CN104789659A - 16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法。本发明的检测引物由一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个环引物L组成。检测试剂盒包括若干个装有反应液的LAMP反应管，反应液中含有2×等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、引物等。检测方法为：首先提取待检细菌基因组的DNA，加入LAMP反应管的反应液内，63℃水浴恒温反应45-60min，根据有无白色沉淀或者反应液加入钙黄绿素后是否变绿判定结果。本发明解决了现有PCR技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷；具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作简单，适于现场快速检测的优点。
Description
技术领域
本发明属于细菌基因检测技术领域，特别涉及氨基糖苷类抗生素耐药基因16s rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
16S rRNA甲基化酶是2003年报道的一种新耐药决定因子，介导细菌对多种氨基糖苷类高水平耐药，最初发现于肠杆菌科中，目前在革兰氏阴性菌中已发现至少由12种等位基因编码的10种16S rRNA甲基化酶。该类耐药决定因子的作用机制独特，能够以S-腺苷甲硫氨酸分子为甲基供体，对核糖体RNA进行转录后甲基化，使氨基糖苷类不能与其作用靶点相接合，从而导致多种革兰氏阴性杆菌同时对阿米卡星、庆大霉素等多种临床常用氨基糖苷类药物高度耐药。目前已从多个国家和地区及多种临床革兰氏阴性杆菌中检测到编码RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、RmtE、RmtF、RmtG、RmtH、ArmA及NpmA等16S rRNA甲基化酶的耐药基因及其等位基因。由于大多编码16S rRNA甲基化酶的基因常位于可移动的遗传因子如接合型质粒、整合子、转座子、插入序列共同区上，易引起耐药性和耐药基因的传播，因而导致临床抗感染治疗的失败。
RmtB广泛存在于黏质沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等临床菌中，且在来源于日本、中国台湾、韩国、墨西哥、希腊、中国、比利时、埃及、美国、巴西等国家和地区的多种菌株中均有相关报道。
对于携带氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB，它的实验室诊断主要基于PCR技术进行确证。PCR方法容易产生假阳性，并且检测成本高，操作比较复杂，检测时间长(一般需要2-3小时)，这些都影响了临床携带rmtB基因的检测结果。
环介导等温扩增方法(LAMP)是近几年新兴的一种基因扩增方法，对仪器设备要求不高，只需要恒温水浴锅或金属浴即可，成本低，且临床上容易做到，检测时间较短(不超过1个小时)，为快速、准确诊断基因的一种新方法。环介导等温扩增方法已经广泛应用于检测细菌领域，并有很多相关专利获得授权。目前国内外均未见使用LAMP方法检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB基因的报道。
发明内容
为了解决PCR扩增易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，填补使用LAMP检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的空白，本发明提供了16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法。
本发明是通过以下措施实现的：一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物，由一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个环引物L组成，其核苷酸序列分别如下：
外引物F3：5’-CGATGCCCTCACCTCCAT-3’(SEQ No.1)；
外引物B3：5’-GCCTTTTTTACATCGCCCG-3’(SEQ No.2)；
内引物FIP：5’-ATTCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3’(SEQ No.3)；
内引物BIP：5’-CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3’(SEQNo.4)；
环引物L：5’-GCTGCATGGAATTTGCGGGG-3’(SEQ No.5)。
其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物(F3或B3)与环引物的摩尔比为1:4。
本发明还公开了一种含有上述检测引物的LAMP检测试剂盒。
优选的，上述LAMP检测试剂盒，包括若干个(至少3个)装有反应液的LAMP反应管，其中，每25μL反应液中含有：12.5μL 2×等温反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶、40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物L、待检细菌基因组DNA若干(一般为1-2μL)，余量为灭菌双蒸水；
其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；
