CN107475364A

CN107475364A - 耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN107475364A
Application number: CN201710525140.4A
Authority: CN
Inventors: 苏海峰; 高亚平; 屈彬彬; 吴国君
Original assignee: BEIJING BAIKANGXIN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Baikangxin (Tianjin) Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2017-12-15

Abstract

本发明基于微流控芯片技术，结合核酸等温扩增技术提供了一种耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒及检测方法。属于耐药基因安全快速检测领域。本技术通过将样品快速处理后，与试剂盒中试剂混合。混合液加入到微流控芯片中。预先加载在微流控芯片中的引物与混合液中可能存在的耐药基因模板在特定的单一温度下，发生核酸等温扩增反应。反应体系中的荧光染料与扩增产物结合产生荧光信号。通过仪器判读确定致病菌是否含有此十三种耐药基因。本方法采用微流控芯片技术减少了对样品量的需求，增加了检测通量，可同时检测多种耐药基因。使用核酸等温扩增技术，增加检测特异性和敏感性；操作简单，反应时间短。为临床提供一种简单迅速的耐药致病菌检测技术。

Description

耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒及检测方法

技术领域

本技术属于耐药致病菌快速检测领域。涉及微流控芯片快速检测技术，提供了一种耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒及检测方法，所述耐药基因涉及IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA特定基因保守序列具有的特异性引物和引物组；还涉及将引物和引物组用于等温扩增法检测IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

抗生素自1943年应用于临床，便成为我们治疗致病菌感染不可或缺的临床药物。最初在应对致病菌感染中抗生素是一种绝佳的药物。但在近些年，抗生素对致病菌的治疗效果越来越差，此类药物虽然在不断的更新迭代，更有诸多广谱抗生素推出市场，但是细菌的耐药性仍然是医学界的一个难题。人体被致病菌感染后，医生如果不能使用正确的抗生素进行治疗，不仅花费了大量的治疗费用，且不能达到治疗的目的，还有可能杀死身体中的益生菌，使得部分条件致病菌产生致病性，甚至形成“超级细菌”。超级细菌为多重耐药菌，对多种抗生素都有耐药性，对许多新型广谱抗生素也耐药。细菌的耐药性越强对病人的威胁就越大。

MRSA菌是一种“超级细菌”，从外界获得mecA被认为是其青霉素耐药的关键。mecA基因编码的青霉素结合蛋白PBP2a对β-内酰胺类抗生素具有较低亲和力，从而使MRSA对甲氧西林耐药。1961年首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，之后在世界各地都相继报道了MRSA感染的病例。流行病学调查显示2004年MRSA在美国大部分医院感染率都超过50％，而2005年又增长了30％。在我国，上世纪七十年代报道MRSA感染以来，呈逐年快速上升趋势，2008年MRSA全国发生率为67.6％，个别地区达到80％以上。

传统病原菌耐药检测是通过培养法，需要一个3-5天的培养周期，然后再通过纸片扩散法、K-B法、定量测定稀释法来分析药物的耐药性，此过程检验周期长，需要专业的生物学人员操作。由于细菌可能在培养过程中产生耐药，容易出现假阳性。对于患者而言，检测周期的时间长短意味着能否得到及时治疗或减少并发症的发生。所以，在当前医疗卫生重心转移的大背景下，在临床上尤其是基层医疗机构对快速准确，操作简单，实验环境要求低的诊断产品具有迫切需求。

其中，现有技术CN102952875A提供了一种细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒。该试剂盒包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测探针。该基因芯片包括检测待测细菌耐药基因的探针。利用该试剂盒和基因芯片进行耐药基因检测的方法，包括步骤：1)利用试剂盒中的引物，PCR扩增待测样本DNA中的耐药基因；2)扩增产物与试剂盒中的检测探针进行荧光标记反应；3)荧光标记的扩增产物与基因芯片进行杂交，确定样本所含耐药基因。该方法包括核酸提取、多重PCR和荧光标记反应、基因芯片预处理、荧光标记的多重PCR产物与芯片的杂交反应、芯片扫描和结果分析五个步骤操作复杂。且每个步骤都需要诸多的仪器和苛刻的实验环境，很容易遭成扩增产物污染，出现结果假阳性。另外与科研单位相比医院检验科实验用仪器较少，尤其是区域型小医院没有经费及条件购置多通道PCR仪，且该方案中原材料包括探针，探针的成本较高将导致产品售价过高，超出部分患者接受范围不利于该试剂盒推广。

