CN102230019A - 环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物及检测多重耐药cfr基因的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细菌基因检测技术领域环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物，包括一对外引物，一对内引物和一个环引物，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。检测多重耐药cfr基因的试剂盒，包括若干个装有反应液的LAMP反应管，反应液中含有等温反应缓冲液、BstDNA聚合酶、内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、环引物L和灭菌双蒸水。一种检测多重耐药cfr基因的检测方法，提取待检细菌基因组DNA；使用所述的试剂盒进行检测，扩增条件为：63℃水浴恒温反应35min。本发明采用LAMP技术，特异性强，比PCR检测方法灵敏度更高，时间大大缩短，简单而快速。

Description

环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物及检测多重耐药cfr基因的试剂盒及检测方法

技术领域    

本发明属于细菌基因检测技术领域，特别涉及环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物，还涉及一种用环介导等温扩增方法检测多重耐药cfr基因的试剂盒，还涉及用环介导等温扩增方法检测多重耐药cfr基因的检测方法。

背景技术   

近年来由于广谱抗生素的广泛应用和不合理使用，使得细菌的耐药性愈来愈强，出现了大量的多重耐药菌株（MDRO）。目前常见的包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的细菌（如大肠杆菌、克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌等）和多重耐药的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等。这些耐药菌株分布广，传播快，容易产生暴发流行，对临床普遍使用的多种抗菌药物耐药，给临床治疗及医院感染控制带来困难。

Cfr基因是从革兰氏阳性菌发现的第一个可介导氯霉素、氟苯尼考耐药的23S rRNA甲基化酶，具有多耐药的表型，可同时介导对氯霉素，林可霉胺类，恶唑烷酮类，链阳菌素A和截短侧耳素类等五类药物的耐药，因此具有cfr基因的细菌有着明显的进化优势。Cfr基因合成的蛋白质在细菌耐抗生素机制中发挥重要作用，它能很容易从非人类病原体传播给其他能感染人的细菌类型，可感染多种耐抗生素细菌。

对于具有cfr基因多重耐药菌的实验室诊断主要基于抗药性表型检测和PCR技术进行基因确证。但由于PCR具有易出现假阳性，检测成本高，操作比较复杂，且检测时间长，一般需要2~3小时，影响到临床携带多重耐药cfr基因的检测结果。

发明内容   

为了解决PCR扩增易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，填补使用LAMP检测多重耐药cfr基因的空白，本发明提供了用环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物。本发明建立了一种多重耐药cfr基因LAMP检测方法，根据多重耐药cfr基因保守区的6段序列设计了一对特异性内引物，一对特异性外引物和一个环引物。

本发明还提供了检测多重耐药cfr基因的试剂盒。

本发明还提供了检测多重耐药cfr基因的检测方法。

本发明是通过以下措施实现的：

一种环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物，包括一对外引物，一对内引物和一个环引物，引物核苷酸序列如下：

外引物F3：5’-TCTTGAGCATGCAAACGA-3’，

外引物B3：5’-TCAATATCAATCCCAAATTGACT-3’，

内引物FIP：5’-TGCACTTATTGTAGGATTGTATCGTGTTGTTAGCCTTCTTAAAAGTCG-3’，

内引物BIP：5’-CCTGAGATGTATGGAGAAGCAAACAATTGTGACATGGATACCAGC-3’，

环引物L：5’-GAAGGGCAGGTAGAAGCCT-3’。

其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。

一种检测多重耐药cfr基因的试剂盒，包括若干个装有反应液的LAMP反应管， 

其中，每25 μL反应液中含有：12.5 μL 2×等温反应缓冲液、1.0 μL Bst DNA聚合酶、40 pmol内引物FIP、40 pmol内引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol 环引物L、余量为灭菌双蒸水；

其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；

2×等温反应缓冲液中含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO₄、20 mM （NH4）₂SO₄、0.2wt% Tween20、1.6 M甜菜碱、2.8 mM dNTP。

所述的试剂盒，还包括1 μL钙黄绿素。

一种检测多重耐药cfr基因的检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待检细菌基因组总DNA；

（2）使用所述的试剂盒进行检测，具体操作为：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有多重耐药cfr基因的松鼠葡萄球菌基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应35 min。

