CN102242210A - 环介导等温扩增超级细菌ndm-1基因的引物及检测超级细菌ndm-1基因的试剂盒及检测方法 - Google Patents
环介导等温扩增超级细菌ndm-1基因的引物及检测超级细菌ndm-1基因的试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细菌基因检测技术领域环介导等温扩增超级细菌NDM-1基因的引物，由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒，包括若干个装有反应液的LAMP反应管，反应液中含有2×等温反应缓冲液、BstDNA聚合酶、内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB，灭菌双蒸水。用试剂盒检测超级细菌NDM-1基因的检测方法。解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷；具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于现场快速检测的优点。
Description
技术领域
本发明属于细菌基因检测技术领域，特别涉及环介导等温扩增超级细菌NDM-1基因的引物，还涉及一种用环介导等温扩增方法检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒，还涉及用环介导等温扩增方法检测超级细菌NDM-1基因的检测方法。
背景技术
超级细菌，是一类耐药细菌的统称，包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA、耐万古霉素的粪肠球菌VRE、碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，碳青霉烯耐药其它肠杆菌科细菌等。
最近引起世界关注的超级病菌NDM-1是一种新型的超级细菌(全称为New Delhi metallo-β-lactamase-1，即新德里金属β-内酰胺酶1)可以抵御几乎所有抗生素，NDM-1编码一种新的耐药酶，称为NDM-1金属β-内酰胺酶。含NDM-1基因的肠杆菌科细菌已威胁人类的健康，并对各种抗生素不敏感，给临床治疗带来了巨大挑战。
对于携带NDM-1基因的超级细菌的实验室诊断主要基于PCR技术进行基因确证。如申请号为201010554690.7，名称为“一种抗生素耐药NDM-1基因的荧光检测试剂盒及检测方法”的中国发明专利申请，设计了一个荧光探针引物，降低了PCR扩增的假阳性率，但假阳性仍然存在，并且检测成本高，操作比较复杂，检测时间长，一般需要2-3小时，都影响到临床携带NDM-1基因的超级细菌的检测结果。
环介导等温扩增方法（LAMP）是近几年新兴的一种基因扩增方法，对仪器设备要求不高，只需要恒温水浴锅或金属浴即可，成本低，且临床上容易做到，检测时间较短，不超过1个小时，为快速、准确诊断基因的一种新方法。环介导等温扩增方法已经广泛应用于检测细菌领域，并有很多相关专利获得授权。目前国内外均未见使用LAMP方法检测新型超级细菌NDM-1基因的报道。
发明内容
为了解决PCR扩增易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，填补使用LAMP检测新型超级细菌NDM-1基因的空白，本发明提供了用环介导等温扩增超级细菌NDM-1基因的引物。本发明建立了一种新型超级细菌NDM-1基因LAMP检测方法，根据NDM-1基因保守区的6段序列设计了一对特异性内引物，一对特异性外引物和一对环引物。
本发明还提供了检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒。
本发明还提供了检测超级细菌NDM-1基因的检测方法。
本发明是通过以下措施实现的：
一种环介导等温扩增超级细菌NDM-1基因的引物，由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成，其核苷酸序列分别如下：
外引物F3：5’-GGCCACACCAGTGACAAT-3’，
外引物B3：5’-GCGGAATGGTCATCACGAT-3’，
内引物FIP：5’-ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3’，
内引物BIP：5’-CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3’，
环引物LF：5’-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3’，
环引物LB：5’-ACACTGAGCACTACGCCG-3’，
其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。
一种检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒，包括若干个装有反应液的LAMP反应管，
其中，每25 μL反应液中含有：12.5 μL 2×等温反应缓冲液、1.0 μL Bst DNA聚合酶、40 pmol内引物FIP、40 pmol内引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol环引物LF、20 pmol环引物LB，余量为灭菌双蒸水；
其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；
2×等温反应缓冲液中含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO4、20 mM （NH4）2SO4、0.2wt% Tween20、1.6 M 甜菜碱、2.8 mM dNTP。
