霞等设计了检测大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌产生ESBLs和AmpC酶基因的基因芯片，并对上述三种菌株共225株进行检测，除部分表型AmpC酶阳性的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌外，该芯片对所有表型ESBLs阳性菌株均能检出；同时对CTX-M基因进行了分型(沈定霞等.基因芯片技术检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶基因[J].中国抗生素杂志，2007，32(12)：727-731)。王雅杰等设计的基因芯片，可以对常见革兰阳性细菌同步进行细菌鉴定和耐药性检测，灵敏度和特异度均较高(王雅杰等.常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用[J].首都医科大学学报，2007，28(2)：140-144)。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种细菌耐药基因检测试剂盒，它可以用于多种临床常见耐药细菌产生的耐药基因的同时检测。

为解决上述技术问题，本发明的细菌耐药基因检测试剂盒，包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测所述细菌耐药基因的探针；所述引物具有如SEQ ID No：1～32所示的序列或其互补链；所述探针具有如SEQ ID No：33～61所示的序列或其互补链。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种细菌耐药基因检测芯片。

为解决上述技术问题，本发明的用于细菌耐药基因检测的基因芯片，包括检测待测细菌耐药基因的探针，所述探针具有如SEQ ID No：33～61所示的序列或其互补链。

所述细菌耐药基因包括：OXA-23、IMP、VIM、aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia、CTX-M、KPC、CIT、mecA、TEM、SHV、DHA、qnrB、qnrS、aac(6’)-Ib、ParC和GyrA。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种利用上述细菌耐药基因检测试剂盒和基因芯片进行细菌耐药基因检测的方法。

为解决上述技术问题，本发明的细菌耐药基因检测方法，包括以下步骤：

1)利用所述试剂盒中的引物，对待测样本DNA中的耐药基因进行PCR扩增；

2)将步骤1)的产物与所述试剂盒中的检测细菌耐药基因的探针进行荧光标记反应；

3)将步骤2)的产物与所述芯片进行杂交反应，确定样本所含的耐药基因。

本发明的细菌耐药基因检测方法及检测芯片和试剂盒，覆盖了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌所产生的最常见的16种耐药基因的检测，且检测速度快，灵敏度和特异性高，从而有助于实现临床细菌感染的快速诊断和及时有效地用药，具有显著的临床实用价值。

附图说明

附图是用本发明的基因芯片对临床血液样本进行耐药基因检测得到的芯片扫描图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1利用本发明的试剂盒进行临床常见耐药细菌的耐药基因检测

1.检测目标及引物和探针的设计

本实施例的检测目标包括：革兰氏阳性球菌中的金黄色葡萄球菌和肠球菌的耐药基因，以及革兰氏阴性杆菌中的肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药基因。

所述耐药基因没有细菌种属特异性差异，包括TEM、SHV、CTX-M、DHA、CIT、IMP、VIM、KPC、OXA-23、qnrB、qnrS、mecA、aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia、aac(6’)-Ib、GyrA和ParC，其中，aac(6’)-Ib基因设计3个突变位点，分别为T304C、T304A、G535T；GyrA设计3个突变位点，分别为N87、Y87、L83；ParC设计4个突变位点，分别为I80、K84、G84、V84。