步骤（2）中待检细菌基因组DNA为含DNA的浓度为0.003-300 ng/μL的DNA溶液。

所述的检测方法，LAMP反应管中出现白色沉淀为阳性结果，不出现白色沉淀为阴性结果。

所述的检测方法，在扩增反应前的反应管中加入1 μL钙黄绿素，反应结束后扩增产物变为绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。

步骤（1）中提取待检细菌基因组DNA包括以下步骤：将待检的细菌菌株过夜培养后，取1 mL的菌液12000 rpm离心2 min，彻底弃上清，取沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA，最后溶于50 μL灭菌双蒸水中，-20 ℃保存备用。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用LAMP技术，特异性强，比PCR检测方法灵敏度更高，不需要昂贵的PCR仪器，只需要普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，通过肉眼观察白色沉淀产生或使用荧光染料显色肉眼直接观察即可判定结果，时间大大缩短，从普通PCR仪的2~3小时缩短为35 min左右，简单而快速，可广泛用于兽医及人医领域包括实验室及临床基层对携带cfr基因的多重耐药细菌的快速检测；

2、本方法中环介导等温扩增技术（LAMP）对仪器设备要求不高，临床上容易做到，检测时间较短，不超过1个小时，为快速，准确诊断cfr基因探索一种新方法，填补了国内外用于LAMP检测方法检测多重耐药cfr基因的空白。

附图说明   

图1为实施例2扩增得到的产物通过肉眼直接观察白色沉淀的检测结果，其中，1号管为阴性对照，2号管为阳性对照，3号管为检测管；

图2为实施例3中LAMP方法检测多重耐药cfr基因灵敏度肉眼直接观察白色沉淀的检测结果，其中1-7号管中加入的为倍比稀释的含多重耐药cfr基因的松鼠葡萄球菌基因组DNA，8号管为阴性对照；

图3为实施例3中普通PCR方法检测多重耐药cfr基因灵敏度检测结果，其中1-7号PCR模板为倍比稀释的含多重耐药cfr基因的松鼠葡萄球菌基因组DNA，8号为阴性对照；

图4为实施例4中LAMP方法检测多重耐药cfr基因特异性检测结果，1-8号管为检测到的阳性菌株结果，9号管为阴性菌株结果，10号管为阴性对照，11号管为阳性对照；

图5为实施例4中普通PCR方法检测多重耐药cfr基因特异性检测结果，1-8号为检测到的阳性菌株结果，9号为阴性菌株结果，10号为阴性对照，11号为阳性对照。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

实施例1：制备检测多重耐药cfr基因的试剂盒

设置检测多重耐药cfr基因的试剂盒，该试剂盒包括装有反应液的LAMP反应管，

反应液以25 μL计，含有12.5 μL 2×等温反应缓冲液、1.0 μL Bst DNA聚合酶、40 pmol内引物FIP、40 pmol内引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol 环引物L、余量为灭菌双蒸水；

其中，Bst DNA聚合酶的活度单位为8U/μL；

2×等温反应缓冲液中含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO₄、20 mM （NH4）₂SO₄、0.2wt% Tween20、1.6 M 甜菜碱、2.8 mM dNTP。

外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物L的核苷酸序列如下：

外引物F3：5’-TCTTGAGCATGCAAACGA-3’，

外引物B3：5’-TCAATATCAATCCCAAATTGACT-3’，

内引物FIP：5’-TGCACTTATTGTAGGATTGTATCGTGTTGTTAGCCTTCTTAAAAGTCG-3’，

内引物BIP：5’-CCTGAGATGTATGGAGAAGCAAACAATTGTGACATGGATACCAGC-3’，

环引物L：5’-GAAGGGCAGGTAGAAGCCT-3’。

其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。

为了设置对照组，每个试剂盒中最少设置三个LAMP反应管，此试剂盒设置六个LAMP反应管。

扩增产物的副产物焦磷酸离子与Mg²⁺反应会产生焦磷酸镁（白色沉淀）的衍生物，此衍生物与生成的扩增产物成正比，由于LAMP法能产生大量的扩增产物，衍生物产量也会大增，于是可以呈现出肉眼可见的白色沉淀，可验证是否有靶基因的存在。