2×等温反应缓冲液中含有40mM pH为8.8的Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2wt％Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。
进一步，上述25μL反应液中还含有1μL的钙黄绿素。
本发明还公开了采用上述引物16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是，
(1)提取待检细菌基因组的DNA；
(2)使用上述的检测试剂盒进行检测，具体操作为：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有rmtB基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应45-60min；
(3)结果判断：反应结束后，凭借肉眼可见的白色沉淀判定结果，有白色沉淀为阳性，清亮为阴性；或在扩增反应前的反应管中加入1μL钙黄绿素，反应结束后，凭借反应液的颜色判定结果，绿色的为阳性，仍保持橙色的为阴性。
其中，步骤(1)中提取待检细菌基因组DNA包括以下步骤：将待检的细菌菌株过夜培养后，取1mL的菌液12000rpm离心2min，彻底弃上清，取沉淀加入1mL无菌双蒸水，沸水浴10min，12000rpm离心2min，取上清至新离心管中，测定并调整DNA浓度为300-500ng/μL，-20℃保存备用。
本发明的有益效果：
1、采用LAMP技术，特异性强，比PCR检测方法灵敏度更高，不需要昂贵的PCR仪器，只需要普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，时间大大缩短，从普通PCR仪的2～3小时缩短到1小时之内，简单而快速，可广泛用于兽医及人医领域包括实验室及临床基层对携带rmtB基因的氨基糖苷类耐药细菌的快速检测；
2、解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷；
3、具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于现场快速检测的优点。
附图说明
图1为实施例2扩增得到的产物通过肉眼直接观察的检测结果，其中，1号管为阴性对照，2号管为阳性对照，3号管为检测管；1号管保持橙色不变为阴性，2号管变为绿色为阳性，3号管变为绿色为阳性；
图2为实施例3中LAMP方法检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的灵敏度肉眼直接观察结果，其中1-9号管中加入的为倍比稀释的含rmtB基因的大肠杆菌基因组DNA，1～9分别为：500ng/μL、50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、5*10-2ng/μL、5*10-3ng/μL、5*10-4ng/μL、5*10-5ng/μL、5*10-6ng/μL；结果显示，1-8号管变为绿色，为阳性，9号管保持橙色不变为阴性；
图3为实施例3中普通PCR方法检测rmtB基因灵敏度检测结果，其中1-9号PCR反应模板为倍比稀释的含rmtB基因的大肠杆菌基因组DNA，1～9分别为：500ng/μL、50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、5*10-2ng/μL、5*10-3ng/μL、5*10-4ng/μL、5*10-5ng/μL、5*10-6ng/μL；M：DL2000；结果显示，1-6号管能扩增到目的大小条带，为阳性，7-9号管没有扩增到肉眼可见的目的条带，为阴性；
图4为实施例4中LAMP方法检测rmtB基因特异性检测结果，其中，1-8号管中加入的模板分别为阳性对照、阴性对照、大肠杆菌(ATCC 25922，rmtB阴性)、沙门氏菌(ATCC 50035，rmtB阴性)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213，rmtB阴性)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923，rmtB阴性)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853，rmtB阴性)、肺炎双球菌(ATCC 49619，rmtB阴性)；检测结果只有阳性对照变为绿色，其他均为阴性；
图5为实施例4中普通PCR方法检测rmtB基因特异性检测结果，其中，1-8号管中加入的模板分别为阳性对照、阴性对照、大肠杆菌(ATCC 25922，rmtB阴性)、沙门氏菌(ATCC50035，rmtB阴性)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213，rmtB阴性)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923，rmtB阴性)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853，rmtB阴性)、肺炎双球菌(ATCC 49619，rmtB阴性)；M：DL 2000；结果大肠杆菌(ATCC 25922，rmtB阴性)和肺炎双球菌(ATCC49619，rmtB阴性)出现假阳性。
具体实施方式
实施例1：制备检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的试剂盒
(1)检测引物的设计