现有技术CN104313166A一种铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，所述铜绿假单胞菌多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因，试剂盒包括核酸扩增组份和杂交组份；核酸扩增组份具体包括：预混液、引物混合液、聚合酶、阳性质控品、阴性质控品；杂交组份具体包括：微球杂交液、质控微球和链霉亲和素-藻红蛋白。该方案中的探针及微球都是价格较贵的原料，荧光定量PCR仪的价格较高，需要经培训的专业人士操作，部分医院更没有相关仪器，另外该方法PCR过程中设计较多升降温过程，使得整个实验时间周期较长。

本发明所开发的耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒(恒温扩增芯片法)，结合了恒温扩增技术，实时荧光技术和微流控芯片技术，对下待检耐药样本中的核酸进行检测，特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的一个目的在于一种耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒，所述试剂盒为对以下十三组耐药基因中的十三组、任十二组、任十一组、任十组、任九组、任八组、任七组、任六组、任五组、任四组、任三组、任两组或任一组：IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA进行检测的试剂盒，所述试剂盒包括：以耐药基因IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA特异性基因为模板设计的特异性引物组、检测芯片、核酸扩增反应液、阳性模板。

所述引物组由IMP基因5个引物、OXA-51基因5个引物、KPC基因4个引物、SIM基因5个引物、VIM基因5个引物、OXA-58基因6个引物、OXA-48基因5个引物、OPrD2基因6个引物、NDM基因5个引物、OXA-23基因5个引物、van-A基因5个引物、van-B基因5个引物mecA基因6个引物组成。

所提供的IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA十三种耐药基因特异性片段检测用引物组，能扩增靶基因特异碱基序列，所述靶基因分别为：IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA为所述引物与所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链。

所述引物组包含：

一种IMP耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种OXA-51耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种KPC耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种SIM耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种VIM耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种OXA-58耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种OXA-48耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种OPrD2耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种NDM耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种OXA-23耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种van-A耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种van-B耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

一种mecA耐药基因检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：

本发明前述每组引物都经多次筛选，最终引物为扩增效率高，特异性好的引物序列。

本发明的另一个目的在于一种耐药基因微流控芯片快速检测芯片，提供针对IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA特异性基因片段的检测方法的专用微流控芯片。

所述专用微流控芯片，其特征在于微流控芯片上固定有上述引物组中的十三组、任十二组、任十一组、任十组、任九组、任八组、任七组、任六组、任五组、任四组、任三组、任两组或任一组及阳性质控品和阴性质控品组成的阵列。

所述检测方法是指基于核酸等温扩增法检测IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA的检测方法。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

本发明所提供的检测IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA的方法，是通过针对上述十三种耐药基因特定基因片段设计引物，并利用核酸等温扩增技术，以微流控芯片为载体，在恒温平台上进行扩增，并根据EvaGreen荧光染料进行结果判读。

本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述不同引物组基于核酸等温扩增技术检测IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA的检测试剂盒。其特征在于，所述试剂盒至少包括含有扩增反应液及上述固定有上述引物组的基因芯片。

所述扩增反应液中包括如下试剂：

表1扩增反应液具体组分及浓度

所述组分中每微升含8-16个活性单位的Bst DNA聚合酶。

所述试剂盒还包括阴性及阳性质控模板，所述阴性质控模板为TE缓冲液；所述阳性质控模板为酵母菌基因组DNA(1100nM)。

本发明再一目的在提供所述耐药基因的检测试剂盒的检测方法，该方法具体步骤为：

1)样品处理和模板提取，样品范围适用于耐药致病菌样品标本；取1mL待检菌液加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL超纯水，12000rpm离心2min后，弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200μL超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心，取上清做待检模板

2)固定引物，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，将混合后的引物固定在芯片上。

3)阳性质控品，取0.159μL1％固定液，0.545μL1×10⁵酵母DNA和0.296μl引物混合之后，点在相应位置

4)IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA的核酸等温扩增

取48μL扩增反应液与12μL超纯水，加入60μL待检模板，形成如下总体积为120μL的反应体系

表2反应体系中具体组分及浓度(反应总体积120μL)