所述的试剂盒，还包括1 μL钙黄绿素。
一种检测超级细菌NDM-1基因的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待检细菌基因组总DNA；
（2）使用所述的试剂盒进行检测，具体操作为：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有NDM-1基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：65℃水浴恒温反应35 min。
步骤（2）中待检细菌基因组DNA为含DNA的浓度为0.003-300 ng/μL的DNA溶液。
所述的检测方法，LAMP反应管中出现白色沉淀为阳性结果，不出现白色沉淀为阴性结果。
所述的检测方法，其特征是在扩增反应前的反应管中加入1 μL钙黄绿素，反应结束后扩增产物变为绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。
步骤（1）中提取待检细菌基因组DNA包括以下步骤：将待检的细菌菌株过夜培养后，取1 mL的菌液12000 rpm离心2 min，彻底弃上清，取沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA，最后溶于50 μL灭菌双蒸水中，测定DNA浓度为300 ng/μL左右，-20 ℃保存备用。
本发明的有益效果：
1、采用LAMP技术，特异性强，比PCR检测方法灵敏度更高，不需要昂贵的PCR仪器，只需要普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，通过肉眼观察白色沉淀产生或使用荧光染料显色肉眼直接观察即可判定结果，时间大大缩短，从普通PCR仪的2~3小时缩短到35 min左右，简单而快速，可广泛用于兽医及人医领域包括实验室及临床基层对携带NDM-1基因的超级细菌的快速检测；
2、解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷；
3、具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于现场快速检测的优点。
附图说明
图1为实施例2扩增得到的产物通过肉眼直接观察白色沉淀的检测结果，其中，1号管为阴性对照，2号管为阳性对照，3号管为检测管；
图2为实施例3中LAMP方法检测超级细菌NDM-1基因灵敏度肉眼直接观察白色沉淀的检测结果，其中1-7号管中加入的为倍比稀释的含超级细菌NDM-1基因的洛菲不动杆菌基因组DNA，8号管为阴性对照；
图3为实施例3中普通PCR方法检测超级细菌NDM-1基因灵敏度检测结果，其中1-7号 PCR反应模板为倍比稀释的含超级细菌NDM-1基因的洛菲不动杆菌基因组DNA，8号为阴性对照；
图4为实施例4中LAMP方法检测超级细菌NDM-1基因特异性检测结果，其中，1-4号管中加入的模板分别为大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的基因组DNA，5号管为阴性对照，6号管为阳性对照；
图5为实施例4中普通PCR方法检测超级细菌NDM-1基因特异性检测结果，其中，1-4号PCR反应模板分别为大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的基因组DNA，5号为阴性对照，6号为阳性对照。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
实施例1：制备检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒
设置检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒，该试剂盒包括装有反应液的LAMP反应管，
反应液以25 μL计，含有12.5 μL 2×等温反应缓冲液、1.0 μL Bst DNA聚合酶、40 pmol内引物FIP、40 pmol内引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol 环引物LF、20 pmol 环引物LB、余量为灭菌双蒸水；
其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；
2×等温反应缓冲液中含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO4、20 mM （NH4）2SO4、0.2wt% Tween20、1.6 M 甜菜碱、2.8 mM dNTP。
外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF、环引物LB的核苷酸序列如下：
外引物F3：5’-GGCCACACCAGTGACAAT-3’，
外引物B3：5’-GCGGAATGGTCATCACGAT-3’，
内引物FIP：5’-ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3’，
内引物BIP：5’-CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3’，
环引物LF：5’-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3’，
环引物LB：5’-ACACTGAGCACTACGCCG-3’，
其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。
为了设置对照组，每个试剂盒中最少设置三个LAMP反应管，此试剂盒设置六个LAMP反应管。