根据NCBI上已知的rmtB基因保守序列，采用Primer5.0软件分别设计一对特异性内引物FIP、BIP，一对特异性外引物F3、B3，以及环引物L，用以对氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测：
外引物F3：5’-CGATGCCCTCACCTCCAT-3’(SEQ No.1)；
外引物B3：5’-GCCTTTTTTACATCGCCCG-3’(SEQ No.2)；
内引物FIP：5’-ATTCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3’(SEQ No.3)；
内引物BIP：5’-CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3’(SEQNo.4)；
环引物L：5’-GCTGCATGGAATTTGCGGGG-3’(SEQ No.5)。
(2)检测试剂盒
设置检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的试剂盒，该试剂盒包括装有反应液的LAMP反应管，
反应液以25μL计，含有12.5μL 2×等温反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶、40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物L、1.0μL钙黄绿素、待检细菌基因组DNA若干、余量为灭菌双蒸水；
其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；
2×等温反应缓冲液中含有40mM pH为8.8的Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2wt％Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。
其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。
为了设置对照组，每个试剂盒中最少设置3个LAMP反应管，此试剂盒设置6个LAMP反应管。
扩增产物的副产物焦磷酸离子与Mg2+反应会产生焦磷酸镁(白色沉淀)的衍生物，此衍生物与生成的扩增产物成正比，由于LAMP法能产生大量的扩增产物，衍生物产量也会大增，于是可以呈现出肉眼可见的白色沉淀，可验证是否有靶基因的存在。为了更加直观的判断结果，在反应液中还加入钙黄绿素(锰离子螯合型)，与试剂中的锰离子(Mn2+)结合处于淬灭状态，焦磷酸离子与Mn2+结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。因此便于根据扩增产物颜色变化来判断扩增结果。
实施例2：用环介导等温扩增方法检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的检测方法
(1)提取待检临床菌株的基因组DNA
将待检的临床菌株过夜培养后，取1mL的菌液12000rpm离心2min，彻底弃上清，取沉淀加入1mL无菌双蒸水，沸水浴10min，12000rpm离心2min，取上清至新离心管中，测定并调整DNA浓度为500ng/μL，-20℃保存备用。
(2)LAMP扩增
使用实施例1中的试剂盒，设置一个检测管、一个阳性对照管和一个阴性对照管。在检测管内加入2μL待检DNA样本，阳性对照管中加入2μL含rmtB基因的大肠杆菌基因组DNA(DNA浓度为100ng/μL)，阴性对照管中加入2μL灭菌双蒸水。加完后混匀，稍离心，使沾在管壁上的样品也溶解在反应液中。将反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应45-60min。
(3)结果分析：
①观察反应后的混合液颜色，阳性对照管变为绿色，阴性对照管中为橙色，检测管中为绿色，说明待检细菌中含有rmtB基因，如图1所示。
实施例3：rmtB基因LAMP检测方法与普通PCR方法检测灵敏度比较
取含rmtB基因的大肠杆菌基因组DNA(浓度为500ng/μL)，按10倍比稀释，分别为原液的10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8倍，分别取1μL作为LAMP反应和PCR反应的模板。在LAMP反应管和PCR反应管中分别加入以上倍比稀释的含rmtB基因的细菌基因组DNA 1μL。
其中LAMP反应管置于63℃恒温水浴锅中反应45-60min，反应结束后直接用肉眼观察颜色变化。
PCR反应中所用引物为根据NCBI上已知的rmtB基因保守序列用Primer5.0软件设计，按以下碱基序列经DNA合成仪合成：
上游引物为up：5’-ATATGTCACCCCGGAATCGC-3’(SEQ No.6)，
下游引物为down：5’-CATCCTGCAGGGCAAAGGTA-3’(SEQ No.7)。
扩增目的片段大小为308bp。PCR反应体系设置为：总体积25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP 0.5μL、10μM上游引物up 0.5μL、10μM下游引物down 0.5μL、Taq DNA聚合酶0.25μL、模板1μL、灭菌双蒸水补齐25μL。PCR产应条件为：95℃2min，然后进行30个循环，循环条件为94℃30s，58℃30s，72℃30s，最后72℃延伸2min。反应结束后取8μL PCR产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，根据是否扩增目的条带判定阳性和阴性。
LAMP结果如图2所示。加入钙黄绿素的反应管内的液体颜色，1～8管内颜色均为明显的绿色，9管内颜色为橙色。说明原液稀释10-7(5*10-5ng/μL)还可以检测到rmtB基因。