振荡混匀后离心，将反应液注入芯片，转至iChip-400仪器(iChip-400仪器为本公司自主研发的等温荧光检测系统，包括软件和硬件两部分)中，温度65℃进行反应，时间60min。

5)等温核酸扩增反应产物的检测

检测：与阴性质控孔比较，检测孔在iChip400设备上有S形曲线判定为阳性。在iChip400设备上未见S形曲线为阴性。

本发明相对于现有技术的有益效果，包括：

通过提供十三种针对IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA特定基因片段具有特异性的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA进行检测。

本发明提供的检测试剂和检测方法可检出1×10^-3CFU/μL的耐药菌、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决携带耐药基因的病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小，该试剂盒仅需要48μL扩增反应液便可以同时对11中耐药基因进行检测、污染小，该实验全称为闭盖氏反应，且体系中含有UNG酶，减少了污染的可能、成本低、且便携等诸多优点。

附图说明

图1为基因芯片排布示意图①为透气孔，②为加样孔，③为反应池

图2为用图1所示的基因芯片对IMP基因进行实际检测结果

图3为用图1所示的基因芯片OXA-51基因进行实际检测结果

图4为用图1所示的基因芯片对KPC基因进行实际检测结果

图5为用图1所示的基因芯片对SIM基因进行实际检测结果

图6为用图1所示的基因芯片对VIM基因进行实际检测结果

图7为用图1所示的基因芯片对OXA-58基因进行实际检测结果

图8为用图1所示的基因芯片对OXA-48基因进行实际检测结果

图9为用图1所示的基因芯片对OPrD2基因进行实际检测结果

图10为用图1所示的基因芯片对NDM基因进行实际检测结果

图11为用图1所示的基因芯片对OXA-23基因进行实际检测结果

图12为用图1所示的基因芯片对van-A基因进行实际检测结果

图13为用图1所示的基因芯片对van-B基因进行实际检测结果

图14为用图1所示的基因芯片对mecA基因进行实际检测结果

图中下方曲线为质控线，用于质控芯片和仪器，上方曲线为检测指标的扩增线；横坐标单位是分钟(min)纵坐标没有单位；1-10通道和“+”、“-”含义如下：

1为阳性质控，2为IMP耐药基因检测指标，3为OXA-51耐药基因检测指标，4为KPC耐药基因检测指标，5为阴性质控，6为阴性质控，7为SIM耐药基因检测指标，8为VIM耐药基因检测指标，9为OXA-58耐药基因检测指标，11为OPrD2耐药基因检测指标，12为NDM耐药基因检测指标，13为阴性质控，14为阴性质控，15为OXA-23耐药基因检测指标，16为vanA耐药基因检测指标，17为vanB耐药基因检测指标，18为mecA耐药基因检测指标；“+”代表相应指标检出“-”代表相应指标未检出。

具体实施方式

下面通过实施例和附图解释说明本发明的耐药基因的检测试剂盒及检测方法具体的IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA检测过程通过基因芯片来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一耐药基因的检测试剂盒及检测方法

1引物制备

通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA特异性基因的核酸片段设计出引物并合成，得到如下的引物：