为了更明显的观察扩增结果，试剂盒中设置有荧光染料钙黄绿素（螯合剂），与试剂中的锰离子（Mn²⁺）结合处于淬灭状态，扩增产物的副产物焦磷酸离子与Mn²⁺结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。因此便于根据扩增产物颜色变化来判断扩增结果。

实施例2：用环介导等温扩增方法检测多重耐药cfr基因的检测方法

（1）提取待检临床菌株的基因组总DNA：将待检的临床菌株过夜培养后，取1 mL的菌液12000 rpm离心2 min，彻底弃上清，取沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取细菌基因组总DNA，最后溶于50 μL灭菌双蒸水中，测定DNA浓度为300 ng/μL，-20 ℃保存备用。

（2）LAMP扩增：使用实施例1中的试剂盒，设置两套反应体系，其中一套加入荧光染料，另一套不加入。每套体系中都设置检测管、一个阳性对照管和一个阴性对照管。在检测管内加入2 μL待检DNA样本，阳性对照管中加入2 μL含cfr基因的松鼠葡萄球菌基因组DNA，阴性对照管中加入2 μL灭菌双蒸水。加完后混匀，稍离心，使沾在管壁上的样品也溶解在反应液中。将反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应35 min。

（3）结果分析：

①在加入荧光染料反应体系的反应管中观察反应后的混合液颜色，阳性对照管变为绿色，阴性对照管中为橙色，检测管中为绿色，说明待检细菌中含有多重耐药cfr基因，因图片处理成黑白之后，颜色对比完全看不出来，所以相应的图没有附上；

②在不加荧光染料的反应体系中，阳性对照管中出现白色沉淀，阴性对照管中未出现白色沉淀，检测管中出现白色沉淀，如图1所示，说明待检细菌中含有多重耐药cfr基因。

实施例3：多重耐药cfr基因LAMP检测方法和普通PCR方法检测灵敏度比较

取含cfr基因的松鼠葡萄球菌细菌基因组DNA（浓度为300 ng/μL），按10倍比稀释，分别为原液的1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，分别取1 μL作为LAMP反应和PCR反应的模板，以灭菌双蒸水为阴性对照。即LAMP反应和PCR反应中的1~7管分别加入以上倍比稀释的含cfr基因的细菌基因组DNA 1 μL，第8管加入灭菌双蒸水1 μL。

其中LAMP反应置于63℃恒温水浴锅中反应35 min，反应结束后未加荧光染料钙黄绿素的反应管直接用肉眼观察白色沉淀产生与否，加入荧光染料钙黄绿素的反应管观察颜色变化。

PCR反应中所用引物为根据NCBI上已知的cfr基因保守序列用Primer5.0软件设计，按以下碱基序列经DNA合成仪合成。

上游引物为cfr-F：5’-CGATTTGAGGATATGAAGGTTCT-3’，

下游引物为cfr-R：5’-AAATTAGGATCCGTAAACGAAT-3’，

扩增目的片段为416 bp。PCR反应体系设置为：总体积25 μL，其中10×PCR缓冲液 2.5 μL、dNTP 0.5 μL、10 μM cfr-F 0.5 μL、10 μM cfr-R 0.5 μL、Taq DNA聚合酶 0.25 μL、模板1 μL，灭菌双蒸水补齐25 μL。PCR产应条件为：95℃ 10 min，然后进行32个循环，循环条件为94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，最后72℃ 延伸10 min，4℃ forever，反应时间是2 h7 min。反应结束后取PCR产物进行1.3%的琼脂糖凝胶电泳检测。

LAMP结果显示，不加荧光染料钙黄绿素的反应管1~6管内均出现白色沉淀，7~8管内无白色沉淀产生，如图2所示。加入荧光染料钙黄绿素的反应管内的液体颜色，1~6管内颜色均为明显的绿色，7~8管内颜色均为橙色。因图片处理成黑白之后，颜色对比完全看不出来，所以相应的图没有附上。结果说明原液稀释10^-5还可以检测到多重耐药cfr基因。