扩增产物的副产物焦磷酸离子与Mg2+反应会产生焦磷酸镁（白色沉淀）的衍生物，此衍生物与生成的扩增产物成正比，由于LAMP法能产生大量的扩增产物，衍生物产量也会大增，于是可以呈现出肉眼可见的白色沉淀，可验证是否有靶基因的存在。
为了更明显的观察扩增结果，试剂盒中设置有荧光染料钙黄绿素（螯合剂），与试剂中的锰离子（Mn2+）结合处于淬灭状态，扩增产物的副产物焦磷酸离子与Mn2+结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。因此便于根据扩增产物颜色变化来判断扩增结果。
实施例2：用环介导等温扩增方法检测超级细菌NDM-1基因的检测方法
（1）提取待检临床菌株的基因组总DNA：将待检的临床菌株过夜培养后，取1 mL的菌液12000 rpm离心2 min，彻底弃上清，取沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取细菌基因组总DNA，最后溶于50 μL灭菌双蒸水中，测定DNA浓度为300 ng/μL，-20 ℃保存备用。
（2）LAMP扩增：使用实施例1中的试剂盒，设置两套反应体系，其中一套加入荧光染料，另一套不加入。每套体系中都设置一个检测管、一个阳性对照管和一个阴性对照管。在检测管内加入2 μL待检DNA样本，阳性对照管中加入2 μL 含NDM-1基因的洛菲不动杆菌基因组DNA（DNA浓度也为300 ng/μL），阴性对照管中加入2 μL灭菌双蒸水。加完后混匀，稍离心，使沾在管壁上的样品也溶解在反应液中。将反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：65℃水浴恒温反应35 min。
（3）结果分析：
①在加入荧光染料反应体系的反应管中观察反应后的混合液颜色，阳性对照管变为绿色，阴性对照管中为橙色，检测管中为绿色，说明待检细菌中含有超级细菌NDM-1基因，因图片处理成黑白之后，颜色对比完全看不出来，所以相应的图没有附上；
②在不加荧光染料的反应体系中，阳性对照管中出现白色沉淀，阴性对照管中未出现白色沉淀，检测管中出现白色沉淀，说明待检细菌中含有超级细菌NDM-1基因，如图1所示。
实施例3：超级细菌NDM-1基因LAMP检测方法与普通PCR方法检测灵敏度比较
取含NDM-1基因的超级细菌洛菲不动杆菌基因组DNA（浓度为300 ng/μL），按10倍比稀释，分别为原液的1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，分别取1 μL作为LAMP反应和PCR反应的模板，以灭菌双蒸水为阴性对照。在7个LAMP反应管和7个PCR反应管中分别加入以上倍比稀释的含NDM-1基因的细菌基因组DNA 1 μL，第8管中分别加入灭菌双蒸水1 μL。
其中LAMP反应管置于65℃恒温水浴锅中反应35 min，反应结束后直接用肉眼观察白色沉淀产生与否。
PCR反应中所用引物为根据NCBI上已知的NDM-1基因保守序列用Primer5.0软件设计，按以下碱基序列经DNA合成仪合成。
上游引物为N-1-up：5’-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3’，
下游引物为N-1-down：5’- CGCAACACAGCCTGACTTTC-3’，
扩增目的片段大小为287 bp。PCR反应体系设置为：总体积25 μL，其中10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、10 μM上游引物N-1-up 0.5 μL、10 μM 下游引物N-1-down 0.5 μL、Taq DNA聚合酶 0.25 μL、模板 1 μL、灭菌双蒸水补齐25 μL。PCR产应条件为：95℃ 10 min，然后进行35 个循环，循环条件为95℃1 min，60℃45 s，72℃45 s，最后72℃ 延伸10 min，4℃ forever，反应时间是2.5 小时。反应结束后取PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
LAMP结果显示，不加荧光染料钙黄绿素的反应管1~6管内均出现白色沉淀，7~8管内无白色沉淀产生，如图2所示。加入荧光染料钙黄绿素的反应管内的液体颜色，1~6管内颜色均为明显的绿色，7~8管内颜色均为橙色。说明原液稀释10-5还可以检测到超级细菌NDM-1基因。因图片处理成黑白之后，颜色对比完全看不出来，所以相应的图没有附上。
PCR产物经电泳检测显示：反应管1~4均出现目的条带，且条带越来越淡，而5~8未出现目的条带。说明原液稀释10-3可以检测到超级细菌NDM-1基因，如图3所示。
综合LAMP和PCR反应结果可以得出，LAMP反应灵敏度比PCR反应要高2个数量级（至少100倍），且反应时间比PCR缩短1.5~2个小时，不需要用凝胶电泳检测，直接通过肉眼观察白色沉淀或加入染料显色即可判定结果。
实施例4：超级细菌NDM-1基因LAMP检测方法和普通PCR方法特异性比较
选择大肠杆菌（ATCC 25922），沙门氏菌（ATCC 50035），金黄色葡萄球菌（ATCC 29213），铜绿假单胞菌（ATCC 27853）作为试验菌株，分别提取基因组DNA，按照实施例2中所建立的超级细菌NDM-1基因环介导等温扩增检测方法进行检测；同时以大肠杆菌（ATCC 25922），沙门氏菌（ATCC 50035），金黄色葡萄球菌（ATCC 29213），铜绿假单胞菌（ATCC 27853）的基因组DNA为模板按照实施例3的PCR反应体系和检测程序进行PCR扩增；都以洛菲不动杆菌（含NDM-1基因）基因组DNA作为阳性对照，灭菌双蒸水作为阴性对照，验证本发明所建立的LAMP方法的特异性。