耐药基因IMP

序列编号1

正向外引物F3GCAGAGTCTTTGCCAGCG

序列编号2

反向外引物B3GTCGCTCGGAAACGGAGAGG

序列编号3

正向内引物FIP CCGGTTTAGGAACAACGCCCCTGAAAAGCTTGCGGAAGGC

序列编号4

反向内引物BIP TGACACTCCCGTTACGGCTAAAGTTCGAGCCACGCTCCACA

序列编号5

正向环引物LF ACCCGTTAACTTCTTCAAACGAAG

耐药基因OXA-51

序列编号6

正向外引物F3GCGCTTGCTCGTGCTTCG

序列编号7

反向外引物B3AAACCGGACGAGCGGAAG

序列编号8

正向内引物FIP TGCCTTCGGGTGCTCAAGGCCGGTACCTGCTTCGACCT

序列编号9

反向内引物BIP AGTGGGACGGGCAAAAAAGGCGAGCCGCGCCTAGGGTC

序列编号10

正向环引物LF TCCCAGACGGGGAAAAGGACCG

耐药基因KPC

序列编号11

正向外引物F3GGCAGCAGTTTGTTGCGTGG

序列编号12

反向外引物B3CGCTGTGCTTGTCCGCCT

序列编号13

正向内引物FIP GGTTTTGTCTCCGACTGCCCACTAAAGGGAAACACGACCGG

序列编号14

反向内引物BIP TGGCACGGCAACGGACTCGGCCGACGGCCAACACACGAGGTG

耐药基因SIM

序列编号15

正向外引物F3GCTAGTAAACTGGCTCGAA

序列编号16

反向外引物B3GACCAACCAAAAGCTCTCT

序列编号17

正向内引物FIP CCACTCTCGCCCAGCAGTACTGTCACTGTCACGGGAAGCCGT

序列编号18

反向内引物BIP AAGTCCCGCCCCACCGCGGCAAAAAGAGTGCTTGGCTTGA

序列编号19

正向环引物LF TCGTCGTGGAACGGTGTTGA

耐药基因VIM

序列编号20

正向外引物F3GCTAGTAAACTGGCTCGAA

序列编号21

反向外引物B3GACCAACCAAAAGCTCTCT

序列编号22

正向内引物FIP AAGCAGAGGTCGTCCGTCCCGTGTGTGCTGGAGCAAGTCT

序列编号23

反向内引物BIP GCCCGTCAGCCAGCGCGGCCGGGTTGTGCCGTTCCGGAGTT

序列编号24

正向环引物LF TTCCCCGCAGACGTGCTTG

耐药基因OXA-58

序列编号25

正向外引物F3TGCAACGTATTGGTTATGGC

序列编号26

反向外引物B3CAACAAAACCCACATACCAACC

序列编号27

正向内引物FIP AGGCAATTGCCCTTGGGCTAGCAAATAGGCACGGAAGTTG

序列编号28

反向内引物BIP AGAGCGCAGAGGGGAGAATCCACTTGCGGGTCTACAGC

序列编号29

正向环引物LF GAAAGGGCCTTTGACAATTACACC

序列编号30

反向环引物LB ATGCTAAAAGTGGCTGGGGAAT

耐药基因OXA-48

序列编号31

正向外引物F3GCGTCGCGGACGGCCTGCG

序列编号32

反向外引物B3TGTTCCGCCTTAACCACGC

序列编号33

正向内引物FIP GCACAACTACGCCCTGTGCGTTCGGTAGCAAAGGACGGGCAAGA

序列编号34

反向内引物BIP TAAACGGGCGAACCAAGCCGGGCGCGCAAGCTCGTGGGA

序列编号35

正向环引物LF GTTCAGTAAAGTGAGCCGTCCAAC

耐药因OPRD2

序列编号36

正向外引物F3TTGCACTGGCGTATTCC

序列编号37

反向外引物B3GCCGGATTCATAGGTAGTG

序列编号38

正向内引物FIP ATGAACCCCTTCGCTTGGGCCAGGTAGCACTCAGTTCGC

序列编号39

反向内引物BIP CCTGCTGCTCCGCAACTACTATAGGAAGCCTTGGGTCCA

序列编号40

正向环引物LF TCAACCGTTACGGCAAGA

序列编号41

反向环引物LB TGATCGCTGACGAATGCGT

耐药基因NDM

序列编号42

正向外引物F3TTGCACTGGCGGTTTCC

序列编号43

反向外引物B3GCCGGCGTCCGAGGTGGTG

序列编号44

正向内引物FIP CGGAACCCCTTCGCTTCGGCCAGGTAGCACTCAGTTCGC

序列编号45

反向内引物BIP CCTGCTGCTCCGCAACTACTCGAGGAAGCCTTGGGTCCA

序列编号46

正向环引物LF TCAACCGTGACGGCAAGA

耐药基因OXA-23

序列编号47

正向外引物F3CAGACGCGGTGCCAGCCTCT

序列编号48

反向外引物B3CGCGACGTCGCGCAAGTT

序列编号49

正向内引物FIP TGACCTTTTCTCGCCCTTCCCGGTTGACGGCCCTGCGCGGA

序列编号50

反向内引物BIP CCGCTTGGGAAAAAGACCGGACACCCTGCGAGACTGGGACTGC

序列编号51

正向环引物LF AGGAGAAGCCCGGAAGCTTTC

耐药基因van-A

序列编号52

正向外引物F3CCGGAAAAAGGCTCTGAA

序列编号53

反向外引物B3GACTGTATGACGTGAAACCG

序列编号54

正向内引物FIP TGCCGTTTCCTGTATCCGTC-GTTATAACCGTTCCCGCAG

序列编号55

反向内引物BIP GGTCTAGCCCGTGTGGATATG-GGCAGAGTATTGACTTCGT

序列编号56

正向环引物LF TCGCTCCTCTGCTGAAAGGT

耐药基因van-B

序列编号57

正向外引物F3GCAAGAAGCCATGTACGGA

序列编号58

反向外引物B3CCACATAGGGGATACCAGAC

序列编号59

正向内引物FIP AGCAGCCCATGCGTTTTCCTATGGGAAGCCGACAGTCT

序列编号60

反向内引物BIP CACGGCGTATTGATGTGGCTTACAAACAGCCCCTGTATCG

序列编号61

正向环引物LB GGCAAATGCGGGGAGGAT

耐药基因mecA

序列编号62

正向外引物F3TTATGTATCAGGTACTTAT

序列编号63

反向外引物B3TTTTGTTATTTAACCCAATCATTTA