扩增上述耐药基因特异性片段的引物对，其正向引物和反向引物的序列长度为15～50个核苷酸，优选为15～25个核苷酸。引物的详细信息如表1所示：

表1本发明的细菌耐药基因检测试剂盒包括的引物

检测上述细菌耐药基因的特异探针，其序列长度为40～70个核苷酸，优选为45～60个核苷酸。探针的具体信息如表2所示：

表2本发明的细菌耐药基因检测试剂盒包括的特异探针

SEQ ID No	耐药基因	探针序列(5’-3’)
			33	OXA-23	AGTGGATCTTGTACGTGGACCGCAAGTTCCTGATAGACTGGGACTGC
34	aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia	GGAAGCAGTTGTCGTTAGCAATATGATGATAATGCCACAAATGTT
			35	IMP	AGACTCTCACTGCAAGCTGTAGCCACGTTCCACAAACCAAGTGACTA
36	VIM	TTGACGCTACAGGTGACGATACAATGAGACCATTGGACGGGTAG
			37	CTX-M	CCTGACTGCAATAGATCCTGACGGCCATCACTTTACTGGTGCTGC
38	KPC	CACTGAACAGCTGACATACG CGGGCCGCCCAACTCCTTCAGCAAC
			39	CIT	GCTACGATACTGCAGAACCTCTTCGGCGTCAAGTTGTCCCGGAGA
40	mecA	CGTATCGACTGCATCAATCCAGATGGCAAAGATATTCAACTAACT
			41	TEM	GTCAGCGAGAACATGTGTACGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCG
42	SHV	CGAATCAGTCTTGCTCATCGTGTCGCCCTGCTTGGCCCGGATAAC
			43	DHA	GTACACGATTCAGAGAGAGGCCGGGACGGCTGCCACTGCTGATAG
44	qnrB	ACTGTACCTTCGTGTGACTGCAGCTCGCACTTTTCCAGTACGACTTTTG
			45	qnrS	CAAGGAAACTCGACGTGGATATCCAGCGATTTTCAAACAACTCAC
46	aac(6’)-Ib-304T	TAGGCACAAACGTCACAGTCCCTGGATCGGTTTCTTCTTCCCACCA
			47	aac(6’)-Ib-304C	CTGCTTACCTCGAACATGCTCCTGGATCGGTTTCTTCTTCCCACCG
48	aac(6’)-Ib-304A	CAACGCACTGACCATACCTACCTGGATCGGTTTCTTCTTCCCACCT
			49	aac(6’)-Ib-535G	CATGAACTGCTACACCGATCAGAGGCAAGGTACCGTAACCACCCCAG
50	aac(6’)-Ib-535T	GAGAACAGCAGATACATCGCAGAGGCAAGGTACCGTAACCACCCCAT
			51	ParC-S80	CCTCACGAGCTGTTACATTGGGTAAATACCATCCGCACGGCGATAG
52	ParC-I80	CGTAGAGCAACCATTCCAACGGTAAATACCATCCGCACGGCGATAT
			53	ParC-E84	ACCACATGTAGCTTGACGAGGCGCCATCAGGACCATCGCTTC

54	ParC-K84	TTACGACGCATCTCAAGCACGCGCCATCAGGACCATCGCTTTT
			55	ParC-G84	CGTCAGTCATTCGTGTCAAGTGCGCCATCAGGACCATCGCTC
56	ParC-V84	GATACCGATTTGGACGCACATGCGCCATCAGGACCATCGCTA
			57	GyrA-D87	ACCTGCGAATGTCCATAACGCGCCATGCGGACGATCGTGTC
58	GyrA-N87	TGCACCTCTAAGAACTGACGCGCCATGCGGACGATCGTGTT
			59	GyrA-Y87	CAGTCGCACCGTTCAAGTTTCGCCATGCGGACGATCGTGTA
60	GyrA-S83	GGTCAGTCATACGAACAGCATCGGTAAATACCATCCCCATGGTGACTC
			61	GyrA-L83	CACGTGACGACTACTGTTGATCGGTAAATACCATCCCCATGGTGACTT

上述引物和探针由英潍捷基(上海)贸易公司合成。

2.细菌耐药基因检测芯片的制作

芯片为玻璃或其他类似的固相基质材料，针对细菌各耐药基因的特异性寡核苷酸探针固定在固相载体上，芯片的阵列排布如表3所示：

表3本发明的检测细菌耐药基因的基因芯片的阵列排布表

注：表3中，P为人工合成的阳性对照探针，序列为：5’-GATTATCGCGTACTAGTATTC-3’(SEQ ID No：62)；N为人工合成的阴性对照探针，序列为：5’-CTCTCTACGGTATCGAACAAC-3’(SEQ ID No：63)；B为空白对照点；…为预留位置。

将表2中的探针配置成30～80μmol/L的使用浓度，采用OmniGridTM 100microarrayer(GeneMachine，USA)芯片点样仪，按照图3的样式点样。每张芯片设置十个反应区域，每个反应区域设置3次重复。

3.临床血液样本检测

3.1抽提样本DNA

采集临床患者的血液样本，用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒或其他商业化DNA提取试剂盒提取样本DNA，并测定OD260和OD280的值，以确定样本DNA浓度和质量。

OD260/OD280的比值应在1.7～1.9之间。

调整样本DNA浓度至5～20ng/μL。

3.2多重PCR反应和荧光标记反应

多重PCR反应和荧光标记反应分三组进行：表1中，SEQ ID No：1～12的引物(相应的探针为SEQ ID No：33～38)为第1组，SEQ ID No：13～26的引物(相应的探针为SEQ ID No：39～45)为第2组，SEQ ID No：27～32的引物(相应的探针为SEQ ID No：46～61)为第3组。

3.2.1多重PCR反应

使用表1的引物对和表2的探针，对每个样本进行三组多重PCR反应。

PCR反应体系为：10×TITANIUM^TM Taq PCR缓冲液1.5μL，10mM TITANIUM^TM dNTP混合液0.1～0.4μL，引物混合物(不等比混合)0.8～1.2μL，TITANIUM^TM Taq DNA聚合酶0.1～0.4μL，样本DNA 0.8～2μL，加灭菌蒸馏水补充至15μL。