LAMP结果只有阳性对照管出现白色沉淀，如图4所示，PCR结果也显示只有阳性对照管经电泳检测有NDM-1基因特异性目的条带，如图5所示，其余试验菌株均为阴性结果。说明本发明所建立的LAMP方法检测超级细菌NDM-1基因特异性好，与PCR方法一致性达100%，由于LAMP方法更加直观简便，且耗时短，因此更加适合临床快速检测的需要。
<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>环介导等温扩增超级细菌NDM-1基因的引物及检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒及检测方法
<140>201110190462.0
<141>2011-7-8
<160>6
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<440>1
GGCCACACCA GTGACAAT 18
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<440>2
GCGGAATGGT CATCACGAT 19
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<440>3
ACTTGGCCTT GCTGTCCTTG ATGTTGGGAT CGACGGCAC 39
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成
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<223>
<440>4
CGCTCGGCAA TCTCGGTGAT GCTGGCCTTG GGGAACGC 38
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<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
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<223>
<440>5
GCTGTAGCGA AAACCACCG 19
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<440>6
ACACTGAGCA CTACGCCG 18
Claims (7)
1.一种环介导等温扩增超级细菌NDM-1基因的引物，其特征是由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成，其核苷酸序列分别如下：
外引物F3：5’-GGCCACACCAGTGACAAT-3’，
外引物B3：5’-GCGGAATGGTCATCACGAT-3’，
内引物FIP：5’-ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3’，
内引物BIP：5’-CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3’，
环引物LF：5’-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3’，
环引物LB：5’-ACACTGAGCACTACGCCG-3’，
其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。
2.一种检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒，其特征是包括若干个装有反应液的LAMP反应管，
其中，每25 μL反应液中含有：12.5 μL 2×等温反应缓冲液、1.0 μL Bst DNA聚合酶、40 pmol内引物FIP、40 pmol内引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol环引物LF、20 pmol环引物LB，余量为灭菌双蒸水；
其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；
2×等温反应缓冲液中含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO4、20 mM （NH4）2SO4、0.2wt% Tween20、1.6 M 甜菜碱、2.8 mM dNTP。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括1 μL钙黄绿素。
4.一种检测超级细菌NDM-1基因的检测方法，其特征是包括以下步骤：
（1）提取待检细菌基因组总DNA；
（2）使用权利要求2或3所述的试剂盒进行检测，具体操作为：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有NDM-1基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：65℃水浴恒温反应35 min。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是步骤（2）中待检细菌基因组DNA为含DNA的浓度为0.003-300 ng/μL的DNA溶液。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是LAMP反应管中出现白色沉淀为阳性结果，不出现白色沉淀为阴性结果。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是在扩增反应前的反应管中加入1 μL钙黄绿素，反应结束后扩增产物变为绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。
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