序列编号64

正向内引物FIP ATTCTTCGTTACTCATTACATACATGTGAATTATTATAACTTGTAATAAC

序列编号65

反向内引物BIP AACCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGAATATTTTTTGAGTTGAACCTGGTG

序列编号66

正向环引物LF AATGGATAGACGTCATATGAAGGT

序列编号67

反向环引物LB CTCAACAAGTTCCAGATTACAACTT

2基因芯片制备

芯片是由IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA所对应十三组引物，PC(阳性质控品)、NC(阴性质控品)组成的阵列。

耐药基因IMP，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因OXA-51，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因KPC，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因SIM，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因VIM，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因OXA-58，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因OXA-48，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因OPrD2，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因NDM，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因OXA-23，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因van-A，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因van-B，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

耐药基因mecA，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，点在相应位置，自然晾干。

阳性质控品，取0.159μL1％固定液，0.545μl1×10⁵酵母DNA和0.296μl引物混合之后，点在相应位置，自然晾干。

3IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA基因组。

4上述IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA十三种耐药基因提取：

取1mL待检菌液加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL超纯水，12000rpm离心2min后，弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200μL超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。

5基于等温核酸扩增法的基因扩增

取扩增反应液48μL和水12μL，加入60μL待检模板，形成如下表总体积为120μL的反应体系，反应体系如下：(反应总体积为120μL)

表3反应体系中各组分及浓度

在温度为37℃预热3min后，65℃的iChip-400上反应60分钟。

6扩增产物的检测

与阴性质控孔比较，检测孔在iChip-400设备上有S形曲线判定为阳性。在iChip-400设备上未见S形曲线为阴性。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超过权利要求所记载的技术方案前提下，还有其他变体或改型。

<130> 2017

<160> 67

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<400> 1

gcagagtctt tgccagcg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<400> 2

gtcgctcgga aacggagagg 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<400> 3

ccggtttagg aacaacgccc ctgaaaagct tgcggaaggc 40

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<400> 4

tgacactccc gttacggcta aagttcgagc cacgctccac a 41

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<400> 5

acccgttaac ttcttcaaac gaag 24

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<400> 6

gcgcttgctc gtgcttcg 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<400> 7

aaaccggacg agcggaag 18

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<400> 8

tgccttcggg tgctcaaggc cggtacctgc ttcgacct 38

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<400> 9

agtgggacgg gcaaaaaagg cgagccgcgc ctagggtc 38

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<400> 10

tcccagacgg ggaaaaggac cg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<400> 11

ggcagcagtt tgttgcgtgg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<400> 12