PCR产物经电泳检测结果如图3所示。反应管1～6均出现目的条带，且条带越来越淡，而7～9未出现目的条带。说明原液稀释10-5可以检测到rmtB基因。
综合LAMP和PCR反应结果可以得出，LAMP反应灵敏度比PCR反应要高2个数量级(100倍)，反应时间比PCR短，且不需要用凝胶电泳检测，直接通过肉眼观察即可判定结果。
实施例4：rmtB基因LAMP检测方法和普通PCR方法特异性比较
选择大肠杆菌(ATCC 25922)，沙门氏菌(ATCC 50035)，金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)，铜绿假单胞菌(ATCC 27853)和肺炎双球菌(ATCC 49619)作为试验菌株，分别提取基因组DNA，按照实施例2中所建立的rmtB基因环介导等温扩增检测方法进行检测；同时以以上基因组DNA为模板按照实施例3的PCR反应体系和检测程序进行PCR扩增；都以大肠杆菌(含rmtB基因)基因组DNA作为阳性对照，灭菌双蒸水作为阴性对照，验证本发明所建立的LAMP方法的特异性。
LAMP结果只有阳性对照管变为绿色，如图4所示，PCR结果显示有2例出现假阳性，说明本发明所建立的LAMP方法检测rmtB基因比PCR方法特异性好。由于LAMP方法更加直观简便，且耗时短，因此更加适合临床快速检测的需要。
Claims (10)
1.一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物，其特征是，由一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个环引物L组成，其核苷酸序列分别如下：
外引物F3：5’-CGATGCCCTCACCTCCAT-3’；
外引物B3：5’-GCCTTTTTTACATCGCCCG-3’；
内引物FIP：5’-ATTCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3’；
内引物BIP：5’-CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3’；
环引物L：5’-GCTGCATGGAATTTGCGGGG-3’。
2.一种含有权利要求1所述引物的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。
4.如权利要求2所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，它包括若干个装有反应液的LAMP反应管，其中，每25μL反应液中含有：12.5μL 2×等温反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶、40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物L、待检细菌基因组DNA若干，余量为灭菌双蒸水。
5.如权利要求4所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述2×等温反应缓冲液中含有40mM pH为8.8的Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2wt％Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。
6.如权利要求5所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL。
7.如权利要求5或6所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述25μL反应液中还含有1μL的钙黄绿素。
8.一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是，
(1)提取待检细菌基因组的DNA；
(2)使用权利要求6所述的LAMP检测试剂盒进行检测：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有rmtB基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应45-60min；
(3)结果判断：反应结束后，凭借肉眼可见的白色沉淀判定结果，有白色沉淀为阳性，清亮为阴性。
9.一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是，
(1)提取待检细菌基因组的DNA；
(2)使用权利要求7所述的LAMP检测试剂盒进行检测：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有rmtB基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应45-60min；
(3)结果判断：反应结束后，凭借反应液的颜色判定结果，绿色的为阳性，仍保持橙色的为阴性。
10.如权利要求8或9所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是，所述步骤(1)提取待检细菌基因组DNA包括以下步骤：将待检的细菌菌株过夜培养后，取1mL的菌液12000rpm离心2min，彻底弃上清，取沉淀加入1mL无菌双蒸水，沸水浴10min，12000rpm离心2min，取上清至新离心管中，测定并调整DNA浓度为300-500ng/μL，-20℃保存备用。
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