PCR产物经电泳检测显示：反应管1~4均出现目的条带，且条带越来越淡，而5~8未出现目的条带。说明原液稀释10^-3可以检测到多重耐药cfr基因，如图3所示。

综合LAMP和PCR反应结果可以得出，LAMP反应灵敏度比PCR反应要高2个数量级（至少100倍），且反应时间比PCR缩短1~1.5 小时，不需要用凝胶电泳检测，直接通过肉眼观察白色沉淀或加入染料显色即可判定结果。

实施例4：多重耐药cfr基因LAMP检测方法和普通PCR方法特异性比较

将临床分离的50株猪源葡萄球菌分别提取基因组DNA，按照本发明所建立的多重耐药cfr基因环介导等温扩增检测方法进行检测，同时以实施例3的PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，以猪源松鼠葡萄球菌（含cfr基因）基因组DNA作为阳性对照，灭菌双蒸水作为阴性对照，检测提取的50份猪源葡萄球菌基因组DNA，验证本发明所建立的LAMP方法的特异性。

结果阳性对照和阴性对照均正常，LAMP结果中有8株检测到cfr阳性，PCR结果也检测到相同的8株出现cfr特异性条带，其余均为阴性结果。LAMP检测部分结果和PCR检测部分对应结果分别如图4和图5所示。说明本发明所建立的LAMP方法检测多重耐药cfr基因特异性好，与PCR方法一致性达100%，由于LAMP方法更加直观简便，且耗时短，因此更加适合临床快速检测的需要。

<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物及检测多重耐药cfr基因的试剂盒及检测方法

<140>201110190471.X

<141>2011-7-8

<160>5

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<440>1

TCTTGAGCAT  GCAAACGA  18

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<440>2

TCAATATCAA  TCCCAAATTG  ACT  23

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<440>3

TGCACTTATT  GTAGGATTGT  ATCGTGTTGT  TAGCCTTCTT  AAAAGTCG  48

<210>4

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<440>4

CCTGAGATGT  ATGGAGAAGC  AAACAATTGT  GACATGGATA  CCAGC  45

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

<440>5

GAAGGGCAGG  TAGAAGCCT 19

Claims (7)

1.一种环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物，其特征在于包括一对外引物，一对内引物和一个环引物，引物核苷酸序列如下：

外引物F3：5’-TCTTGAGCATGCAAACGA-3’，

外引物B3：5’-TCAATATCAATCCCAAATTGACT-3’，

内引物FIP：5’-TGCACTTATTGTAGGATTGTATCGTGTTGTTAGCCTTCTTAAAAGTCG-3’，

内引物BIP：5’-CCTGAGATGTATGGAGAAGCAAACAATTGTGACATGGATACCAGC-3’，

环引物L：5’-GAAGGGCAGGTAGAAGCCT-3’，

其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。

2.一种检测多重耐药cfr基因的试剂盒，其特征是包括若干个装有反应液的LAMP反应管， 

其中，每25 μL反应液中含有：12.5 μL 2×等温反应缓冲液、1.0 μL Bst DNA聚合酶、40 pmol内引物FIP、40 pmol内引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol 环引物L、余量为灭菌双蒸水；其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；

2×等温反应缓冲液中含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO₄、20 mM （NH4）₂SO₄、0.2wt% Tween20、1.6 M甜菜碱、2.8 mM dNTP。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括1 μL钙黄绿素。

4.一种检测多重耐药cfr基因的检测方法，其特征是包括以下步骤：

（1）提取待检细菌基因组总DNA；

（2）使用权利要求2或3所述的试剂盒进行检测，具体操作为：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有多重耐药cfr基因的松鼠葡萄球菌基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应35 min。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是步骤（2）中待检细菌基因组DNA为含DNA的浓度为0.003-300 ng/μL的DNA溶液。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是LAMP反应管中出现白色沉淀为阳性结果，不出现白色沉淀为阴性结果。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是在扩增反应前的反应管中加入1 μL钙黄绿素，反应结束后扩增产物变为绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。

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