cgctgtgctt gtccgcct 18

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<400> 13

ggttttgtct ccgactgccc actaaaggga aacacgaccg g 41

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<400> 14

tggcacggca acggactcgg ccgacggcca acacacgagg tg 42

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<400> 15

gctagtaaac tggctcgaa 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<400> 16

gaccaaccaa aagctctct 19

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<400> 17

ccactctcgc ccagcagtac tgtcactgtc acgggaagcc gt 42

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<400> 18

aagtcccgcc ccaccgcggc aaaaagagtg cttggcttga 40

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<400> 19

tcgtcgtgga acggtgttga 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<400> 20

gctagtaaac tggctcgaa 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<400> 21

gaccaaccaa aagctctct 19

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<400> 22

aagcagaggt cgtccgtccc gtgtgtgctg gagcaagtct 40

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<400> 23

gcccgtcagc cagcgcggcc gggttgtgcc gttccggagt t 41

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<400> 24

ttccccgcag acgtgcttg 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<400> 25

tgcaacgtat tggttatggc 20

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<400> 26

caacaaaacc cacataccaa cc 22

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<400> 27

aggcaattgc ccttgggcta gcaaataggc acggaagttg 40

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<400> 28

agagcgcaga ggggagaatc cacttgcggg tctacagc 38

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<400> 29

gaaagggcct ttgacaatta cacc 24

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<400> 30

atgctaaaag tggctgggga at 22

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<400> 31

gcgtcgcgga cggcctgcg 19

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<400> 32

tgttccgcct taaccacgc 19

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<400> 33

gcacaactac gccctgtgcg ttcggtagca aaggacgggc aaga 44

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<400> 34

taaacgggcg aaccaagccg ggcgcgcaag ctcgtggga 39

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<400> 35

gttcagtaaa gtgagccgtc caac 24

<210> 36

<211> 17

<212> DNA

<400> 36

ttgcactggc gtattcc 17

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<400> 37

gccggattca taggtagtg 19

<210> 38

<211> 39

<212> DNA

<400> 38

atgaacccct tcgcttgggc caggtagcac tcagttcgc 39

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<400> 39

cctgctgctc cgcaactact ataggaagcc ttgggtcca 39

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<400> 40

tcaaccgtta cggcaaga 18

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<400> 41

tgatcgctga cgaatgcgt 19

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<400> 42

ttgcactggc ggtttcc 17

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<400> 43

gccggcgtcc gaggtggtg 19

<210> 44

<211> 39

<212> DNA

<400> 44

cggaacccct tcgcttcggc caggtagcac tcagttcgc 39

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<400> 45

cctgctgctc cgcaactact cgaggaagcc ttgggtcca 39

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<400> 46

tcaaccgtga cggcaaga 18

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<400> 47

cagacgcggt gccagcctct 20

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<400> 48

cgcgacgtcg cgcaagtt 18

<210> 49

<211> 41

<212> DNA

<400> 49

tgaccttttc tcgcccttcc cggttgacgg ccctgcgcgg a 41

<210> 50

<211> 43

<212> DNA

<400> 50

ccgcttggga aaaagaccgg acaccctgcg agactgggac tgc 43

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<400> 51

aggagaagcc cggaagcttt c 21

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<400> 52

ccggaaaaag gctctgaa 18

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<400> 53