PCR反应条件为：95℃，5分钟；95℃，30秒，68℃，30秒，共30个循环；68℃，3分钟。

反应产物可直接用于进行下一步操作，亦可在4℃下保存不超过2天。

3.2.2PCR产物的纯化

用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱酶)和ExoI(exonuclease I，外切酶)对多重PCR产物进行纯化。

具体操作为：取3～5μL PCR产物，加入0.6～1.2μL SAP和0.6～1.5μL ExoI，37℃温育30分钟，再在85℃温育10分钟。

3.2.3荧光标记反应

荧光标记反应的总体积为15μL。

反应体系为：纯化产物2～5μL，10×Buffer 1.2～1.8μL，5U/μL Sequenase DNA聚合酶0.1～0.3μL，20μM探针混合物(不等比例混合)0.1～0.5μL，100mM Cy3-ddNTP 0.1～0.5μL。

反应条件为：95℃，5分钟；95℃，30秒，65℃，30秒，72℃，20秒，共40个循环；72℃，5分钟。

3.3基因芯片预处理

将芯片预处理液均匀加到前述点制好的基因芯片的点样区域，室温反应30分钟。

芯片预处理液的配制为：20×SSC 50～125μL，100×BSA 50～150μL，10％SDS 12.5～37.5μL，加ddH₂O补充至1000μL，混合均匀，于-20℃保存。

3.4荧光标记的多重PCR产物与芯片的杂交反应

将三组荧光标记的多重PCR反应产物混合均匀后，取15～25μL，和20×SSPE 6～15μL及20nmol/L阳性质控(即上述阳性对照探针的互补序列)0.1～0.4μL混合均匀，用灭菌水补充至30～40μL，在95℃下加热5分钟，冰上骤冷，然后与前述经过预处理的耐药基因检测芯片在48℃下杂交反应2小时。杂交结束后，依次用洗液A(2×SSC，1％SDS)、B(1×SSC，0.5％SDS)、C(1×SSC)、D(灭菌水)洗涤基因芯片，最后离心甩干。

3.5芯片扫描和结果分析

用芯片扫描仪(GenePix 4000B)扫描芯片，获取杂交结果。通过GenePix Pro 6.0软件分析荧光信号的强度，得出该样本中所含有的细菌耐药基因。

如图1所示，图中每个区域的三次重复检测结果一致，可见重复性好。进一步分析可以得出，该临床样本中含有CTX-M、KPC、CIT、TEM、SHV、DHA共计6个耐药基因。

Claims

1.一种细菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于：包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测所述细菌耐药基因的探针；所述引物的序列如SEQ ID No:1～32所示；所述探针的序列如SEQ ID No:33～61所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述耐药基因为OXA-23、IMP、VIM、aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia、CTX-M、KPC、CIT、mecA、TEM、SHV、DHA、qnrB、qnrS、aac(6’)-Ib、ParC和GyrA。

3.一种用于细菌耐药基因检测的基因芯片，其特征在于：包括检测待测细菌耐药基因的探针，所述探针的序列如SEQ ID No:33～61所示。

4.利用权利要求1或2所述的细菌耐药基因检测试剂盒和权利要求3所述的用于细菌耐药基因检测的基因芯片进行非诊断目的的细菌耐药基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3)将步骤2)的产物与所述基因芯片进行杂交反应，确定样本所含的耐药基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：10×PCR缓冲液1.0～2.0μL，10mM dNTP混合液0.1～0.4μL，引物混合物0.8～1.2μL，DNA聚合酶0.1～0.4μL，样本DNA0.8～2μL，加灭菌蒸馏水补充至15μL。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述PCR的反应条件为：95℃，5分钟；95℃，30秒，68℃，30秒，共30个循环；68℃，3分钟。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光标记反应的反应体系为：扩增产物2～5μL，10×Buffer1.2～1.8μL，5U/μL Sequenase DNA聚合酶0.1～0.3μL，20μM探针混合物0.1～0.5μL，100mM Cy3-ddNTP0.1～0.5μL。

8.根据权利要求4或7所述的方法，其特征在于，所述荧光标记反应的反应条件为：95℃，5分钟；95℃，30秒，65℃，30秒，72℃，20秒，共40个循环；72℃，5分钟。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述杂交反应的反应体系为：荧光标记的扩增产物15～25μL，20×SSPE6～15μL，20nmol/L阳性质控0.1～0.4μL，混合均匀，用灭菌水补充至30～40μL；反应条件为：在95℃下加热5分钟，冰上骤冷，然后与所述基因芯片在48℃下杂交反应2小时。