gactgtatga cgtgaaaccg 20

<210> 54

<211> 39

<212> DNA

<400> 54

tgccgtttcc tgtatccgtc gttataaccg ttcccgcag 39

<210> 55

<211> 40

<212> DNA

<400> 55

ggtctagccc gtgtggatat gggcagagta ttgacttcgt 40

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<400> 56

tcgctcctct gctgaaaggt 20

<210> 57

<211> 19

<212> DNA

<400> 57

gcaagaagcc atgtacgga 19

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<400> 58

ccacataggg gataccagac 20

<210> 59

<211> 38

<212> DNA

<400> 59

agcagcccat gcgttttcct atgggaagcc gacagtct 38

<210> 60

<211> 40

<212> DNA

<400> 60

cacggcgtat tgatgtggct tacaaacagc ccctgtatcg 40

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<400> 61

ggcaaatgcg gggaggat 18

<210> 62

<211> 19

<212> DNA

<400> 62

ttatgtatca ggtacttat 19

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<400> 63

ttttgttatt taacccaatc attta 25

<210> 64

<211> 50

<212> DNA

<400> 64

attcttcgtt actcattaca tacatgtgaa ttattataac ttgtaataac 50

<210> 65

<211> 50

<212> DNA

<400> 65

aaccgaagat aaaaaagaac ctctgaatat tttttgagtt gaacctggtg 50

<210> 66

<211> 24

<212> DNA

<400> 66

aatggataga cgtcatatga aggt 24

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<400> 67

ctcaacaagt tccagattac aactt 25

Claims

1.一种耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为对以下十三组耐药基因中的十三组、任十二组、任十一组、任十组、任九组、任八组、任七组、任六组、任五组、任四组、任三组、任两组或任一组：IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA进行检测的试剂盒，所述试剂盒包括：以耐药基因IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA特异性基因为模板设计的特异性引物组、检测芯片、核酸扩增反应液、阳性模板。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组由IMP基因5个引物、OXA-51基因5个引物、KPC基因4个引物、SIM基因5个引物、VIM基因5个引物、OXA-58基因6个引物、OXA-48基因5个引物、OPrD2基因6个引物、NDM基因5个引物、OXA-23基因5个引物、van-A基因5个引物、van-B基因5个引物和mecA基因6个引物组成。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组由耐药基因IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA进行检测的引物序列，所述引物具体为：

一种SIM耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种VIM耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种OXA-58耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种OXA-48耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种OPrD2耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种NDM耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种OXA-23耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种van-A耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种van-B耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

一种mecA耐药基因检测用引物组，所述引物组由下列引物组成：

4.如权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为核酸扩增专用引物。

5.一种耐药基因微流控芯片快速检测芯片，其特征在于，所述检测芯片为微流控芯片，并预先固定了权利要求2中所述引物组，并设置阴性质控和阳性质控。

6.权利要求5所述的检测芯片，其特征在于，阴性质控使用TE作为模板扩增，阳性质控使用酵母DNA片段为模板扩增。

7.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述核酸扩增反应液包括如下试剂，反应扩增液各组分及浓度为：

序号试剂组分终浓度序号试剂组分终浓度 1 10×ThermoPol Buffer 1× 7 dTTP 0.2-1.5mmol/L 2 MgSO₄ 2-7mmol/L 9 Betaine 0.2-1mol/L 3 BSA 0.2-2mg/ml 10 dUTP 0.01-0.5mmol/L 4 dATP 0.2-3mmol/L 11 EvaGreen 1× 5 dGTP 0.2-3mmol/L 13 UNG 0.001U/μL 6 dCTP 0.2-1.5mmol/L 14 Bst polymerase 0.25-0.5U/μL

所述组分中每微升含8-16个活性单位的Bst DNA聚合酶。

所述试剂盒还包括阴性及阳性质控模板，所述阴性质控模板为TE缓冲液；所述阳性质控模板为酵母菌基因组DNA

8.一种使用权利要求1所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，检测方法按照以下步骤进行：

1)样品处理和模板提取，样品范围适用于耐药致病菌样品标本；取1mL待检菌液加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL超纯水，12000rpm离心2min后，弃上清对菌液进行清洗，在离心管中加入200μL超纯水充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板；

2)固定引物，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合，取0.296μL混合引物和超纯水0.545μL及0.159μL 1％固定液混合，将引物固定在芯片上；

3)阳性质控品，取0.545μl1×10⁵酵母DNA，0.159μL1％固定液和0.296μl引物混合之后，点在相应位置；

4)耐药基因IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA的核酸等温扩增，取48μL扩增反应液与12μL超纯水，加入60μL待检模板，形成如下总体积为120μL的反应体系，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入芯片，将芯片放入ichip-400四通道芯片恒温扩增核酸分析仪中，温度65℃进行反应，时间60min；反应体系组分及浓度如下，反应总体积120μL：

5)核酸等温扩增反应产物的检测；

检测：与阴性质控孔比较，检测孔在iChip-400四通道芯片恒温扩增核酸分析仪设备上有S形曲线判定为阳性。在iChip-400四通道芯片恒温扩增核酸分析仪设备上未见S形曲线为阴性。